）。
[0109] SEQ ID No. 52:下文进一步描述的突变体12的氨基酸序列。
[0110] SEQ ID No. 53:下文进一步描述的突变体13的核酸序列（密码子优化的）。
[0111] SEQ ID No. 54:下文进一步描述的突变体13的氨基酸序列。
[0112] SEQ ID No. 55:自产乙醇梭菌醇脱氢酶基因的5'同源臂的核苷酸序列。
[0113] SEQ ID No. 56:自产乙醇梭菌醇脱氢酶基因的3'同源臂的核苷酸序列。
[0114] SEQ ID No. 57 :引物 Sec5f。
[0115] SEQ ID No. 58 :引物 Sec5r。
[0116] SEQ ID No. 59 :引物 Sec3f。
[0117] SEQ ID No. 60 :引物 Sec3r。
[0118] SEQ ID No. 61 :引物 SecOf。
[0119] SEQ ID No. 62 :引物 SecOr。
[0120] SEQ ID No. 63:具有以下置换 Glyl98Asp、Serl99Val、Pro201Glu 和 Tyr218Gly 的 醇脱氢酶的氨基酸序列。
[0121] SEQ ID No. 64:具有以下置换 Glyl98Asp、Serl99Val、Pro201Glu 和 Tyr218Ser 的 醇脱氢酶的氨基酸序列。
[0122] SEQ ID No.65:具有以下置换 Glyl98Asp、Serl99Val、Pro201Glu 和 Tyr218Val 的 醇脱氢酶的氨基酸序列。
[0123] SEQ ID No. 66:具有以下置换Ser 199G1U的醇脱氢酶的氨基酸序列。
[0124] SEQ ID No. 67:具有以下置换 Glyl98Asp、Serl99Val、Pro201Glu 和 Tyr218Gly 的 醇脱氢酶的核酸序列。
[0125] SEQ ID No. 68:具有以下置换 Glyl98Asp、Serl99Val、Pro201Glu 和 Tyr218Ser 的 醇脱氢酶的核酸序列。
[0126] SEQ ID No.69:具有以下置换 Glyl98Asp、Serl99Val、Pro201Glu 和 Tyr218Val 的 醇脱氢酶的核酸序列。
[0127] SEQ ID No. 70:具有以下置换Serl99Glu的醇脱氢酶的核酸序列（密码子优化 的）。
【具体实施方式】
[0128] 以下是在广义上给出的对本发明（包括其优选的实施方案）的说明。在下文标题 "实施例"下给出的公开内容进一步解释本发明，其提供了支持本发明的实验数据、本发明 多个方面的具体实例以及实施本发明的方法。
[0129] 本发明人意外地发现来自一氧化碳营养型产乙酸微生物的醇脱氢酶的突变增强 了其对底物乙偶姻、甲基乙基酮（MEK或2- 丁酮）、丙酮和乙醛中的一种或多种相对于彼此 的特异性。
[0130] 另外，本发明人鉴定了能够接受NADH而不是NADPH作为辅因子的突变体或者除了 NADPH之外还能够接受NADH作为辅因子的突变体。因此，其不受只有一种所述辅因子可用 的限制且能够将更丰富的细胞内NADH池用于提高产物形成的总效率。
[0131] 所述突变意指本发明的酶被改造为适于优选地产生一种发酵终产物而 由于产生另一种发酵终产物，并且使得能够使用通常比NADPH池更大的NADH池 (Bennett&San，2009)。在ABE发酵中产生乙醇和丙酮二者，并且在IBE发酵中产生异丙醇 (Kopke &Dtore，2011)。本发明可使得能够增强丙酮到异丙醇的还原或者相对于乙醛到 乙醇的反应优先催化该反应，或反之亦然。例如，本发明可有助于克服异丙醇生产中的缺 陷，这是因为所有的菌株都依赖于未经修饰的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶是严格依赖NADPH 的并且对乙醛具有高背景活性。经改造的用于异丙醇生产的大肠杆菌菌株具有相同的缺 陷和低产率，这是因为使用了来自拜氏梭菌的相同的NADPH依赖性醇脱氢酶而没有其他选 择（Hanai T et al(2007)Engineered synthetic pathway for isopropanol production in Escherichia coli.Applied and environmental microbiology73:7814 - 8 ；Inokuma K et al (2010)Improvement of isopropanol production by metabolically engineered Escherichia coli using gas stripping. Journal of bioscience and bioengineering 110:696 - 701 ；Jojima T et al (2008)Production of isopropanol by metabolically engineered Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology 77:1219-24)。