改变代谢活性的酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及突变型醇脱氢酶、包含其的微生物以及通过微生物发酵产生一种或多 种产物的方法。
【背景技术】
[0002] 通过微生物发酵生产醇（例如乙醇或丁醇）是众所周知的并且几个世纪以来已经 被用在工业上。从历史上看，乙醇发酵是最大的过程。丙酮-丁醇-乙醇（ABE)发酵被认为 是第二大发酵过程（Duerre P:Production of solvents. In:Handbook on Clostridia, CRC Press, 2005:671-696)，并且目前在例如中国的这些国家中的生产能力超过了 100万 吨（Ni Y and Sun Z:Recent progress on industrial fermentative production of acetone-butanol-ethanol by Clostridium acetobutylicum in China. Appl. Microbiol. Biotechnol. ,2009,83:415-423)。丁醇经常被用作溶剂或生物燃料，而丙酮被认为是不 需要的副产物（Duerre P:Production of solvents. In:Handbook on Clostridia, CRC Press, 2005:671-696)。已知拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii)的一些分离株由于 存在仲醇脱氢酶而产生异丙醇而非丙酮（George HA, Johnson JL，Moore WEC, Holdeman LV,Chen JS:Acetone, isopropanol, and butanol production by Clostridium beijerinckii(syn. Clostridium butylicum)and Clostridium aurantibutyricum. Appl Environ Microbiol 45:1160-1163)。异丙醇具有和丁醇类似的特性且其比丙酮更有益。但 是，这种还原不是非常有效，并且相应的拜氏梭菌菌株不能产生良好的效价且不被认为是 有用的生产菌株。
[0003] 近来，已经将丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum)进行代谢改造用于使用来自拜氏 梭菌的仲醇脱氢酶产生异丙醇（Leeet al，2012:Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC824for isopropanol-butanol-ethanol fermentation, Appl. Environ. Microbiol. 78:1416-1423)，但是需要高效的醇脱氢酶来优化该过程。
[0004] ABE发酵的挑战在于所有已知的生物都依赖于基于糖或淀粉的底物。很多适用于 产生化学产物（例如丙酮和异丙醇）的碳水化合物原料的成本受它们作为人类食物或动物 饲料的价值的影响，同时用于所述生产的产淀粉或蔗糖作物的栽培并非在所有地理条件下 都是经济上可持续的。因此，开发将更低成本和/或更丰富的碳源转化成有用的化学产物 (例如丙酮和异丙醇）的技术是非常有益的。
[0005] CO是有机材料（例如煤炭或油和油衍生产物）不完全燃烧的主要的免费的、 富含能量的副产物。例如，据报道，澳大利亚的钢铁工业每年生产并释放超过50万 吨CO到大气中。产乙酸的生物（例如紧密相关的微生物自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌（C. ljungdahlii)和拉氏梭菌（C. ragsdalei))能够以 含CO或含co2/h2的气体作为唯一能源或碳源进行化能自养生长，并且能够合成产物例 如乙酸盐、乙醇或2, 3-丁二醇，但是不能合成丙酮或异丙醇（Munasinghe PC, Khanal SK:Biomass-derived syngas fermentation into biofuels:Opportunities and challenges. Bioresource Technol 2010,5013-22)。
[0006] 最近，一项研究报道了拉氏梭菌（梭菌属菌株Pll)在IOOL中试规模发酵 罐中从柳枝稷（switchgrass)来源的合成气产生了异丙醇（Kundiyana DK, Huhnke RL, Wilkins MR:Syngas fermentation in a 100-L pilot scale fermentor:Design and process considerations. J Biosci Bioeng 2010,109:492-498)。但是，来自所述 同一实验室的相关研究显示，这是由所使用的合成气中的污染引起的，因为所述合成气通 过了含有 20% 丙酮的洗漆混合物（Ramachandriya KD:Effect of biomass generated producer gas, methane and physical parameters on producer gas fermentations by Clostridium strain Pll. Masters thesis, Oklahoma State University 2009 ； Ramachandriya KD, Wilkins MR, Delorme MJM, Zhu X, Kundiyana DK, Atiyeh HK, Huhnke RL:Reduction of acetone to isopropanol using producer gas fermenting microbes. Biofuels Environ Biotechnol, 2011, epub)。但是，作者确认拉氏梭菌（梭菌属菌株Pll) 可将丙酮还原为异丙醇并且推测存在仲醇脱氢酶，但没有找到任何证据。
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的一种或多种缺陷，或者至少为公众提供有用的选 择。
【发明内容】
[0008] 本发明人已经在自产乙醇梭菌中鉴定出新的伯醇：仲醇脱氢酶--该酶被用于例 如从CO产生异丙醇和/或一种或多种其他产物或用于将丙酮-丁醇-乙醇（ABE)发酵升 级为异丙醇-丙醇-乙醇（IBE)发酵或用于将MEK转化成2-丁醇，并且已经通过定点诱变 对该酶的特性（例如底物和/或辅因子特异性）进行了优化。
[0009] 在本发明的一个方面，提供了对至少一种第一底物比对至少一种第二底物具有更 强的特异性的醇脱氢酶，其中所述至少一种第一底物和所述至少一种第二底物选自：
[0010] 所述第一底物是丙酮且所述第二底物是MEK ;
[0011] 所述第一底物是丙酮且所述第二底物是乙醛；
[0012] 所述第一底物是丙酮且所述第二底物是乙偶姻；
[0013] 所述第一底物是MEK且所述第二底物是乙醛；
[0014] 所述第一底物是MEK且所述第二底物是乙偶姻；
[0015] 所述第一底物是乙偶姻且所述第二底物是丙酮；
[0016] 所述第一底物是乙偶姻且所述第二底物是MEK ;
[0017] 所述第一底物是乙偶姻且所述第二底物是乙醛；
[0018] 所述第一底物是乙醛且所述第二底物是丙酮；
