专利名称：：α-淀粉酶变体的制作方法a-淀粉酶变体发明领域本发明涉及，特别是亲本Termamyl-样a-淀粉酶的新变体，尤其是显示改变的特性的变体，特别是改变了淀粉亲和力(相对于亲本)，对于所述变体的应用，特别是工业淀粉处理(processing)(如淀粉液化或糖化)，这是有利的。发明背景oc-淀粉酶(a-l,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2丄1)组成催化淀粉和其它直链及支链1,4-葡糖苷寡糖和多糖水解的一组酶。有大量的专利和科学文献涉及此类在工业上十分重要的酵。许多a-淀粉酶，例如Te腿myl-样a-淀粉酶可了解自，如WO90/11352、WO95/10603、WO95/26397、WO96/23873、WO96/23874和WO97/41213。在最近涉及a-淀粉酶的公开内容中，WO96/23874提供了称为BA2的Termamyl-样a-淀粉酶的三维X-射线晶体结构数据，BA2由包含本文SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌CS.w^/o/z'，e/ac/era)a-淀粉酶的300个N-末端氨基酸残基，以及包含本文SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌(B.//c/7em/0rm&)a-淀粉酶的C-末端的氨基酸301-483(后者可以商品名TermamyFM购得)组成，因此与工业上重要的芽孢杆菌a-淀粉酶(其在本文中包括在术语"Termamyl-样a-淀粉酶"的含义中，尤其包括地衣芽孑包杆菌，解淀粉芽孢杆菌，和嗜热脂肪芽孢杆菌(及5^^0^2￡/7^^/2//1)01-淀粉酶)密切相关。WO96/23874进一步描述了在对亲本Termamyl-样a-淀4分酶的结构分析的基础上，设计相对于亲本显示改变的特性的亲本Termamyl-样a-淀粉酶变体的方法学。发明简述本发明涉及Termamyl-样a-淀粉酶的新的a-淀粉分解变体(突变体)，特别是显示出改变的淀粉亲和力(相对于亲本)的变体，所述改变在淀粉的工业处理方面(淀粉液化，糖化等等)是有利的。本发明人发现与亲本Termamyl-样a-淀粉酶相比，具有改变的特性、特别是改变的淀粉亲和力(a伍nity)的变体改善了淀粉的转化。本发明进一步涉及编码本发明变体的DNA构建体，包含本发明变体的组合物，制备本发明变体的方法，以及本发明变体和组合物单独或与其它a-淀粉分解酶(alpha-amylolyticenzymes)联合在各种工业处理中的应用，如淀粉液化，在洗涤剂组合物中，例如洗衣、清洗碗碟(dishwashing)和硬表面清洗组合物；乙醇生产，例如燃料，酒类和工业乙醇生产；纺织品(textile)、织物(fabric)或衣物的退浆等。命名法在本说明书和权利要求书中，使用了常规的单字母和三字母编码表示氨基酸残基。为便于引用，本发明的a-淀粉酶变体采用下列命名法描述原氨基酸位置取代的氨基酸依照该命名法，例如用天冬酰胺取代第30位的丙氨酸表示为Ala30Asn或A3ON在相同位置处丙氨酸的缺失表示为Ala30*或A30*以及额外的氨基酸残基例如赖氨酸的插入表示为Ala30AlaLys或A3OAK缺失连续的一段氨基酸残基，例如氨基酸残基30-33,表示为(30-33)*或A(A30-N33)。在特定的a-淀粉酶相对于其它a-淀粉酶而言含有"缺失"，并在该位置具有插入，如在第36位插入天冬氨酸的情况下，表示为*36Asp或*36D多个突变由加号隔开，即Ala30Asn+Glu34Ser或A30N+E34S分别表示在第30和34位，天冬酰胺和丝氨酸取代了丙氨酸和谷氨酸。当在给定位置插入一个或多个可选择的氨基酸残基时，其表示为A30N,E或A3ON或A30E此外，当本文鉴定出适于修饰的位置，而没有暗示任何具体的修饰时，应当理解为可用任一氨基酸残基取代该位置存在的氨基酸残基。因此，例如，当提及修饰第30位的丙氨酸，但未具体说明时，应当理解为丙氨酸可缺失，或可用任何其他氨基酸，即下列任一氨基酸来取代R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。此外，"A30X"表示任何一种下列取代A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y或A30V;或简言之A30R,N,D,C,Q，E，G，H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y，V。如果使用这种编号方式的亲本酶已具有建议在该位置被取代的所述氨基酸残基，在例如N或V之一存在于野生型中的情况下，使用下列命名法"X30N"或"X30N,V"。因此，其表示其他相应的亲本酶在第30位被"Asn"或"Val"取代。氨基酸残基特性带电氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His带负电荷氨基酸(带有最多负电荷的残基列于最前)Asp、Glu带正电荷氨基酸(带有最多正电荷的残基列于最前)Arg、Lys、His中性氨基酸Gly、Aa、Val、Leu、IJe、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Asn、Gln、Ser、Thr、Pro疏水氨基酸残基(具有最大疏水性的残基列于最后)Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、Ile、Tyr、Phe、Trp亲水氨基酸(具有最大亲水性的残基列于最后)Thr、Ser、Cys、Gln、Asn发明详述Termamyl-样a-淀粉酶众所周知，通过芽孢杆菌CBac///^w.)产生的多种a-淀粉酶在氨基酸水平上是高度同源的。例如，已发现包含SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶(商品名为TermamylTM)与包含SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌ot-淀粉酶约89%同源，与包含SEQIDNO:8中所示的氨基酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶约79。/。同源。其他同源的a-淀粉酶包括来源于芽孢杆菌菌抹NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的a-淀粉酶，皆详述于WO95/26397，以及Tsul(amoto等,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,151(1988),pp.25-31所描述的#707a-淀4分酶。更多同源的a-淀粉酶包括由EP0252666中所述的地衣芽孢杆菌菌抹(ATCC27811)所产生的a-淀粉酶，以及WO91/00353和WO94/18314中鉴定的a-淀粉酶。其他商用Termamyl-样a-淀粉酶包括在以下列商品名出售的产品'中OptithermTM和TakathermTM(可购自Solvay);MaxamyFM(可购自Gist-brocades/Genencor)、SpezymAA丁m和SpezymeDeltaAA顶(可购自Ge-nencor)和Keistase丁m(可购自Daiwa)、PurastarST5000E、PURASTRATMHPAML(来自Ge腦corlnt.)。由于发现这些a-淀粉酶之间基本上同源，因此它们被认为属于相同一类的a-淀粉酶，即"Termamyl-样a-淀粉酶"。因此，在本发明上下文中，术语"Termamyl-样a-淀粉酶"意在指示在氨基酸水平上具有与Termamyl,即具有本文SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶，基本上(substantial)同源的a-淀粉酶。换言之，Termamyl-样a-淀粉酶是具有本文SEQIDNO:2、4或6中所示的氨基酸序列,和WO95/26397或Tsukamoto等，1988中的SEQIDNO:1或2所示的氨基酸序列的a-淀粉酶，或者是i)显示与至少一种上述氨基酸序列至少60%,优选至少70%,更优选至少75%,甚至更优选至少80%，尤其是至少85%,尤其优选至少90%，甚至尤其更优选至少95%，更优选至少为97%,更优选至少99%同源性的a-淀粉酶，和/或ii)显示与针对至少一种上述a-淀粉酶产生的抗体免疫交叉反应性的a-淀粉酶，和/或iii)由与编码上述特定a-淀粉酶的DNA序列杂交的DNA序列编码的a-淀粉酶，所述编码特定a-淀粉酶的DNA序列分别示于本申请的SEQIDNO:1、3和5，以及WO95/26397的SEQIDNOS:4和5。同源性(同一性)同源性可测定为两条序列之间的同一性水平，指示第一序列与第二序列的偏差(derivation)。可通过本领域已知的计算机程序例如GCG程序包中提供的GAP(上述的)适当地测定同源性。因此，可使用具有用于同一性的默认得分矩阵(defaultscoringmatrix)和下列默认参数的GapGCGv8:用于核酸序列比较，分别为缺口(GAP)产生罚分5.0和缺口延伸罚分0.3,以及用于蛋白序列比较，分别为缺口(GAP)产生罚分3.0和缺口延伸罚分0.1。GAP使用了Needleman和Wunsch，(1970)，J.Mol.Biol.48,p.443-453的方法进4亍比对和计算同一性。可使用Termamyl和Termamyl-样a-淀粉酶之间的结构对比来鉴定其它Termamyl-样a-淀粉酶中等同的/相应的位置。一种获得所述结构对比的方法是使用GCG程序包中的PileUp程序，该程序使用默认的缺口罚分值，即缺口产生罚分3.0和缺口延伸罚分0.1。其它结构对比方法包括疏水性聚类分析(Gaboriaud等，(1987),FEBSLETTERS224，pp.149-155)和反向穿梭法(reversethreading)(Huber,T;Torda,AE,PROTEINSCIENCEVol.7,No,1pp.142-149(1998))。a-淀粉酶的特性ii)，即可使用针对相关的Termamyl-样a-淀粉酶的至少一个表位产生的、或与之反应的抗体测定免疫交叉反应性。可以是单克隆或多克隆的所述抗体可用本领域已知的方法产生，如Hudson等,PracticalImmunology,第3版(1989),BlackwellScientificPublications中所述的。免疫交叉反应性可使用本领域已知测定法来测定，如蛋白质印迹法或放射免疫扩散，如Hudson等，1989所述。