通过可移动纳米基质多克隆刺激t细胞的方法
【专利说明】通过可移动纳米基质多克隆刺激T细胞的方法 发明领域
[0001] 本发明总体涉及免疫学领域，尤其涉及通过纳米基质多克隆刺激T细胞的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 抗⑶3的抗体在很多T细胞增殖方案中是核心要素。固定于表面的抗⑶3通 过将T细胞受体络合物交联到T细胞表面来递送激活和增殖诱导信号。通过固定抗CD3 和抗CD28来同时递送信号和共刺激信号，可以增加增殖（Baro j a等（1989)，Ce I Iu I ar Immunology, 120:205-217)。在W009429436A1中，固相表面如培养皿和珠子用于固定抗CD3 和抗⑶28抗体。通常，在珠子上的固定在直径大小为4. 5 μ m的DynaBeads? M-450上 进行。
[0004] EP01257632B1描述了通过同时的T细胞集中和细胞表面部分连接刺激T细胞群的 方法，包括提供其中至少其一部分包含T细胞的细胞群，将所述细胞群与表面接触，其中所 述表面连接有一种或多种连接至少一部分T细胞的细胞表面部分并刺激至少那部分T细胞 或其亚群的试剂，并施加主要驱动T细胞集中和T细胞表面部分连接的力，从而诱导T细胞 刺激。如本文所使用，术语力是指用于驱动细胞的力，可以包括功能相似的各种力，且包括 大于重力、液压力、通过跨膜压产生的渗透力、离心力、或磁力。EP1257632B1描述了颗粒与 细胞的比例可以变化，然而某些优选值包括至少1:4至6:1，其中一种优选的比例是每个T 细胞至少2:1珠子。通常，在珠子/T细胞比例为3:1的实验中使用与抗⑶3和抗⑶28抗 体偶联的直径大小为4. 5 μπι的DynaBeads? M-450。再一次，这些方法用固相表面来共 固定T细胞刺激剂如抗CD3和抗CD28抗体。这些表面是细胞大小且与T细胞本身相当。
[0005] US2008/0317724A1公开了信号分子的空间表现可以极大影响T细胞对这些信号 分子的响应。例如，当抗CD3和抗CD28抗体被置于基质的不同预定区，不仅取决于这些信 号分子的类型，也取决于这些信号分子的间隔，在所述基质上培养的T细胞分泌不同量的 白细胞介素 -2和/或表现出妈峰（spikes in calcium)。例如，用抗⑶3和抗⑶28抗体产 生一种模式，其中抗CD3抗体占据由与中心抗CD3特征相隔约1-2微米的抗CD28抗体的卫 星特征包围的中心特征。与当抗⑶3和抗⑶28抗体被以"共定位"特征一起呈现给T细胞 相比，当抗CD28抗体特征相隔约1-2微米时，白细胞介素-2 (IL-2)的T细胞分泌增强。
[0006] Erin R Steenblock 和 Tarek M Fahmy 的出版物（Molecular Therapy vol. 16no.4,765 - 772April 2008)使用固体-表面的纳米颗粒（130nm)并显示这些 纳米颗粒对T细胞的刺激弱于微粒（8μπι)。作者声明，这些发现由之前报道的那些 (Mescher，MF(1992). J Immunol 149:2402 - 2405.)所支持，表明与T细胞大小接近的微米 尺寸的颗粒提供最佳T细胞刺激。Mesher的研宄表明大的、连续的表面接触面积对有效的 CTL激活极为重要。使用固定于乳胶微球的I类同种异型抗原，发现4-5微米的颗粒尺寸提 供最佳刺激。低于4微米，响应随着颗粒尺寸的降低快速降低，大量小颗粒不能弥补欠佳的 尺寸。