类似地，本发明提供了由之前不能产生可行水平的异丙醇的一氧化碳营养型产乙 酸微生物从含一氧化碳的底物产生异丙醇的方法。一些一氧化碳营养型生物（如自 产乙醇梭菌、杨氏梭菌或拉氏梭菌）能够同时形成乙醇和和2, 3-丁二醇（KSpke et al.，2011)。本发明还可使得能够增强乙偶姻到2, 3-丁二醇的还原或者能够相对于乙 醛到乙醇的反应优先催化该反应，或反之亦然。可通过二醇脱水酶将2, 3-丁二醇转化 成 MEK(Toraya et al,1976, Substrate specificity of coenzyme B12-dependent diol dehydrase-glycerol as both a good substrate and a potent inactivator. Biochem. Biophys. Res. Commun.，69:475-80)。本发明使得能够将MEK有效转化成2- 丁醇。因此，本 发明还提供了以更高特异性从乙偶姻产生2, 3- 丁二醇和从MEK产生2- 丁醇的方案。
[0132] 因此，除此之外，本发明还提供了醇脱氢酶，所述醇脱氢酶对丙酮底物比对其他底 物（如乙偶姻、甲基乙基酮（MEK或2- 丁酮）和/或乙醛底物），对MEK底物比对乙醛和/ 或乙偶姻底物，对乙醛底物比对MEK、乙偶姻和/或丙酮底物，并且/或者对乙偶姻底物比对 丙酮、MEK和/或乙醛底物具有增强的特异性，其中和相应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇 脱氢酶包含至少一个或多个突变；编码所述醇脱氢酶的核酸；包含所述核酸的核酸载体； 能够通过发酵底物产生异丙醇、2, 3- 丁二醇、乙醇和2- 丁醇中的一种或多种和任选的一种 或多种其他产物并且包含编码本发明的一种或多种醇脱氢酶的一种或多种核酸的微生物； 以及产生异丙醇、2, 3- 丁二醇、乙醇和2- 丁醇中的一种或多种和任选的一种或多种其他产 物的方法。
[0133] 本发明还提供了基本不能使用乙偶姻作为底物的醇脱氢酶、编码所述醇脱氢酶的 核酸和核酸载体、包含所述核酸或核酸载体的微生物以及所述醇脱氢酶的使用方法。
[0134] 短语"含C0、0)2和H2中的一种或多种的底物"应被理解为包括其中的C0、0) 2和 4中的一种或多种可被一种或多种微生物菌株获得用于例如生长和/或发酵的任意底物。 应理解，所述底物可包含100% 〇)、0)2或!12或者和其他气体相比大部分为0)、0)2或!1 2，或 者所述底物可包含所述气体中的两种或多种以任意比例的组合。在具体实施方案中，所述 底物包含CO和CO 2的组合。在另一个实施方案中，所述底物包含CO和H2的组合。在另一 个实施方案中，所述底物包含C0、0) 2和H 2的组合。
[0135] 在某些实施方案中，所述底物可包含CO2以及在光（光合作用）和/或电（电合 成）的存在下进行的任何培养、生长或发酵。在某些实施方案中，〇) 2与O2组合。
[0136] 在一个实施方案中，所述"含CO、COJPH2的底物"是"含一氧化碳的底物"。"含 CO的底物"及类似术语应被理解为包括其中一氧化碳可被一种或多种微生物菌株用于例如 生长和/或发酵的任意底物。
[0137] 短语"含一氧化碳的气态底物"及类似短语和术语包括含有一个水平的一氧化碳 的任意气体。在某些实施方案中，所述底物含有至少约20体积％至约100体积％的C0、20 体积％至70体积％的C0、30体积％至60体积％的CO和40体积％至55体积％的C0。在 具体实施方案中，所述底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体 积％、或约45体积％、或约50体积％的C0、或约55体积％的C0、或约60体积％的C0。