在这方面，在分别具有氨基酸序列SEQIDNOS:2、4、6或8的a-淀粉酶之间发现了免疫交叉反应性。杂交可以在所述a-淀粉酶的完整或部分核苷酸或氨基酸序列的基础上适当地制备寡核苷酸探针，用于鉴定符合上述特性iii)的Termamyl-样a-淀粉酶。用于检测杂交的合适条件包括在5xSSC中预浸泡，并在20%曱酰胺、5xDenhardt's溶液、50mM磷酸钠，pH6.8和50mg变性的经超声处理的小牛胸腺DNA溶液中于40。C预杂交1小时，接着于40。C，在补充有100mMATP的相同溶液中杂交18小时，然后于40。C在2xSSC,0.2%SDS中洗涤滤月莫三次，每次30分钟(低严谨性)，优选于50。C(中等严谨性)，更优选于65。C(高严谨性)，甚至更优选于75。C(非常高严谨性)。有关杂交方法的更多细节可见于Sambrook等，Molecular—Cloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,1989中。在本发明上下文中，"来源于(derivedfrom)，，并不意在只表示由所述生物菌抹产生的或可由所述生物菌抹产生的a-淀粉酶，还表示由分离自这样的菌抹的DNA序列编码的a-淀粉酶以及由所述DNA序列转化的宿主生物产生的a-淀粉酶。最后，该术语还意在表示由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的，并具有所述a-淀粉酶的鉴定特征的a-淀粉酶。该术语还意在表示亲本a-淀粉酶可以是天然存在的a-淀粉酶的变体，即天然存在的a-淀粉酶的一个或多个氨基酸残基的修饰(插入、取代、缺失)所得到的变体。亲本杂合a-淀粉酶亲本a-淀粉酶可以是杂合a-淀粉酶，即包含来源于至少两种a-淀粉酶的部分氨基酸序列组合的a-淀粉酶。亲本杂合a-淀粉酶可以是在氨基酸同源性和/或免疫交叉反应性和/或DNA杂交(如上所定义的)的基础上可被确定为属于Termamyl-样a-淀粉酶家族的一种杂合a-淀粉酶。在该情况下，杂合a-淀粉酶一般由Termamyl-样a-淀粉酶的至少一个部分和一种或多种其它a-淀粉酶的部分组成，所述其它a-淀粉酶选自微生物(细菌或真菌)和/或哺乳动物来源的Termamyl-样a-淀粉酶或非-Termamyl-样a-淀粉酶。因此，亲本杂合a-淀粉酶可包含来源于至少两种Termamyl-样a-淀粉酶，或来源于至少一种Termamyl-样和至少一种非-Termamyl-样细菌a-淀粉酶，或来源于至少一种Termamyl-样和至少一种真菌a-淀粉酶的部分氨基酸序列的组合。部分氨基酸序列所来源的Termamyl-样a-淀粉酶可以是例如本文所提及的任何那些特定的Termamyl-样a-淀粉酶。例如，亲本a-淀粉酶可包含来源于地衣芽孢杆菌菌4朱的a-淀粉酶的C-末端部分，和来源于解淀粉芽孢杆菌菌林或嗜热脂肪芽孢杆菌菌抹的a-淀粉酶的N-末端部分。例如，亲本a-淀粉酶可包含地衣芽3包杆菌a-淀粉酶的C-末端部分的至少430个氨基酸残基，也可包含如a)相应于具有SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶的37个N端氨基酸残基的氨基酸区段(segment)，和相应于具有SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶的445个C末端氨基酸残基的氨基酸区段，或b)相应于具有SEQIDNO:8中所示的氨基酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶的68个N-末端氨基酸残基的氨基酸区段，和相应于具有SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶的415个C-末端氨基酸残基的氨基酸区段。在一个优选的实施方案中，亲本Termamyl-样a-淀粉酶是与SEQIDNO:4中所示的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶相同的杂合Termamyl-样a-淀4分酶，不同之处在于(成熟蛋白的)N-末端的35个氨基酸残基为SEQIDNO:6中所示的解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶(BAN)的成熟蛋白的N-末端的33个氨基酸残基所取代。上述杂合Termamyl-样a-淀粉酶可进一步具有下列突变H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(使用SEQIDNO:4中的编号)，称为LEI74。另一个优选的亲本杂合a-淀粉酶是SEQIDNO:2中所示的LE429。非-Termamyl-样a-淀粉酶可以是例如真菌a-淀粉酶、哺乳动物或植物a-淀粉酶或细菌a-淀粉酶(不同于Termamyl-样a-淀粉酶)。这样的a-淀粉酶的具体例子包括米曲霉(A^ergW^oo;zae)TAKAa-淀粉酶、黑曲霉(Am'ger)酸性a-淀粉酶、枯草芽孢杆菌a-淀粉酶、猪胰腺a-淀粉酶和大麦a-淀粉酶。所有的这些a-淀粉酶都具有已阐明的，与本文所述典型的Termamyl-样a-淀粉酶的结构明显不同的结构。上述真菌a-淀粉酶，即来源于黑曲霉和米曲霉的a-淀粉酶在氨基酸水平上高度同源，一般认为属于相同的a-淀粉酶家族。来源于米曲霉的真菌a-淀粉酶可以商品名FungamylTM从市场上买到。此外，当提及Termamyl-样a-淀粉酶的特定变体(本发明的变体)时，所提及的变体是通过常规的方法，修饰(如缺失或取代)特定Termamyl-样a-淀粉酶的氨基酸序列中的特定氨基酸残基而获得的，应理解在等同位置(由各个氨基酸序列之间可能达到最好的氨基酸序列对比所测定的)修饰得到的另一个Termamyl-样a-淀粉酶的变体也包括在本发明的范围内。本发明变体的一个优选的实施方案是来源于地衣芽孢杆菌a-淀粉酶(作为亲本Termamyl-样a-淀粉酶)的变体，如上述a-淀粉酶中的一个的变体，例如具有SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶的变体。本发明变体的构建可通过在有助于生产变体的条件下，培养包含编码所述变体的DNA序列的微生物来实现目标变体的构建。所述变体可随后从所得到的培养物中回收。这进一步详述于下。改变的特性改变(相对于亲本Termamyl-样a-淀粉酶的特性)之间的关系。本发明的第一方面涉及具有a-淀粉酶活性并包含R437W取代的亲本Termamyl-样a-淀粉酶的变体，其中所述位置相应于具有SEQIDNO:4氨基酸序列的亲本Termamyl-样a-淀粉酶的氨基酸序列的位置。在淀粉液化过程以及其中涉及a-淀粉酶的其他过程中，增加a-淀粉酶的淀粉亲和力并由此增加如生(mw)淀粉水解(RSH)是有利的。本发明人已发现通过在仅具有两个色氨酸之一的ot-淀粉酶的C-末端区域导入色氨酸残基，由此产生一对色氨酸，形成推定的淀粉结合位点，发现其在吸附至淀粉中起主要作用，因而对于高的淀粉转化率是关键性的。应当强调的是不仅以下特别提及的Termamyl-样a-淀粉酶可被使用。而且其他商用Termamyl-样a-淀粉酶也可使用。这样的a-淀粉酶的不太详细的列表如下EP0252666(ATCC27811)中所述的地衣芽孢杆菌菌抹产生的a-淀粉酶，和WO91/00353和WO94/18314中鉴定的a-淀粉酶。其他商用Termamyl-样地衣芽孢杆菌a-淀粉酶是OptithermTM和TakathermTM(可购自Solvay)、MaxamylTM(可购自Gist-brocades/Genencor)、SpezymAATMSpezymeDeltaAATM(可购自Genencor)和Keistase((可购自Daiwa)。但是，只有在C-末端不具有两个色氨酸残基的Termamyl-样oc-淀粉酶能合适地用作为骨架用于制备本发明变体。在本发明一个优选的实施方案中，亲本Termamyl-样a-淀粉酶是SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或它们的变体的a-淀粉酶。在一个具体的实施方案中，所述变体包含一个或多个下列额外的突变R176*、G177*、N190F、E469N，更特别是R176*+G177*+N190F，还特别是R176承+G177氺+N190F+E469N(使用SEQIDNO:6中的编号)。在本发明另一个优选的实施方案中，亲本Termamyl-样a-淀粉酶是SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的杂合a-淀粉酶。特别是，所述亲本杂合Termamyl-样a-淀粉酶可以是包含SEQIDNO:4中所示的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基和SEQIDNO:6中所示的来源于解淀粉芽孢杆菌的成熟的a-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基的杂合a-淀粉酶，其可合适地进一步具有下列突变H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(使用SEQIDNO:4中的编号)。该杂合体称为LE174。LE174杂合体可以与更进一步的突变I201F结合以形成具有以下突变H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(使用SEQIDNO:4的编号)的亲本杂合Termamyl-样a-淀粉酶。该杂合变体如SEQIDNO:2所示，并被用于以下实施例中，称为LE429。当通过结合LE174与突变I201F(SEQIDNO:4编号)，使用LE429(示于SEQIDNO:2)作为主链时(即作为亲本Termamyl-样a-淀粉酶)，突变/改变，特别是取代、缺失和插入，根据本发明可在一个或多个以下位置上进行R176*、G177*、E469N(使用SEQIDNO:6中的编号)。在一个特别的实施方案中，变体包含额外的突变E469N(使用SEQIDNO:6中的编号)。在一个更特别的实施方案中，变体包含额外的突变R1764+G177f+E469N(使用SEQIDNO:6中的编号)。在本发明变体中的常规突变除以上概述的那些修饰之外，最好让本发明的变体包含一个或多个修饰。制备a-淀粉酶变体的方法本领域已知几种将突变导入基因中的方法。在对编码a-淀粉酶的DNA序列克隆的简短讨论之后，将要讨论在编码a-淀粉酶的序列中的特定位点处产生突变的方法。克隆编码a-淀粉酶的DNA序列可使用本领域众所周知的多种方法，从产生所述a-淀粉酶的任何细胞或微生物中分离出编码亲本a-淀粉酶的DNA序列。