[0007] US8, 012, 750B2公开了激活T细胞的生物可降解设备。首先将所述生物可降解支 架制备成一种形状，例如微球。随后，用能与第二种材料结合的提供反应性表面的第一种材 料包被所述生物可降解支架。所述第二种材料具有反应性表面，其允许结合细胞上的表面 结构。可将所述生物可降解支架制备成各种形状。微球是优选的剂型，因为制备简单，且球 形允许与细胞受体相互作用的表面积增加。根据US8, 012, 750B2,纳米球没有提供足够的激 活初始T细胞的交联，因此只能与之前被激活的T细胞一起使用。再一次，实验数据用由抗 CD3和抗CD28抗体共固定的尺寸为4-24微米（其中平均尺寸为7微米）的球体产生。
[0008] US2012/121649A1公开了扩增抗原特异性抗肿瘤生成T细胞的方法，包括向受试 者或细胞体外施用足够量的刺激抗原特异性抗肿瘤生成T细胞扩增的抗原/MHC/共刺激分 子/纳米颗粒络合物。所述纳米颗粒为大约Inm至10nm。比较pMHC和pMHC/抗⑶28mAb_偶 联的纳米颗粒刺激并激活同源初始CD8+T细胞的能力。所述纳米颗粒可以进一步包含一 种或多种由葡聚糖和其他分子形成的生物可降解包被。例如，可以结合铁（III)氧化物和 PLGA以形成纳米颗粒，导致固体表面颗粒。US2012/121649A1没有公开例如用固定在纳米 颗粒上的抗⑶3和抗⑶28mAb多克隆刺激T细胞。
[0009] US2010/284965A1公开了通过向细胞施用连接有抗⑶28抗体的聚合纳米颗粒或 微米颗粒激活T细胞的方法。所述微米颗粒在0. 5至1000微米的范围内，和纳米颗粒在 50nm至小于0· 5nm的范围内。所述颗粒由PLGA组成，因此代表球形固体表面颗粒。此外， US2010/284965A1没有公开用纳米颗粒的多克隆刺激。
[0010] 总而言之，在现有技术中使用的用于通过固定的T细胞刺激抗体的多克隆T细胞 活化的珠子或微球通常是细胞大小的（大多数尺寸为1-10 μπι)均匀圆形颗粒。这个尺寸 的珠子在其与T细胞相互作用的潜力以及其生产、操作和在临床T细胞治疗程序的安全性 上具有若干缺点。
[0011] 1.由于珠子的固体表面，在珠子和细胞之间的相互作用面积尺寸是有限的。
[0012] 2.与可溶抗体相比，它们的制备复杂且昂贵，且以cGMP质量制备它们时尤其不 便。例如由于它们的尺寸，不可能无菌过滤。沉淀使操作复杂化，即在填充和抗体装载过程 中恒定的颗粒数/体积。
[0013] 3.它们对于体外方法使用以产生用于体内用途的T细胞疗法不便，
[0014] -因为它们必须以确定的细胞/珠子比例以确定的每表面积细胞/珠子密度加入 细胞，
[0015] -刺激强度的适应性只在某种程度上是可能的，因为T细胞刺激强度主要由细胞 表面上的抗体密度确定，而不是由珠子数/细胞确定，
[0016] -由于沉淀，等分是不准确的，
[0017] -不可能无菌过滤，
[0018] -由于其尺寸，它们可能影响细胞活性和功能，且它们不能简单地通过离心从细 胞中去除。因此开发了"去除珠子"的特定方案或生物可降解颗粒。然而，两种方法均具 有去除过程之后的残留珠子的实际数量的不准确性的缺点，如果将T细胞刺激珠子注入患 者，则留下毒性作用的某些风险。这个问题尤其与颗粒的尺寸相关，因为每个单个颗粒本身 仍然可能保留体内激活T细胞的能力。
[0019] 因此，需要改进的多克隆T细胞刺激的体内方法。
[0020] 发明概沐