[0138] 虽然所述含CO的底物不必需含有任何氢气，但是H2的存在不会对依据本发明方 法的产物形成够成不利。在具体实施方案中，氢气的存在可获得提高的醇产生的整体效率。 例如，在具体实施方案中，所述底物可包含约2:1、或1:1或1:2比率的H 2:C0。在一个实施 方案中，所述底物包含约30体积％或更低的H2、20体积％或更低的H 2、约15体积％或更低 的H2、或者约10体积％或更低的H2。在其他实施方案中，所述底物流包含低浓度的H 2，例如 小于5体积％、或小于4体积％、或小于3体积％、或小于2体积％、或小于1体积％或者基 本上不含氢气。例如，所述底物还可含有一些CO 2，例如约1体积％至约80体积％的0)2或 1体积％至约30体积％的CO2。在一个实施方案中，所述底物包含小于或等于约20体积％ 的CO 2。在具体实施方案中，所述底物包含小于或等于约15体积％的CO2、小于或等于约10 体积％的CO 2、小于或等于约5体积％的0)2或者基本上不含C02。
[0139] 在本发明的具体实施方案中，所述含CO的气态底物是工业排气或废气。"工业废 气或工业排气"应被广义地认为包括工业过程产生的任何含CO的气体，并且包括铁金属产 品制造、有色金属产品制造、石油精炼过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、炭黑生产 和焦炭生产所产生的气体。本文别处提供了其他实例。
[0140] 在一个实施方案中，所述"含C0、0)2和!12的底物"是"含0) 2和!12的底物"。"含 COjPH2的底物"及类似术语应被理解为包括其中二氧化碳和氢气可被一种或多种微生物 菌株用于例如生长和/或发酵的任意底物。
[0141] 所述含0)2和H2的底物通常会含有大比例的H2，例如至少约30体积％的H 2、或至 少40体积％的H2、或至少50体积％的H2、或至少60体积％的H 2、或至少70体积％的H2、或 至少80体积％的H2、或至少85体积％的H 2。
[0142] 所述气态底物通常含有至少约10体积％的CO2、或至少15体积％的CO 2、或至少20 体积％的CO2、或至少25体积％的CO2、或至少30体积％的CO 2、或至少40体积％的C02。
[0143] 在某些实施方案中，所述H2 = CO2的比率为约1:1、或约2:1、或约3:1。
[0144] 在某些实施方案中，所述含0)2和!12的底物是作为工业过程的副产物获得的或者 从一些其他来源获得的废气。全球CO 2排放的最大来源来自发电厂、工业设备和其他来源 中的化石燃料（例如煤、油和气体）的燃烧。
[0145] 所述气态底物可以是作为工业过程的副产物获得的或者从一些其他来源（例如 从汽车废气）获得的含COJPH 2的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自氢气制造、 氨制造、燃料的燃烧、煤的气化以及石灰石和水泥的生产。所述气态底物可以是混合一种或 多种气态底物以提供混合流的结果。技术人员会理解，富含H2或富含CO 2的废气流比同时 富含4和CO 2的废气流更丰富。技术人员会理解，混合一种或多种包含所需的CO 2和H 2组 分之一的气流会落在本发明的范围内。
[0146] 可通过多种方法（包括碳氢化合物的蒸汽重整（stream reformation)，尤其是天 然气的蒸汽重整）产生富含氢气的气流。所述煤或碳氢化合物的部分氧化也是富含氢气的 气体的来源。所述富含氢气的气体的其它来源包括水的电解、来自用于产生氯的电解池的 副产物和来自多种精炼厂和化学流的副产物。
[0147] 通常富含二氧化碳的气流包括来自碳氢化合物（例如天然气或油）的燃烧的废 气。二氧化碳还可以作为生产氨、石灰或磷酸盐的副产物产生。
[0148] 在以下的描述中，以递送和发酵"含CO的气态底物"或"含CO、COJPH2中的一 种或多种的气态底物"的措辞描述本发明的实施方案。但是，应理解，所述气态底物可以 以其他形式提供。例如，所述气态底物可以以溶解于液体中的形式提供。基本上，将液体 用含一氧化碳、二氧化碳和/或氢气的气体饱和，然后将所述液体加入生物反应器中。这 可使用标准方法实现。例如，可使用微泡分散发生器（Hensirisak et.al.Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation ；Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101，Number 3/0ctober，2002)。又例如，可将所述含 CO 的气 态底物吸附到固态载体上。这类替代方法是使用术语"含CO的底物"、"含〇)2和1的底物" 以及"含C0、0) 2和H 2中的一种或多种的底物"和类似短语所涵盖。
[0149] 短语"含一种或多种碳水化合物的底物"及类似术语应被理解为包括其中一种或 多种碳水化合物可被一种或多种微生物菌株用于例如生长和/或发酵的任意底物。"碳水 化合物"应被广义地认为包括单糖、二糖、寡糖和多糖，简单和复杂的碳水化合物（包括葡萄 糖、果糖、糖蜜和淀粉）。