首先，应使用源自产生待研究之a-淀粉酶的生物的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果a-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成同源的经标记的寡核芬酸探针，并使用该探针从制备自所述生物的基因组文库中鉴定编码a-淀粉酶的克隆。或者，可将含有与已知a-淀粉酶基因同源之序列的经标记的寡核苷酸探针用作探针，使用较低严谨性的杂交和洗涤条件鉴定编码a-淀粉酶的克隆。另一种筌定编码a-淀粉酶的克隆的方法包括将基因组DNA片段插入表达载体，例如质粒，用所得到的基因组DNA文库转化a-淀粉酶-阴性细菌，然后将经转化的细菌铺于含有a-淀粉酶底物的琼脂上，由此使得表达a-淀粉酶的克隆得以鉴定。或者，可通过已建立的标准方法合成制备编码酶的DNA序列，所述方法例如S丄.Beaucage和M.H.Camthers(1981)所述的膦酰胺(phosphoroamidite)法或Matthes等(1984)所述的方法。在膦酰胺法中，可在例如自动化的DNA合成仪中合成寡核香酸，对其进行纯化、退火、连接并克隆至适当的载体中。最终，根据标准技术，DNA序列可以是通过连接合成的，基因组的或cDNA来源的片段(适当时是对应于完整DNA序列的多个部分的片段)而制备的混合的基因组和合成来源，混合的合成和cDNA来源或混合的基因组和cDNA来源的DNA序列。也可以使用特定的引物，例如US4，683，202或位点定向诱变一旦分离出编码a-淀粉酶的DNA序列，并鉴定出期望的突变位点，可使用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有侧接于期望的突变位点的核苷酸序列；在寡核苷酸合成期间插入突变的核苷酸。在一种特定的方法中，在携有a-淀粉酶基因的载体中产生桥连a-淀粉酶-编码序列的DNA单链缺口。然后，使含有期望的突变的合成核香酸与该单链DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)补平其余缺口，并使用T4连接酶连接构建体。该方法的一个特定的例子描述于Morinaga等(1984)。US4,760,025公开了通过对盒进行微小的改变而导入编码多个突变的寡核普酸。但是，由于可导入不同长度的多个寡核苷酸，因此通过Morinaga法可在任何一次导入甚至更多个的突变。Nelson和Long(1989)描述了另一种将突变导入编码a-淀粉酶的DNA序列的方法。所述方法包括以3个步骤产生含有期望的突变的PCR片段，所通过用限制性内切核酸酶裂解，可从PCR-产生的片段中分离出携有突变的DNA片段，并将该片段重新插入表达质粒中。随机请变可在翻译为本文所示氨基酸序列的基因的至少3个部分中，或在整个基因内适当地进行随机诱变，所述诱变可以是定域的(localised)或区域-特异性的随机诱变。利用本领域已知的任何方法，可以方便地对编码亲本a-淀粉酶的DNA序列进行随机诱变。相对于上文，本发明的另一方面涉及一种产生亲本a-淀粉酶的变体的方法，例如，其中相对于亲本，变体显示改变的淀粉亲和力，所述方法包括(a)对编码亲本a-淀粉酶的DNA序列进行随机i秀变，(b)在宿主细胞中表达步骤(a)中获得的突变的DNA序列，和(c)筛选表达相对于亲本a-淀粉酶具有改变的淀粉亲和力的a-淀粉酶变体的宿主细月包。适当的物理或化学诱变剂，通过使用适当的寡核苷酸，或通过对DNA序列进行PCR以产生诱变来进行随机诱变。此外，可使用这些谦变剂的任何组合来进行随机诱变。谦变剂可以是例如诱导转换、颠换(transversion)、倒位、颠倒(scrambling)、缺失和/或插入的试剂。适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-曱基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠(sodiumbisulphite)、曱酸和核苷酸类似物。当使用这样的诱变剂时，一般通过在适于发生诱变的条件下，在选定诱变剂的存在下温育要被诱变的编码亲本酶的DNA序列来进行诱变，然后筛选具有期望的特性的突变DNA。当利用寡核苷酸进行诱变时，在合成要被改变位置处的寡核苷酸的过程中，寡核苷酸可以掺杂或掺入有3种非亲本核苷酸。掺杂或掺入的目的是避免不需要的氨基酸的密码子。可通过任何公开的技术如使用PCR、LCR或在适当时使用任何DNA聚合酶和连接酶，将掺杂(doped)或掺入(spiked)的寡核苷酸掺入编码a-淀粉酶的DNA。优选地，使用"不变的随机掺杂"进行掺杂，其中在每个位置中的野生型和突变的百分比是预先确定的。此外，掺杂可以导致优先导入某些核苷酸，从而优先导入一个或多个特定的氨基酸残基。例如，进行掺杂可使得在每个位置中导入90%野生型和10%突变。选择掺杂方案的其它考虑是基于遗传学以及蛋白质-结构的限制。可使用DOPE程序制订掺杂方案，所述程序可特别地确保避免导入终止密码子。当使用PCR-产生的诱变时，可在增加核苷酸错误掺入的条件下，对经化学处理或未经处理的编码亲本a-淀粉酶的基因进行PCR(Deshler1992;Leung等，Technique,VoU,1989,pp.11-15)。可使用大肠杆菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133,1974，pp.179-191),酿酒酵母或任何其它微生物的增变抹对编码a-淀粉酶的DNA进行随机诱变，诱变方法包括例如将含有亲本糖基化酶的质粒转化到增变抹中，培养含有质粒的增变林，从增变抹中分离突变的质粒。随后，将突变的质粒转化至表达生物中。要被诱变的DNA序列可方便地存在于基因组或cDNA文库中，所述文库制备自表达亲本a-淀粉酶的生物。或者，DNA序列可以存在于适当的载体例如质粒或噬菌体上，可与诱变剂一起温育或要不然暴露于诱变剂中。要被诱变的DNA也可存在于宿主细胞中，或者整合于所述细胞的基因组中，或者存在于细胞所携带的载体上。最后，要被诱变的DNA也可以是分离的形式。很清楚要接受随机诱变的DNA序列优选是cDNA或基因组DNA序列。在某些情况下可在实施表达步骤b)或筛选步骤c)之前方便地扩增突变的DNA序列。可根据本领域已知的方法进行这样的扩增，本发明优选的方法是使用根据亲本酶的DNA或氨基酸序列制备的寡核苷酸引物进行PCR扩增。与诱变剂温育或暴露于诱变剂之后，通过在允许发生表达的条件下培养携有突变DNA序列的适当宿主细胞来表达突变的DNA。用于此目的的宿主细胞可以是已用突变的DNA序列(任选地存在于载体上)转化的宿主细胞，或者是在诱变处理过程中携有编码亲本酶的DNA序列的宿主细胞。适当宿主细胞的例子如下革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌(^^7/w/eWw力、短芽孢杆菌CBac///^Z)rev^)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(5flc/〃wfl/A:<3/o//2//z^)、解淀4分芽孑包才于菌、)疑结芽孑包冲干菌CSac/〃MScoagw/am1)、环状芽孢杆菌(5ac〃/wC7>cw/a"s)、火山烂芽孑包杆菌(i^zc/〃M/aw/M)、巨大芽孑包才干菌(5flc〃/"i1附eg"/en'M柳)、苏云金芽孑包牙干菌(5"c〃/z^//2"n'"g/e"j/力、浅青紫链霉菌(jSW/,omyces//vz'd(my)或鼠灰链霉菌(5Vre/7/函ycesww/m);禾口革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌(Eco//)。突变的DNA序列可进一步包含能使突变的DNA序列表达的DNA序列。定域随机诱变随机诱变可有利地定域于所述亲本a-淀粉酶的一部分。例如，当酶的某些区域已被鉴定为对酶的给定特性特别重要时，以及当预期修饰能导致具有改善特性的变体时，定域随机诱变可能是有利的。当亲本酶的三级结构已被阐明，且所述结构与酶的功能相关时，一般可鉴定出这样的区域。通过使用上述的PCR产生的诱变技术或本领域已知的任何其它适当的插入适当的载体来分离编码要被修饰的DNA序列部分的DNA序列，随后可使用上述任何诱变方法对所述部分进行诱变。提供a-淀粉酶变体的备选方法提供a-淀粉酶变体的备选方法包括本领域已知的基因改组方法，所述方法包括例如WO95/22625(来自AffymaxTechnologiesN.V.)和WO96/00343(来自NovoNordiskA/S)中所述的方法。表达a-淀粉酶变体根据本发明，可使用表达载体，以酶的形式表达通过上述方法，或通过本领域已知的任何其它方法产生的编码变体的DNA序列，所述表达载体通常包括编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号的控制序列，并任选包括阻遏基因或多种激活基因。携有编码本发明a-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是能对其方便地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择常取决于其要被导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，所述载体的复制不依赖于染色体的复制，如质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。或者，载体可以是当导入宿主细胞时，被整合入宿主细胞基因组，并与整合了该载体的染色体一起复制的载体。在载体中，DNA序列应与适当的启动子序列可操作地连接。启动子可与宿主细胞同源或异源之蛋白质的基因。指导编码本发明a-淀粉酶变体之DNA序列转录，尤其是在细菌宿主中的转录的适当启动子的例子是大肠杆菌/ac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌05^印"附>^^￡&0/^)琼脂酶基因dagj启动子、地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因(am;AL)启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)启动子，解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶Om;;0启动子、枯草芽孢杆菌x少M和矽/B基因的启动子等。