[0019] 所述第一底物是乙醛且所述第二底物是乙偶姻；和
[0020] 所述第一底物是乙醛且所述第二底物是MEK ;并且
[0021] 其中和相应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含至少一个或多个突变。
[0022] 在一个实施方案中，所述醇脱氢酶对一种、两种或三种第一底物比对两种或三种 第二底物具有增强的特异性。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶对两种或三种第一底物 比对一种、两种或三种第二底物具有增强的特异性。
[0023] 在另一方面，本发明提供了对NADH辅因子比对NADPH辅因子具有增强的特异性的 醇脱氢酶，其中和相应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含至少一个或多个突变。
[0024] 在另一方面，本发明提供了使用NADH作为辅因子的醇脱氢酶，其中和相应的使用 NADPH作为辅因子的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含至少一个或多个突变。
[0025] 在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶对丙酮比对MEK和/或乙醛和/或乙偶姻 具有增强的特异性。
[0026] 在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶对MEK比对丙酮和/或乙醛和/或乙偶姻 具有增强的特异性。
[0027] 在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶对乙醛比对丙酮和/或MEK和/或乙偶姻 具有增强的特异性。
[0028] 在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶对乙偶姻比对丙酮和/或MEK和/或乙醛 具有增强的特异性。
[0029] 在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶基本没有使用乙偶姻作为底物的能力。在 一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶基本没有使用乙偶姻作为底物的能力，但是能够使用 丙酮、MEK和/或乙醛作为底物。
[0030] 在一个实施方案中，所述至少一个突变是在对应于SEQ ID 36的醇脱氢酶序列的 位置Glyl98、Serl99、Arg200、Pro201和Tyr218的氨基酸中的一个或其组合上的氨基酸置 换。
[0031] 在一个实施方案中，和所对应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含一个或 多个以下突变：Glyl98Asp、Glyl98Ile、Glyl98Leu、Glyl98Val、Serl99Asp、Serl99Glu、 Serl99Leu、Serl99Val、Arg200Glu、Pro201Asp、Pro201Glu、Tyr218Ala 和 Tyr218Phe。
[0032] 在另一个实施方案中，和所对应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含以下 突变中的一个：Tyr218Gly、Tyr218Ser 或 Tyr218Val。
[0033] 在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Serl99Asp置换。在一个实施方案中，所述 醇脱氢酶包含Serl99Glu置换。
[0034] 在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98Asp、Serl99Val、 Pr〇201Glu。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98ASp、S erl99Leu 和Pr〇201Glu。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Ala。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置 换的组合：Glyl98Asp、Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Phe。在另一个实施方案中，所述 醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98Asp、Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Gly。在另 一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98Asp、Serl99Val、Pr 〇201Glu 和Tyr218Ser。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu 和 Tyr218Val。
[0035] 在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Serl99Asp置换并且1)对丙酮比对MEK和 /或乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Serl99A Sp置换 并且对丙酮比对MEK和乙偶姻具有增强的底物特异性。
[0036] 在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser 199G1U置换并且1)对丙酮比对MEK、 乙醛和/或乙偶姻；和/或2)对MEK比对乙醛和/或乙偶姻具有增强的底物特异性。在一 个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Serl99Glu置换并且1)对丙酮比对MEK和乙醛以及乙偶 姻具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Serl99Glu置换并且 对MEK比对乙醛和乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含 Serl99Glu置换并且1)对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻 具有增强的底物特异性。
[0037] 在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98Asp、Serl99Val 和Pro201Glu，并且1)对丙酮比对MEK;和/或2)对乙醛比对MEK、丙酮和/或乙偶姻；和 /或3)对乙偶姻比对丙酮和/或MEK具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含所 述置换组合的醇脱氢酶对乙醛比对MEK、丙酮以及乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个 实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对乙偶姻比对丙酮和MEK具有增强的底物特异 性。在另一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶1)对丙酮比对MEK ;和2)对乙醛 比对MEK、丙酮以及乙偶姻；和3)对乙偶姻比对丙酮和MEK具有增强的底物特异性。