[0021] 令人惊讶地，发现与纳米基质连接的多克隆T细胞刺激剂如抗体，例如抗CD3和 CD28,可以用于体外刺激初始和记忆T细胞，所述纳米基质的特征在于可移动聚合物基质 骨架（非固体表面），在所述基质中可包埋附加的功能化合物如磁性纳米晶体，尽管它们的 直径小于I ym，优选小于500nm，更优选小于200nm。与此相反，已经发现具有与本文所用 的纳米基质相同尺寸的固体表面的珠子完全不能刺激T细胞，或刺激T细胞至纳米基质的 相似水平，这与本领域技术人员广为接受的观点一致。由于其小尺寸，不连接抗体时，纳米 基质本身不改变细胞的结构、功能、活动状态或活性，即，它们不会在细胞中造成干扰且不 会干扰刺激细胞随后的分析、实验和治疗应用。此外，优选地，所述纳米基质是生物可降解 且对活细胞无毒的，即，所述纳米基质在改变细胞功能方面是生物学惰性实体。因此，在本 发明的方法中使用的纳米基质通过保存细胞活性而改进了 T细胞的体外刺激。此外，小的 纳米基质的无菌过滤是可能的，这对于在符合严格的GMP标准的条件下的长期T细胞体外 扩增是一个重要特征，且对于体外扩增的T细胞的临床应用是有价值的选择。并且，这些 纳米基质非常适合用于无菌且封闭的细胞培养系统，如w〇2〇〇9/〇72〇〇3( CliniMACS? Prodigy, Miltenyi Biotec GmbH, Germany)所述。
[0022] 此外，令人惊讶地，发现与纳米基质连接的T细胞刺激剂如抗体，例如抗CD3和 CD28,可以偶联至分别的纳米基质（而不是偶联至同一纳米基质），其随后可以混合用于优 化用途。通常，纳米基质与细胞的比例大于100:1，优选大于500:1，更优选大于1000:1。这 导致用于刺激祀标T细胞的纳米基质的微调（fine-tuning)的可能性，例如，它促进了单个 纳米基质的生产过程和质量控制并改进了试剂的灵活性，例如通过滴定各种CD3和CD28浓 度和比例促进特定T细胞亚组激活条件的优化。
[0023] 在第一个方面，本发明提供如本文所述的纳米基质用于多克隆体外刺激T细胞的 用途。
[0024] 在进一步的方面，本发明提供多克隆刺激T细胞的方法，所述方法包括将T细胞群 与纳米基质接触，其中所述纳米基质包含可移动聚合物链的基质，且已连接一种或多种为T 细胞提供激活信号的试剂，从而激活并诱导T细胞增殖；并且其中，所述纳米基质的尺寸是 l-500nm，优选10-200nm。优选地，所述纳米基质在改变细胞功能方面是生物学惰性的。此 外优选地，所述纳米基质是生物可降解的。
[0025] 用本发明实现的刺激的且可选地扩增的T细胞可以用于随后的治疗或非治疗应 用，且由于所述纳米基质在改变细胞功能方面是生物学惰性的性质而无需消除或去除所述 的纳米基质。
[0026] 或者，由于其是可溶的或胶质的，所述纳米基质在T细胞激活过程后容易通过重 复的洗涤步骤稀释至低于T细胞激活阈值的有效浓度。
[0027] 所述纳米基质的尺寸是l_500nm，优选10-200nm。所述纳米基质是由聚合材料组 成的可移动基质，但与珠子或微球相反，其不含有固相表面。允许多克隆刺激T细胞的试剂 如抗CD3和/或抗CD28抗体与基质的可移动聚合物链相连接。可在所述基质内包埋其他 物质，例如磁性纳米晶体、荧光染料等，为所述纳米基质增加其他功能而不改变其基本的可 移动结构、表面特征、或纳米基质的细胞相互作用参数。
[0028] 这种移动性，例如在水性溶液中聚合物基质的灵活性（即使当与固体表面连接） 在本领域是公知的。例如，Bertholon等Langmuir2006, 45485-5490页给出了用于生物或 医学应