对于在真菌宿主中转录，有用的启动子的例子是来源于编码下列酶的基因的启动子米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(7^'zo"wcor柳'e/^)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性a-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(Am'^/ara)乙酰胺酵。本发明的表达载体还可含有适当的转录终止子，以及在真核生物中，还可含有与编码本发明ot-淀粉酶变体的DNA序列可操作地连接的聚腺苷酸化序列。终止和聚腺苷酸化序列可适当地来源于与启动子相同的来源。载体可进一步包含能使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。这样的序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和piJ702的复制起点。载体还可含有选4奪标记，例如其产物可以弥补宿主细胞缺陷的基因，如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的^/基因，或能赋予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性例如氨千青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。此外，载体可含有曲霉属选择标记，例如amdS、argB、niaD和sC,产生潮霉素抗性的标记，或者可通过如WO91/17243中所述的共转化来完成的选择。尽管细胞内表达在某些方面(如当使用某些细菌作为宿主细胞时)有利，但一般优选在细胞外表达。一般而言，本文所述的芽孢杆菌属a-淀粉酶包含允许表达的蛋白酶分泌至培养基的前区。必要时，该前区可为不同的前区或信号序列所取代，通过取代编码各个前区的DNA序列可以方便地实现此目的。用于分别连接编码a-淀粉酶变体的本发明DNA构建体、启动子、终止子和其它元件，并将它们插入含有复制所需信息的适当载体的方法是本领域兮支术人员众所周知的(参见例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,1989)。在重组生产本发明的a-淀粉酶变体中，包含上文所定义的本发明DNA通过将编码变体的本发明DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合至宿主染色体中，用所述DNA构建体转化细胞。一般认为整合是有利的，因为整合后DNA序列可以在细胞中更加稳定地维持。根据常规方法，例如通过同源或异源重组可以将DNA构建体整合至宿主染色体中。或者，可用与不同类型的宿主细胞有关的上述表达载体转化细胞。本发明的细胞可以是高等生物的细胞，例如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选其为微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)的细胞。适合的细菌为革兰氏阳性菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性菌例如大肠杆菌。细菌的转化可受例如原生质体转化或以感受态细胞自身已知的方式使用该细胞而影响。酵母生物可优选糖酵母属或裂殖酵母属OSc/n'zcwacc/zaramycay)，例如酿酒酵母(Sacc/2ara"^yc^cereWw'ae)。丝状真菌优选属于曲霉属，例如，米曲霉或黑曲霉。真菌细胞可通过一种方法转化，该方法涉及原生质体形成、原生质体转化、然后细胞壁以其自身已知的方式再生。适合用于曲霉属宿主细胞转化的方法如EP238023所述。在另一方面，本发明涉及一种生产本发明a-淀粉酶变体的方法，该方法包含在有利于变体生产的条件下培养如上所述的宿主细胞以及从细胞和/或培养基中回收变体。用于培养细胞的培养基可以是适于培养所述宿主细胞以及获得本发明a-淀粉酶变体表达的任何常规培养基。适当的培养基可从供应商处购得，或者可根据公开的配方(例如美国典型培养物保藏中心目录中所述的)制备。通过众所周知的方法，包括通过离心或过滤分离培养基与细胞，利用诸如硫酸铵等盐沉淀培养基中的蛋白质成分，接着通过利用层析法(chromatography),例如离子交换层析，亲和层析等，可以从培养基中方便地回收宿主细胞分泌的a-淀粉酶变体。工业应用本发明的a-淀粉酶变体具有能进行多种工业应用的有价值的特点。具体来说，本发明酶变体适于作为洗衣、碗碟清洗、硬表面清洗的洗涤剂组合物的成分来应用。尤其是淀粉液化(参见例如US3,912,590,EP专利申请号252730和63909，WO99/19467,以及WO96/28567，所有文献在此并入作为参考)。还涉及的是用于淀粉转化目的的组合物，其除本发明变体之外，还可包含葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和其他a-淀粉酶。此外，本发明的变体还特别用于由淀粉或整谷物/谷粒(wholegrain)生产增甜剂和乙醇(参见例如US专利号5,231,017,在此并入作为参考)，例如燃料、酒类和工业乙醇。本发明的变体还可用于纺织品(textile)、织物(fabric)或衣物的退浆(参见例如WO95/21247,US专利4,643,736,EP119,920，在此并入作为参考)、啤酒生产或酿造、纸浆和纸生产以及饲料和食品生产。淀粉转化常规的淀粉转化处理例如液化核糖化处理描述于如US专利号3,912,590和EP专利申请号252,730和63,909中,在此并入作为参考。在一个实施方案中，将淀粉降解为低分子量的碳水化合物成分例如糖或脂肪代用品的淀粉转化处理包括脱支步骤。淀粉至糖的转化在将淀粉转化为糖的情况下，淀粉被解聚。这样的解聚处理由预处理步骤和两或三步的连续处理步骤(即液化处理、糖化处理和取决于所需最终产物任选的异构化处理)组成。天然淀粉的预处理天然淀粉由显微镜下可见的颗粒组成，所述颗粒在室温下不溶于水。当加热淀粉浆水溶液时，颗粒膨胀并最终爆裂，将淀粉分子分散在溶液中。在该"凝胶化，，处理过程中，粘度急剧增加了。由于在工业过程中一般固体含量为30-40%，因此淀粉必须变稀或"液化"，以使得其能易于处理。现今，降低粘度主要通过酶促降解进行。液化在液化步骤过程中，使用a-淀粉酶长链淀粉降解为支链和线性的短单元(麦芽糖糊精)。液化处理在105-110°C下进行5-10分钟，然后在95。C下进行l-2小时。pH在5.5-6.2之间。为了在这些条件下确保最佳的酶稳定性，添加1mM4丐(40ppm游离4丐离子)。在该处理后，液化的淀粉应具有10-15的"糖化率，，(DE)。糖化在液化处理后，通过添加葡糖淀粉酶(如AMG)和诸如异淀粉酶(US专利号4,335,208)或支链淀粉酶(如Promozyme)(US专利号4,560,65l)的脱支酶将麦芽糖糊精转化为葡萄糖。在该步骤之前，将pH降低到低于4.5,保持高温(高于95。C)以失活液化的oi-淀粉酶，以减少称为"潘糖前体，，的短寡糖形成，所述"潘糖前体"无法为脱支酶所完全水解。将温度降低到60°C，并添加葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化处理持续进行24-72小时。正常地，当在液化步骤后变性a-淀粉酶时，约0.2-0.5%的糖化产物是无法为支链淀粉酶所降解的支链三糖6、a-葡糖基麦芽糖(潘糖)。如果在糖化过程中，来自液化步骤的活性淀粉酶存在(即不变性)，则该水平可高达1-2%，其是极其不期望的，因为其明显降低了糖化率。异构化当期望的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，可将葡萄糖糖浆转化为果糖。在糖化处理后，将pH增加到6-8，优选pH7.5,并通过离子交换除去钙。然后使用例如固定化的葡糖异构酶(例如SweetzymeTMlT)将葡萄糖糖浆转化为高果糖糖浆。乙醇生产一般而言，由整谷物/谷粒生产乙醇(酒精)可分成4个主要的步骤-研磨-液化-糖化-发酵研磨研磨谷粒以便打开其结构并供进一步处理。所用到的两种处理是湿磨或干磨。在干磨中，完整的谷粒(kernel)被研磨并用于处理的剩余步骤中。湿磨提供了十分良好的胚和粗粉(meai)(淀粉粒和蛋白质)的分离，有些例外的是可用于糖浆的并行生产。液化在液化处理中，通过水解为麦芽糖糊精使淀粉粒溶解，大部分的DP高于4。可通过酸处理或a-淀粉酶酶催化进行水解。酸水解在受限的基础上使用。原料可以是磨碎的整谷物/谷粒后来自淀粉处理的侧线馏分(sidestream)。酶促液化通常以三步热淤浆(hotslmry)法来进行。将淤浆加热至60-95。C，优选80-85。C,并添加酶。然后在95-140。C喷射(jet-cooked)加热淤浆，优选105-125。C,冷却至60-95。C，并添加更多的酶以获得最终的水解。液化处理在pH4.5-6.5下进行，通常在pH5-6下进行。磨碎的和液化的谷粒也称为醪液(mash)。糖化为产生酵母能代谢的低分子量糖类DPw,来自液化的麦芽糖糊精应进一步水解。一般通过葡糖淀粉酶酶催化进行水解，或者可以使用a-葡糖苷酶或酸性a-淀粉酶。完全的糖化步骤可延续72小时，但是，所共有的预糖化通常只进行40-90分钟，然后在发酵过程(SSF)中完成糖化。糖化一般在30-65。C的温度和pH4.5下进行，通常在60。C左右进行。发酵将通常来自糖酵母属菌种的酵母添加到醪液中，并发酵24-96小时，例如通常发酵35-60小时，温度在26-34。C，通常在约32。C，以及pH为pH3-6，优选pH4-5左右。注意到广泛使用的处理是同时进行糖化和发酵(SSF)处理，其中对于糖化来说没有保温(holding)阶段，意味着酵母和酶要同时添加。当在高于50。C的温度下引入预糖化步骤是进行SSF所共有的之时，只要在发酵之前同时添加酵母和酶即可。蒸馏发酵后蒸馏醪液以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作为例如燃料乙醇；饮料乙醇即饮料酒精；或工业乙醇。副产品发酵中留下的是谷物/谷粒，其通常以液体形式或干燥形式用作为动物饲料。本领域技术人员众所周知关于如何进行液化、糖化、发酵、蒸馏和乙醇回收的更多细节。根据本发明的方法，糖化和发酵可同时或独立进行。纸浆和纸生产本发明的碱性a-淀粉酶还可用于由淀粉加固(starchreinforced)的废纸和纸板生产木质纤维(lignocellulosic)材料，例如纸浆、纸和纸板，特别是其中在高于7的pH下进行再制浆，并且淀粉酶通过降解加固淀粉而促进废料的分解。