[0038] 在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Ala，并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和/或乙偶姻；和/或 2)对MEK比对乙醛和/或乙偶姻；和/或3)对乙偶姻比对乙醛具有增强的底物特异性。在 一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻具有增强 的底物特异性。在一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对MEK比对乙醛和乙偶 姻具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶1)对丙酮 比对MEK、乙醛以及乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻；和3)对乙偶姻比对乙醛具有 增强的底物特异性。
[0039] 在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Phe，并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和/或乙偶姻；和/或 对MEK比对乙醛和/或乙偶姻；和/或3)对乙醛比对乙偶姻具有增强的底物特异性。在一 个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻具有增强的 底物特异性。在一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对MEK比对乙醛和乙偶姻 具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶1)对丙酮比 对MEK、乙醛和乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻；和3)对乙醛比对乙偶姻具有增强 的底物特异性。在一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶基本没有使用乙偶姻作 为底物的能力。
[0040] 在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Ala，并且能够使用NADH作为辅因子。在一个实施方案中， 所述醇脱氢酶包含所有这些置换并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和乙偶姻；和2)对MEK比对 乙醛和乙偶姻；和3)对乙偶姻比对乙醛具有增强的底物特异性；并且4)能够使用NADH作 为辅因子。
[0041] 在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Phe，并且能够使用NADH作为辅因子。在一个实施方案中， 所述醇脱氢酶包含所有这些置换并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和乙偶姻；和2)对MEK比对 乙醛和乙偶姻；和3)对乙醛比对乙偶姻具有增强的底物特异性；并且5)能够使用NADH作 为辅因子。
[0042] 在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 38中提供的序列。在一个实施方 案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 42中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有 SEQ ID 50中提供的序列。
[0043] 在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 44中提供的序列。在一个实施方 案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 46中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有 SEQ ID 48中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 52中提供的序 列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 54中提供的序列。在一个实施方案中， 所述醇脱氢酶具有SEQ ID 63中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 64中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 65中提供的序列。
[0044] 在第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面的醇脱氢酶的核酸。
[0045] 在某些实施方案中，所述核酸具有SEQ ID 37、SEQ ID 41、SEQ ID47、SEQ ID 49、 SEQ ID 67、SEQ ID 68、SEQ ID 69或SEQ ID 70的序列。在其他实施方案中，所述核酸具 有 SEQ ID 39、SEQ ID 43、SEQ ID 45、SEQ ID 51 或 SEQ ID 53 的序列。
[0046] 在第三方面，本发明提供了包含编码本发明第一方面的醇脱氢酶的核酸的核酸载 体。在一个实施方案中，所述载体是表达载体。在一个实施方案中，所述编码第一方面的醇 脱氢酶的核酸是第二方面的核酸。
[0047] 在第四方面，本发明提供了包含本发明第二或第三方面的核酸的宿主细胞。
[0048] 在第五方面，本发明提供了包含一种或多种本发明第二或第三方面的核酸的重组 微生物。
[0049] 在一个实施方案中，所述微生物能够通过发酵产生一种或多种选自异丙醇、 2, 3- 丁二醇、乙醇和2- 丁醇的产物和任选的一种或多种其他产物。
[0050] 在一个实施方案中，所述微生物能够通过发酵产生一种或多种选自乙偶姻、乙醒、 MEK和丙酮的产物和任选的一种或多种其他产物。
[0051] 在一个实施方案中，所述重组微生物选自包括细菌、古细菌和真菌的微生物。
[0052] 在一个实施方案中，所述重组微生物选自：梭菌属（Clostridium)、醋酸杆 菌属（Acetobacterium)、穆尔氏菌属（Moorella)、丁酸杆菌属（Butyribacterium)、 Blautia、产醋杆菌属（Oxobacter)、热厌氧杆菌属（Thermoanaerobacter)、埃希氏菌 属（Escherichia)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)、发酵单胞菌属（Zymomonas)、朽 1檬酸 杆菌属（Citrobacter)、肠杆菌属（Enterobacter)、沙门氏菌属（Salmonella)、沙雷 氏菌属（Serratia)、乳酸杆菌属（Lac