[0150] 在一个实施方案中，所述"含一种或多种碳水化合物的底物"可来自生物质。所 述生物质可以是具有任何性质的并且包括例如，来自森林或其他商业作物（如树木、树枝、 树桩、木片、锯屑、剪下物（clipping))的残留物、城市固体废物和为通过微生物发酵进行 的一种或多种产物的生产提供原料而生长的作物（包括例如，芒草（miscanthus)、柳枝稷 (switchgrass)、麻类植物、玉米、白杨、柳树、高粱、甘鹿和竹子）。
[0151] 除非上下文需要另有说明，否则本文使用的短语"发酵"、"发酵过程"或"发酵反 应"等意图既包含所述过程的生长阶段也包含产物生物合成阶段。如本文将要进一步描述 的，在一些实施方案中，所述生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此， 向发酵反应中添加金属或组合物应被理解为包括加入到这些反应器之一或二者中。
[0152] 术语"生物反应器"包括由一个或多个容器和/或塔或管路布置构成的发酵装置， 其包括连续搅拌釜式反应器（CSTR)、固定化细胞反应器（ICR)、滴流床反应器（TBR)、鼓泡 塔、气升发酵罐、静态混合器、或适合用于气液接触的其他容器或其他装置。在一些实施方 案中，所述生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提到向所述生物 反应器或发酵反应中加入底物时，如果合适，应该理解为加入到这些反应器之一或二者中。
[0153] 术语核酸"构建体"或"载体"及类似术语应被广义地认为包括任何适合用作载体 将遗传物质转移到细胞中的核酸（包括DNA、cDNA和RNA)。该术语应被认为包括质粒、病 毒（包括噬菌体）、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包含一种或多种调节元件、复制起 点、多克隆位点和/或选择标记。在一个具体实施方案中，所述构建体或载体被改造为适于 使得由所述构建体或载体编码的一个或多个基因表达。核酸构建体或载体包括裸露核酸， 以及用一种或多种有助于向细胞递送的试剂配制的核酸（例如脂质体缀合的核酸、其中含 有所述核酸的生物）。可将所述载体用于核酸的克隆或表达以及用于微生物的转化以产生 重组微生物。所述载体可包含编码本发明的一种或多种醇脱氢酶的一种或多种核酸。
[0154] "外源核酸"是源自待引入核酸的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任意适合的 来源，包括但不限于待引入它们的微生物、与待引入它们的生物不同的微生物菌株或种，或 者它们可通过人工或重组方法形成。在另一个实施方案中，所述外源核酸代表非天然存在 于待引入它们的微生物中的核酸序列，并且所述外源核酸使得可表达非天然存在于所述微 生物中的产物。所述外源核酸可被改造为适于整合到待引入其的微生物的基因组中，或者 保持染色体外状态。
[0155] "亲代微生物"是用于产生本发明微生物的微生物。所述亲代微生物可以是天然 存在的微生物（即野生型微生物）或之前曾被修饰过但是不表达或不过表达本发明主题的 一种或多种酶的微生物。因此，本发明的微生物已被修饰以在所述亲代微生物中表达本发 明的一种或多种醇脱氢酶。
[0156] 本文提到的本发明的醇脱氢酶对一种底物比对另一种底物具有"增强的特异性"。 这意在指和野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶对一种底物相对于对另一种底物具有增强 的特异性。不应被认为必须推定，和野生型醇脱氢酶相比，本发明的醇脱氢酶对具体的底物 具有增强的特异性，尽管在一些实施方案中可能是这种情况。另外，所述术语不应被理解为 意指，本发明的醇脱氢酶对一种具体底物相对于对另一种底物具有绝对的特异性（尽管在 一些实施方案中可能是这种情况），并且所述术语至少包括对一种具体底物相对于对另一 种底物的偏好。
[0157] 当与NADH辅因子或NADPH辅因子关联使用时，"增强的特异性"、"更高的特异性" 或类似术语是指在反应过程中辅因子与醇脱氢酶结合的亲和度。不应被认为意指，醇脱氢 酶和辅因子具有绝对的特异性（尽管可能是这种情况），并且包括至少对具体的醇脱氢酶 与一种辅因子之间的结合相对于与另一种辅因子之间的结合具有偏好。
[0158] 本文提到了产生"一种或多种包含异丙醇、2, 3-丁二醇、乙醇和2-丁醇的产物"。 但是，应理解，也可产生其他产物。
[0159] 本文还提到了产生"一种或多种包含乙偶姻、MEK、乙醛和丙酮的产物"。同时这些 产物在本文还被称为"底物"，在某些实施方案中，当本发明的突变型醇脱氢酶对一种具体 底物的特异性相比于对另一种底物的特异性发生降低时，该底物会以更低的水平被转化成 下游产物或