本发明的a-淀粉酶能特别用于由涂有浆糊的印刷纸生产造纸纸浆的处理。该处理可如WO95/14807中所述的进行，包括以下步骤a)分解(disintegrating)纸以产生纸浆，b)在步骤a)之前、过程中或之后，用淀粉降解酶处理，和c)在步骤a)和b)之后，将油墨(ink)颗粒与纸浆分离。本发明的-a-淀粉酶还可特别用于改性淀粉，其中酶促改性的淀粉与诸如碳酸钓、高岭土(kaolin)和粘土的碱性填料一起用于造纸。使用本发明的碱性ct-淀粉酶，有可能在填料存在下改性淀粉，从而可供更简单的综合工艺使用。纺织品、织物或衣物的退浆在纺织品、织物或衣物退浆中，本发明的a-淀粉酶还可以是十分有用的。在纺织加工工业中，在退浆处理中oc-淀粉酶通常用作为助剂以促进在确保要在随后织物被洗炼(scoured)、漂白和染色的处理中获得最好的结果，重要的是在织布后要完全除去胶料涂层。优选的是酶促淀粉分解，因为其对纤维材料不产生任何有害影响。为了降低加工成本并增加工厂生产量，退浆处理往往与洗炼和漂白步骤结合进行。在这样的情况下，非酶助剂例如碱化剂或氧化剂通常用于分解淀粉，因为传统的a-淀粉酶与高pH水平及漂白剂并不非常相容。由于使用了具有相当侵蚀性的化学品，淀粉胶料的非酶分解导致了一些纤维损伤。因此，期望使用本发明的a-淀粉酶，因为它们在碱性溶液中具有改善的特性。当退浆含有纤维素的织物或纺织品时，a-淀粉酶可单独或与纤维素酶结合使用。退浆和漂白处理是本领域众所周知的。例如，这样的处理描述于WO95/21247、US专利4,643,736、EP119,920中，在此并入作为参考。用于退浆的市售产品包括来自NovozymesA/S的AQUAZYME⑧和AQUAZYMEULTRA。啤酒生产在啤酒生产过程中，本发明的a-淀粉酶还是十分有用的；a-淀粉酶一般在淀粉糖化过程中添加。洗涤剂组合物可添加本发明的a-淀粉酶，并因此成为洗涤剂组合物的成分。本发明的洗涤剂组合物可例如配制为手洗或机洗衣服的洗涤剂组合物，包括适于染色织物预处理的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物柔顺剂组合物，或可配制为用于一般家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或可配制用于手洗或机洗碗碟操作。在一个特定的方面，本发明提供了包含本发明的酶的洗涤添加剂。所述洗涤添加剂以及洗涤剂组合物可包含一种或多种其他的酶，例如蛋白酶，脂肪酶，过氧化物酶，不同的(another)淀粉分解酶，如不同的(another)a-淀粉酶、葡糖淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、CGT酶(CGTase)和/或纤维素酶、甘露聚糖酶(例如来自Novozymes，Denmark的MANNAWAYTM)、果胶酶、果胶裂解酶、角质酶(cutinase)和/或漆酶。一般而言，所选择的酶的特性应与所选择的洗涤剂相容(即在最适pH下与其他酶或非酶成分相容等)，并且所述酶应以有效量存在。蛋白酶适合的蛋白酶包括那些动物、植物或微生物来源的蛋白酶。微生物来源的蛋白酶是优选的。包括化学改性或蛋白质工程化的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶，特别是那些来源于芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(如猪或牛来源的)以及WO89/06270和WO94/25583中描述的镰孢属(Fwan'wm)蛋白酶。有用的蛋白酶的例子是WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的变体，特别是在一个或多个以下位置具有取代的变体27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。优选的市售蛋白酶包括ALCALASE、SAVINASE、PRIMASE、DURALASE、ESPERASE和KANNASE(来自NovozymesA/S)，MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、PROPERASE、PURAFECT、PURAFECTOXP、FN2、FN3、FN4(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶适合的脂肪酶包括那些细菌或真菌来源的脂肪酶。包括化学改性或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的例子包括来自腐质霉(//mw/co/g)(同义词77ze;^ow少cey)的脂肪酶，如来自EP258068和EP305216中所述的//,/画g/卿a(7:/fl聽g/"osM)的脂肪酶，或来自WO96/13580中所述的//./rao/era的脂肪酶，假单胞菌属(尸"^fomo，力脂肪酶，如来自产碱假单胞菌CP/^//^"&)或类产石成假单胞菌(户/wewcfoa/ca/Zge"")(EP218272)、洋葱假单胞菌CPce;ac/a)(EP331376)、施氏假单胞菌(PWwteen;j(GB1,372,034)、荧光假单胞菌CRyZMore"ms)、假单胞菌菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)、Pw^cora/werak(WO96/12012)的月旨肪酶，芽孢杆菌属脂肪酶，如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993),BiochemicaetBiophysicaActa,1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pw脂7w》(WO91/16422)的脂肪酶。其他的例子是脂肪酶变体，例如那些描述于WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中的。优选的市售脂肪酶包括LIPOLASE和LIPOLASEULTRATM(NovozymesA/S)。淀粉酶适合的淀粉酶(a和/或p)包括那些细菌或真菌来源的淀粉酶。包括化学改性或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括，例如获得自芽孢杆菌，如详述于GB1,296,839中的地衣芽孢杆菌的特定菌抹的a-淀粉酶。有用的a-淀粉酶的例子是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的变体，特别是在一个或多个以下位置具有取代的变体15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。市售a-淀粉酶是DURAMYLTM、LIQUEZYMETM、TERMAMYLTM、NATALASE'm、SUPRAMYL'M、STAINZYME、FUNGAMYLiM和BANTM(NovozymesA/S),RAPIDASE、PURASTAR和PURASTAROXAMTm(来自Ge腿corInternationalInc.)。纤维素酶适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。包括化学改性或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属(Z/wmZco/a)、镰孢属(Fi^an^m)、梭孢壳属(77z/e/aWa)、枝顶孢属04cremom'ww)的纤维素酶，例如US4,435,307、US5,648，263、US5,691,178、US5，776，757和WO89/09259中所披露的//m,'co/"/rao/ews、p者热皇殳丝霉(_/V^ce//op/^/2or<a^zermop/z〃a)禾口尖孑包镰孑包(Fwan,Mmox，/orz/w)产生的真菌纤维素酶。特别适合的纤维素酶是具有颜色护理效果的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是描述于EP0495257、EP0531372、W096/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纤维素酶。其他例子是诸如WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些的纤维素酶变体。市售纤维素酶包4舌CELLUZYME⑧和CAREZYME(NovozymesA/S)，CLAZINASE和PURADAXHA(GenencorInternationalInc.)以及KAC-500(B)(KaoCorporation)。过氧化物酶/氧化酶适合的过氧化物酶/氧化酶包括那些植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。包括化学改性或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的例子包括如WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所迷的来自鬼伞(Coprinus),如来自灰盖鬼伞(C.c/"erew力的过氧化物酶及其变体。市售过氧化物酶包括GUARDZYME(NovozymesA/S)。通过添加含有一种或多种酶的分离的添加剂或通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂，可将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤添加剂即分离的添加剂或组合的添加剂可配制成例如颗粒、液体、淤浆等。优选的洗涤添加剂配方是颗粒状的，特别是无粉尘(non-dusting)颗粒，液体的，特别是稳定液体或淤浆的。可例如US4,106,991和4,661,452中所披露的生产无粉尘颗粒，并可任选地通过本领域已知的方法进行包被。蜡涂层材料的例子是具有1000-20000平均分子量的聚(环氧乙烷)(ethyleneoxide)制品(聚乙二醇，PEG);既有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬酚；其中醇含有12-20个碳原子以及存在15-80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪族醇；脂肪族醇；脂肪酸和脂肪酸甘油单酯、二酯和三酯。在GB1483591中给出了适用于流化床技术的成膜涂层材料的例子。