一种高效生产根霉曲的工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物培养领域，特别涉及一种高效生产根霉曲的工艺。
【背景技术】
[0002]根霉的淀粉酶活性很强，是酿造工业中常用糖化菌。根霉曲在酒酿的制作、黄酒、小曲酒的酿造过程中起到至关重要作用，根霉曲质量好坏直接决了发酵产品的得率和品质，根霉曲的质量主要从其分解的淀粉酶的活力、杂菌率等因素来判断，而根霉曲历来为各厂家所重视。传统根霉曲的制作工艺，一直采用固体培养基逐步级扩大培养的方法，这种方法优点是操作简单、方便，比较实用，不足之处在于优良菌种的性能在固-固传代培养过程中衰退得较快，容易造成成曲质量不稳定，活性不高、保存期短，最终影响下游发酵产品的得率和品质；另外固体传代培养过程中，不能进行在线监测，染了少量杂菌也发现不了，容易造成成曲不纯，生产率不高的情况;还有固体培养各级种子培养的周期都需要2-3天，时间较长，种子本身在干燥过程中，控制不严也容易感染杂菌。有些科研单位用纯液态发酵制作根霉曲，克服了固-固传代培养生产工艺中存在的一些问题，该方法制作出的根霉菌丝粗壮，活性高，质量稳定，可以在线控制，自动化程度高，生产周期短，杂菌感染力也大大降低，但该方法制作出的成品是菌丝体，远不及固态发酵制作出的孢子那样容易储存，使用起来极为不便，实用性低;纯液态发酵相对来说，设备投入高，技术要求严，产量也要低得多，一般的工厂很难实现规模化生产。
【发明内容】
[0003]为解决现有根霉曲生产中存在的上述问题，本发明的发明目的为提供一种制作出的根霉曲纯度高，活性强，质量稳定，效率高，周期短，可以在线监测各级菌种的质量，并可以实现工业化生产的高效生产根霉曲的工艺。
[0004]为实现上述目的，本发明提供一种高效生产根霉曲的工艺，其特征在于，通过四级培养得到根霉曲，各级种子所采用的培养基各不相同:一级试管种采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基;二级摇瓶种采用麦芽汁液体培养基;三级发酵罐种采用马铃薯-蔗糖液体培养基；四级生产种采用大米麦麸培养基。
[0005]优选地，所述大米麦麸培养基中米粉与麦麸的比例为24:1，所述米粉为大米磨粉，过40目筛。
[0006]优选地，所述一级试管种采用如下方法培养:配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基；于115 °C灭菌25 min，分装至已灭菌的试管中，制成试管斜面培养基;挑取已活化的根霉菌接种于试管斜面，30 1恒温培养48 h得一级试管种。
[0007]优选地，所述已活化的根霉菌是保藏号为HNCC6.197的根霉菌原种活化3-4次而得的。
[0008]优选地，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制方法为:选新鲜无霉变马铃薯，去皮、切块，温火熬制后过滤，补水并加入葡萄糖和琼脂粉，搅拌均匀，最终重量比为马铃薯20%、匍萄糖2%、琼脂粉2%。
[0009]优选地，所述二级摇瓶种采用如下方法获得:配制麦芽糖液体培养基，115°C高压灭菌15min，冷却后，无菌环境下将一级试管种接种于三角瓶中，恒温摇床培养36 h，其中温度30°C、转速80 rpm/min，得二级摇瓶种。
[0010]优选地，所述麦芽糖液体培养基中麦芽糖比例为13%。
[0011]优选地，所述三级发酵罐种采用如下方法获得:配制马铃薯-蔗糖液体培养基加入发酵罐中，121°C灭菌20 min，在无菌环境下用灭过菌的搅拌机将二级摇瓶种搅碎，通过无菌操作按8%的接种量接入以冷却的发酵罐中，同时加入青霉素至50 yg/mL，28-32°C下发酵罐培养36 h，培养过程中监测pH值变化。
[0012]优选地，所述马铃薯-蔗糖液体培养基采用如下方法配制:挑选新鲜无霉变马铃薯，去皮后切成小块倒入夹层锅中，加入5倍体积的水，熬制40-60 min后，用滤布过滤，补水至5倍体积，搅拌均匀得新鲜土豆汁;将新鲜土豆汁加入发酵罐种中，同时加入2 %的蔗糖和
0.5%。的消泡剂。
[0013]优选地，所述发酵罐培养的具体条件为:发酵罐搅拌转速200r/min，罐压0.8-1.2kg/cm2，通风量0.4 V/V.min。
[0014]优选地，所述四级生产种采用如下方法获得:配制大米麦麸培养基，放入灭菌锅干蒸1 h后拿出冷却，当大米麦麸培养基冷却至50°C时加入35%质量分数的新鲜纯净水，搅拌均匀;将培养好的三级种从发酵罐中放出，用灭过菌的搅拌机将菌丝体搅碎，按10%的比例接种于上述大米麦麸培养基中，搅拌均匀后，送至已消毒过的发酵房以温度30°C、湿度60%的条件恒温恒湿培养36 ho
[0015]优选地，还包括成曲烘干步骤，将四级生产种放入烘房，40-45°C，排湿烘干30-36h，水分含量降至8-10%时得到根霉曲。
[0016]本发明具有以下有益效果:(1)该工艺采用液固态结合发酵的生产工艺技术，前三级种子采用液态发酵技术，第四级生产种用固态发酵技术，结合了固态发酵和纯液态发酵各自的优点，制作出的根霉曲纯度高，活性强，质量稳定，效率高，周期短，可以在线监测各级菌种的质量，并可以实现工业化生产；(2)是以马铃薯、大米、麦麸为原料，保藏编号HNCC6.197的跟霉菌为原种，采用固液态结合发酵培养成纯种根霉曲的生产加工工艺。本发明采用新的生产工艺技术，根霉曲的生产过程中能够在线监测各级种子质量，整个生产周期也明显缩短，生产出的根霉曲，糖化酶活力从1172U/g提高到1240U/g，杂菌数也大为减少，基本检测不出，使得种曲活性更高，质量更稳定，安全性更好。
【具体实施方式】
[0017]下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0018]—种高效生产根霉曲的工艺，通过四级培养得到根霉曲，各级种子所采用的培养基各不相同:一级试管种采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基;二级摇瓶种采用麦芽汁液体培养基;三级发酵罐种采用马铃薯-蔗糖液体培养基；四级生产种采用大米麦麸培养基，其中，大米麦麸培养基中米粉与麦麸的比例为24:1，所述米粉为大米磨粉，过40目筛。
[0019]其中，一级试管种的制备步骤为:挑选新鲜无霉变马铃薯，去皮后称取200g，切成小块，加水温火熬制40min后，用8层纱布过滤，补水至1L，加入20g葡萄糖和20g琼脂粉，搅拌均匀于115°C灭菌25min，分装至10支已灭菌的试管中，制成试管斜面培养基;挑取已活化3-4次的跟霉菌接种于试管斜面，30°C恒温培养48h得一级试管种。
[0020]其中，二级摇瓶种的制备步骤为:称取麦芽膏粉(不含琼脂)130g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装至两个1L容量的三角瓶中，每个三角瓶装300ml，115°C高压灭菌15min，冷却后，无菌环境下挑取4小块一级试管种于各三角瓶中，再至于恒温摇床(温度30°C，