#4居所确定的方法，液体酶制剂可以例如通过添加诸如丙二醇的多元醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。可根据EP238,216中所4皮露的方法制备保护的酶。本发明的洗涤剂组合物可以任何方便的形式存在，如条、片、粉末、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般包含高达70%水和0-30%有机溶剂，或是不含水的。洗涤剂组合物包含可以是非离子型表面活性剂的一种或多种表面活性剂，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子型表面活性剂。按重量计算表面活性剂通常以0.1%-60%的水平存在。当包括在其中时，洗涤剂应通常含有约1%至约40%的阴离子型表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐/酯(alkylbenzenesulfonate)、a-烯属磺酸盐/酯、烷基硫酸盐/S旨(alkylsulfate)(脂肪醇硫酸盐/酯(fattyalcoholsulfate))、脂肪醇乙氧基石克酸盐/酯(alcoholethoxysulfate)、仲烷基石黄酸盐/酯(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸曱酯(sulfofattyacidmethylester)、烷基或烯基琥珀酸或脂肪酸盐(soap)。当包括在其中时，洗涤剂(detergent)应通常约0.2%至约40%的非离子型表面活性剂，例如脂肪醇乙氧基化物、壬酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二曱胺化氧化物(alkyldimethylamine-oxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanol-amide)、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡萄糖胺("葡糖胺")的N-酰基N-烷基衍生物。洗涤剂可含有0-65。/。的洗涤增效助剂(builder)或络合剂，例如沸石、二磷酸盐/酯、三磷酸盐/S旨、膦酸盐/酯(phosphonate)、碳酸盐/酯、柠檬酸盐/酯、次氮基三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五醋酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐/西旨或分层(layered)硅酸盐/S旨(如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子是羧曱基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、诸如的聚丙烯酸酯的聚羧化物(polycarboxylates)、马来酸/丙烯酸共聚物以及甲基丙烯酸月桂酯/丙晞酸共聚物。洗涤剂可含有漂白体系，所述漂白体系可包含诸如过硼酸盐/酯或过碳酸盐/酯的&02源，所述氏02源可与诸如四乙酰基乙二胺或壬酰基羟笨磺酸盐/酯(nonanoyloxyben-zenesul-fonate)的过酸形成的漂白活化剂结合。或者，漂白体系可包含例如酰胺、二酰亚胺或石风型过氧酸。可使用常规稳定剂稳定本发明洗涤剂组合物的酶，所述常规稳定剂例如诸如丙二醇或甘油的多元醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物例如4-曱酰苯基硼酸以及可配制的组合物，如WO92/19709和WO92/19708中所述的。洗涤剂还可含有其他常见的洗涤剂成分，例如包括粘土的织物调节剂、发泡剂(foamboosters)、抑泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、防污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂或香料。预计任何酶都能存在于洗涤剂组合物中，特别是本发明的酶，可以相应于每升洗涤液0.001-100mg酶类蛋白质的量添加，优选以每升洗涤液0.005-5mg酶类蛋白质，更优选以每升洗涤液0.01-1mg酶类蛋白质，以及特别是以每升洗涤液0.1-1mg酶类蛋白质的量添加。本发明的酶可额外地掺入到WO97/07202中披露的洗涤剂配方中，其在此并入作为参考。碗碟清洗洗涤剂组合物本发明的酶还可用于碗碟清洗洗涤剂组合物中，包括以下1)粉末自动碗碟清洗组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>2)粉末自动碗碟清洗组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>3)粉末自动碗》莱清洗组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>4)粉末自动碗碟清洗组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>6)带有清洁表面活性剂体系的粉末和液体碗碟清洗组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>8)非水液体碗碟清洗组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>)9)触变性液体自动碗碟清洗组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>11)含有保护的漂白粒子的液体自动碗碟清洗组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>12)如1)、2)、3)、4)、6)和IO)中所述的自动碗碟清洗组合物，其中过硼酸盐/酯为过碳酸盐/酯所取代。13)如l)-6)中所述的自动碗碟清洗组合物，其还含有锰催化剂。锰催4匕剂可例^口是"Efficientmanganesecatalystsforlow-temperaturebleaching",Nature369，1994，pp.637-639.中描述的化合物的一种。原料和方法酶LE174:杂合a-淀粉酶LE174是一种杂合Termamyl-样a-淀粉酶，除N-末端35个氨基酸残基(成熟蛋白的)已为BAN(成熟蛋白)(即SEQIDNO:6所示的解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶)的N-末端33个残基所取代之外，其与Termamyl序列(即SEQIDNO:4所示的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶)一致，其进一步具有以下突变H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S(SEQIDNO:4).LE429杂合a-淀4分酶变体LE429是一种杂合Termamyl-样a-淀粉酶，除N-末端35个氨基酸残基(成熟蛋白的)已为BAN(成熟蛋白)(即SEQIDNO:6所示的解淀粉芽孢杆菌oc-淀粉酶)的N-末端33个残基所取代之外，其与Termamyl序列(即SEQIDNO:4所示的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶)一致，其进一步具有以下突变H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(SEQIDNO:4)。LE429示于SEQIDNO:2,并通过SOE-PCR(Higuchi等1988,NucleicAcidsResearch16:7351)构建。来源于黑曲霉的葡糖淀粉酶具有示于WOOO/04136中的氨基酸序列，如SEQIDNo:2或所披露的变体之一。来源于黑曲霉的酸性真菌a-淀粉酶。底物获得自Sigma-Aldrich的小麦淀粉(S-5127)。发酵和a-淀粉酶变体的纯化在来自-80°C储存的具有10吗/ml卡那霉素的LB-琼脂平板上划线接种携有相关的表达质粒的枯草芽孢杆菌菌抹，并在37°C下培养过夜。将克隆转移入在500ml摇瓶中的补充有10fig/ml卡那霉素的100mlBPX培养基中。BPX培养基成分马铃薯淀粉100g/1大麦粉50g/1BAN5000SKB0.1g/1酪蛋白酸钠10g/1大豆粉20g/1Na2HP04，12H209g/1Pluronic0.1g/1培养物在37。C下以270rpm振荡培养5天。通过以4500rpm离心20-25分钟，从发酵培养液中除去细胞和细胞碎片。之后过滤上清液以获得完全清澈的溶液。在UF-过滤器(10000截留分子量膜)上浓缩并洗涤滤液，并将缓冲液改变为20mM醋酸，pH5.5。将UF-滤液加在S-sepharoseF.F.上，通过使用在相同緩冲液中的0.2MNaCl—步洗脱来进行洗脱。对10mMTris,pH9.0透析洗脱物并加在Q-sepharoseRF.上,用超过6倍柱体积的0-0.3MNaCl的线性梯度进行洗脱。汇集含有活性(通过Phadebas测定法测定的)的级分，调节pH至pH7.5并在5分钟内通过用0.5%W/V活性炭处理除去残留的颜色。活性测定(KNU)可使用马铃薯淀粉作为底物测定淀粉分解活性。该方法是基于用酶分解改性马铃薯淀粉，并接着通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合进行反应。最初，与有色玻璃标准相比，出现稍黑的蓝色，但在淀粉分解过程中，蓝色变浅并逐渐地变为红棕色。1000个Novoa淀粉酶单位(KNU)规定为在标准条件(即在37。C+/-0.05;0.0003MCa2+;和pH5.6)下，糊精化5.26g淀粉干物质——Merck可溶性淀4分(Amylumsolubile)的S^的"f:。文件夹AF9/6更详细地描述了该分析方法，函索NovozymesA/S，Denmark即可获得，该文件夹在此并入作为参考。葡糖淀粉酶活性(AGU)l个Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)规定为在37。C和pH4.3下，每分钟水解l微摩尔麦芽糖的酶的量。通过在使用来自BoehringerMannheim,124036的葡萄糖GOD-Perid试剂盒之后改良的方法(AEL-SM-0131,函索Novozymes即可获得)将该活性确定为AGU/ml。标准AMG-标准，批号7-1195,，195AGU/ml。375pL底物(在50mM醋酸钠，pH4.3中的l。/。麦芽糖)在37。C下温育5分钟。添加在醋酸钠中稀释的25j^L酶。在10分钟后通过添加100(iL0.25MNaOH停止反应。将20^L转移到96孔微量滴定板中，并添加200(iLGOD-Perid溶液(124036，BoehringerMannheim)。在室温下30分钟后，在650nm处测定吸光度，并根据AMG-标准以AGU/ml计算活性。更详细地描述该分析方法的文件夹(AEL-SM-0131)函索NovozymesA/S,Denmark即可获得，该文件夹在此并入作为参考。酸性a-淀粉酶活性(AFAU)酸性a-淀粉酶活性可以以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶单位)测定，其中是相对于酶标准进行测定的。所使用的标准是AMG300L(来自NovozymesA/S，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉Gl,也披露于Boel等(1984),EMBOJ.3(5)，p.1097-1102和WO92/00381中)。在该AMG中的中性a-淀粉酶在室温下贮藏3周后从大约1FAU/mL降低到低于0.05FAU/mL。才艮据以下描述测定该AMG标准中的酸性a-淀粉酶活性。在该方法中，1AFAU规定为在标准条件下，每小时降解5.26mg淀粉干物质固形物(drysolids)的酶的量。碘与淀粉形成蓝色络合物，但不与其降解产物形成蓝色络合物。因此，颜色强度与淀粉浓度成正比。使用在指定分析条件下作为淀粉浓度减少的逆比色法测定淀粉酶活性。a-淀粉酶淀粉+碘糊精+寡糖40。C,pH2.5蓝色/紫色t-23秒.脱色标准条件/反应条件(每分钟)底物淀粉，大约0.17g/L緩冲液柠檬酸盐，大约0.03M碘(12):0.03g/LCaC12:1.85mM2.50-0.05X=590nm酶浓度:0.025AFAU/mL酶工作范围0.01-0.04AFAU/mL更多细节优选这些能见于函索NovozymesA/S即可获得的EB-SM-0259.02/01中的，在此并入作为参考。糖分布和溶解的干固形物的测定通过HPLC测定淀粉水解产物的糖成分，随后计算葡萄糖产率为DX.。BRIX，并通过折光率(refractiveindex)测定法测定淀粉水解产物的溶解(可溶)干固形物。a-淀粉酶活性的测定通过使用Phadebas⑧药片作为底物的方法测定a-淀粉酶活性。Phadebas药片(Phadebas⑧淀粉酶检验标准，提供自PharmaciaDiagnostic)含有交联的不溶性蓝色淀粉聚合物，其已与牛血清白蛋白和緩冲物质混合并压片。对于每一次测定，将一片悬浮于含有5ml50mMBritton-Robinson緩冲液(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mMCaCl2,用NaOH调节pH至所需值)的试管中。于所需温度下在水浴中进行该测试。在xml的50mMBritton-Robinson緩冲液中稀释要被测试的a-淀粉酶。将1ml该a-淀粉酶溶液添力卩到5ml50mMBritton-Robinson緩冲液中。通过a-淀粉酶释放出可溶的蓝色片段水解淀粉。在620nm处用分光光度计测定所得到的蓝色溶液的吸光度，其是a-淀粉酶活性的函数。重要的是在10-15分钟的温育(测试时间)后测定的620nm吸光度要在0.2-2.0的620nm处吸光度单位范围内。在该吸光度范围内，在活性和吸光度之间存在线性(朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律)。因此应调节酶的稀释以适合该标准。在给定的一组条件(温度、pH、反应时间、緩沖液条件)下，lmg给定的a-淀粉酶应水解一定量的底物并会产生蓝色。在620nm处测定颜色强度。在给定组的条件下，所测定的吸光度与所述a-淀粉酶的比活性(纯的a-淀粉酶蛋白的每毫克活性)成正比。测定比活性使用Phadebas测定法(Pharmacia)测定比活性为活性/毫克酶。测定。H活性分布(pH稳定性)将变体贝i藏在20mMTRISpH7.5，0.1mM,CaCl2中,并在30°C下，50mMBritton-Robinson,0.1mMCaCl2中测试。使用上述Phadebas测定法，在pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0(9.5)、9.5、10和10.5下测定pH活性。实施例实施例1构建Termamyl变体LE429在枯草芽孢杆菌中由称为pDN1528的质粒表达Termamyl(地衣芽孢杆菌a-淀粉酶SEQIDN0:4)。该质粒含有编码Termamyl的完整基因，其表达受其自己的启动子所指导。此外，该质粒含有来自于质粒pUB110的复制起点on',和赋予对氯霉素抗性的来自于质粒pC194的caf基因。pDN1528示于WO96/23874的图9中。制备一种含有SEQIDNO:3编码区主要部分的特定的诱变载体。称为pJeENl的该载体的主要特征包括来自于pUC质粒的复制起点，赋予对氯霉素抗性的基因以及Wfl基因的含有移码的变型，其野生型通常赋予对氨千青霉素的抗性(ampR表型)。该突变型产生ampS表型。质粒pJeENl示于WO96/23874的图10中，大肠杆菌复制起点。".、亂ca、Termamyl淀粉酶基因的5'-截短变型以及所选择的限制酶切位点指示在质粒上。除具有掺入的"选择引物"(引物#6616，参见以下)的质粒是基于含有具有修复的Wa基因的质粒转化的大肠杆菌细胞ampK表型进行选择，而不使用Deng和Nickoloff所一既述的限制性内切酶消化选4奪之外，通过Deng和Nickoloff(1992,Anal.Biochem.200,pp.81-88)所述的方法将突变导入amy丄。用于该诱变的化学品和酶获得自Stratagene的Chameleon(!)诱变试剂盒(目录号200509)。在检验变体质粒中的DNA序列之后，将含有期望的改变的截短的基因作为尸Wl-五coRI片段亚克隆入pDN1528，并转化入蛋白酶-和淀粉酶-缺失的枯草芽孢杆菌菌抹SHA273(描述于W092/11357和WO95/10603)中，以便表达变体酶。通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体V54W:通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体A52W+V54W:NO:10)引物#6616(5'到3'从左到右书写；P表示5'磷酸)通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体V54E:PGGTCGTAGGCACCGTAGCCCTCATCCGCTTG(SEQIDNO:12)通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体V54M:通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体V54I:通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体Y290E和Y290K:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>Y表示C和T的等量混合。通过DNA测序验证编码第290位的谷氨酸或赖氨酸的密码子的存在。通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体N190F:通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体N188P+N190F:PCATAGTTGCCGAATTCAGGGGAAACTTCCCAATC(SEQIDNO:17)通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体H1概+H142D:(SEQIDNO:18)通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体I-I156Y:PCAAAATGGTACCAA丁ACCACTTAAAATCGCTG(SEQIDNO:19)通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体A181T:通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体A209V:PCTTAATTTCTGCTACGACGTCAGGATGGTCATAATC(SEQIDNO:21)通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体Q264S:PCGCCCAAGTCATTCGACCAGTACTCAGCTACCGTAAAC(SEQIDNO:22)通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体S187D:通过使用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体DELTA(K370-G371-D372)(即缺失氨基酸残基370、371和372):PGGAATTTCGCGCTGACTAGTCCCGTACATATCCCC(SEQIDNO:24)通过4吏用以下诱变引物(5'到3'从左到右书写)构建Termamyl变体DELTA(D372-S373陽Q374):PGGCAGGAATTTCGCGACCTTTCGTCCCGTACATATC(SEQIDNO:25)通过用切割pDN1528-样质粒两次产生1116bp片段和3850bp载体部分(即含有质粒复制起点)的限制性内切酶C/gI消化含有A1WT的pDNl528-样质粒(即在flmy丄中含有引起A181T改变的突变的pDN1528)和含有A209V的pDN1528-样质粒(即在awy丄中含有引起A209V改变的突变的pDN1528),将Termamyl变体A181T和A209V结合为A181T+A209V。在琼脂糖凝胶上分离后，通过QIAquick凝胶抽提试剂盒(购自QIAGEN)纯化含有A209V突变的片段和含有A181T突变的载体部分。连接片段和载体并转化入上述提及的蛋白酶和淀粉酶缺失的枯草芽孢杆菌菌抹。对来自aw少+(在含有淀粉的琼脂平板上亮区)和氯霉素抗性的转化体的质粒分析质粒上两种突变的存在。以类似于上述的方法，使用限制性内切酶Acc651和EcoRI结合HI56Y和A209V，给出H156Y+A209V。通过使用限制性内切酶Acc651和HindIII将H156Y+A209V和A181T+A209V结合为H156Y+A181T+A209V。利用SOE-PCR方法(Higuchi等1988，NucleicAcidsResearch16:7351),Termamyl变体H156Y+A181T+A209V成熟部分的35个N-末端残基被解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶(SEQIDNO:4)(在本发明上下文中称为BAN)的33个N-末端残基所取代，如下引物19364(序歹'〗5,-3,):CCTCATTCTGCAGCAGCAGCCGTAAATGGCACGCTG(SEQIDNO:26)引物19362:CCAGACGGCAGTAATACCGATATCCGATAAATGTTCCG(SEQIDNO:27)引物19363:CGGATATCGGTATTACTGCCGTCTGGATTC(SEQIDNO:28)引物1C:CTCGTCCCAATCGGTTCCGTC(SEQIDNO:29)根据厂商的说明书，使用来自BoehringerMannheim的Pwo耐热聚合酶进行标准PCR(聚合酶链反应)，温度循环94。C5分钟，25个循环(94。C30秒、50。C45秒、72。C1分钟)，72。C10分钟。在称为PCR1的第一次PCR中，使用引物19364和19362，对含有编码解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶的基因的DNA片段扩增出大约130bp片段。在称为PCR2的另一次PCR中，使用引物19363和1C，对模板pDN1528扩增出大约400bp片段。PCR1和PCR2纯化自琼脂糖凝胶并在使用引物19364和1C的PCR3中被用作为模板，得到大约520bp的片段。因此，该片段含有融合至编码从第35个氨基酸起的Termamy的DNA的一部分的编码来自BAN的N-末端的DNA的一部分。通过用限制性内切酶Pstl和SacII消化、连接并如先前所述的转化枯草芽孢杆菌菌抹，将520bp片段亚克隆入pDN1528-样质粒(含有编码Termamyl变体H156Y十A181T+A209V的基因)中。通过在提取的来自a77^+和氯霉素抗性转化体的质粒中进行DNA测序验证在限制酶切位点尸WI和SacII之间的DNA序列。最终的构建体含有来自BAN的正确N-末端和H156Y+A181T+A209V，称为BAN(1-35)+H156Y+A181T+A209V。除pJeENl中的am;;丄序列为编码Termamyl变体BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V的DNA序列所取代之外，通过如上所述进行诱变，将N190F与BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V结合，给出BAN(l-35)+H156Y+A181T+N1卯F+A209V。除pJeEN中的amyL序列为编码Termamyl变体BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V的DNA序列所取代之外，通过如上所述进行诱变，将Q264S与BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V结合，给出BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V+G264S。利用限制性内切酶i^aHI(在A209V突变附近导入份aHI位点)和PWl，将BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V+Q264S和BAN(l-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V结合入BAN(l-35)+H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S。通过如上所述进行诱变，将I201F与BAN(l-35)+H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S结合，给出BAN(l-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(SEQIDNO:2)。使用诱变引物AM100,导入I201F取代并同时除去Clal限制酶切位点，其利于容易鉴别突变。引物AM100:5,GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC3，(SEQIDNO:30)实施例2构建具有改变的淀粉亲和力的Termamyl-样a-淀粉酶变体构建LEI153(LE429+R437W):通过PCR，使用结合淀粉酶基因下游的载体引物CAAX37和诱变引物CAAX447扩增来自pDN1528-样质粒(在编码来自SEQIDNO:4的淀粉酶的的大约450bpDNA片l爻。450bp片段纯化自琼脂糖凝胶并用作为大(mega)引物与引物IB—起对相同的模板进行在第二PCR。用限制性内切酶PstI和AvrII消化所得到的大约1800bp片段，纯化所得到的大约1600bpDNA片段并与用相同的酶消化的pDN1528-样质粒连接。用连接和氯霉素抗性的转化体转化感受态枯草芽孢杆菌SHA273(低淀粉酶和蛋白酶)细胞，并通过DNA测序检查以验证质粒上正确突变的存在。引物CAAX37:5，CTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGC3,(SEQIDNO:31)引物IB:5，CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC3，(SEQIDNO:32)引物CAAX447:5，CCCGGTGGGGCAAAGTGGATGTATGTCGGCCGG3，(SEQIDNO:33)构建LEI154:除使用两种诱变引物CAAX447和CAAX448之外，以类似的方法构建BAN/Termamyl杂合+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+[R437W+E469N]。引物CAAX448:5'CGGAAGGCTGGGGAAATTTTCACGTAAACGGC3'(SEQIDNO:34)实施例3构建具有改变的淀粉亲和力的BAN-样a-淀粉酶变体(R176*+G177*)BAN(解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶SEQIDNO:6)由类似于描述于实施例1中的pDN1528的质粒在枯草芽孢杆菌中表达。该称为pCA330-BAN的BAN质粒含有取代限定为SEQIDNO:4中的氨基酸1-483的编码地衣芽孢杆菌a-淀粉酶成熟部分的基因的限定为SEQIDNO:6中的氨基酸1-483的编码BAN成熟部分的基因。解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶的变体示于SEQIDNO:2,包含两个氨基酸缺失R176和G177以及N190F取代(使用SEQIDNO:6中的编号)，与野生型解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶相比，具有改善的稳定性。该变体在下文中称为BAN-var003。为改善所述a-淀粉酶变体的淀粉亲和力和水解能力，使用Sarkar和Sommer,19卯(BioTechniques8:404-407)所述的大引物方法进行位点定向诱变.构建BE1001:BAN-var003+R437W:通过PCR,使用结合淀粉酶基因下游的载体引物CAAX37和诱变引物CABX437扩增来自pCA330-BAN质粒(在编码来自SEQIDNO:6的淀粉酶的基因中含有BAN-var003突变)的大约450bpDNA片段。450bp片段纯化自琼脂糖凝胶并用作为大引物与引物IB—起对相同的模板进行第二PCR。用限制性内切酶PstI和AvrII消化所得到的大约1800bp片段，纯化所得到的大约1600bpDNA片段并与用相同的酶消化的pCA330-样质粒连接。用连接和氯霉素抗性的转化体转化感受态枯草芽孢杆菌SHA273(低淀粉酶和蛋白酶)细胞，并通过DNA测序^r查以^r证质粒上正确突变的存在。引物CABX437:5，GGTGGGGCAAAGTGGATGTATGTCGGC3，(SEQIDNO:35)构建BE1004:除使用两种诱变引物CABX437和CABX438之外，以类似方法构建BAN-var003淀粉酶+[R437W+E469N]。CABX438:5'GGAAGGCTGGGGAAACTTTCACGTAAACG3，(SEQIDNO:36)实施例4TermamylLC对LE1153和LE1154该实施例说明了与TermamylLC相比，使用根据本发明的细菌a-淀粉酶(LE1153和LE1154)将粒状小麦淀粉转化为葡萄糖。通过在搅拌下将247.5g小麦淀粉添加到502.5ml水中，制备具有33%干固形物(DS)粒状淀粉的淤浆。用HCl将pH调节到4.5。将粒状淀粉浆分配在100ml锥形烧瓶中，每瓶75g。在60。C水浴中温育烧瓶，带有磁力搅拌。在0小时处，将表1中所给出的酶活性剂量给予烧瓶。在24、48和73以及94小时后提取样品。表1.使用的酶活性水平<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>使用以下方法测定总的干固形物淀粉。通过添加过量的a-淀粉酶(300KNU/kg干固形物)并将样品置于95。C油浴中45分钟完全水解淀粉。随后将样品冷却至60。C，并添加过量的葡糖淀粉酶(600AGU/kgDS),接着在60°C下温育2小时。在通过0.22微米过滤器过滤后，通过折光率测定法对样品测定淀粉水解产物中的可溶性千固形物。通过HPLC测定糖分布。葡萄糖的量计算为DX。结果示于表2和3中。表2.在100KNU/kgDSa-淀粉酶用量下，可溶性千固形物占总的<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>该实施例说明了与BANWT相比，使用根据本发明的BANR437W变体的细菌(X-淀粉酶将粒状小麦淀粉转化为葡萄糖。通过在搅拌下将247.5g小麦淀粉添加到502.5ml水中，制备具有33%干固形物(DS)粒状淀粉的淤浆。用HCl将pH调节到4.5。将粒状淀粉浆分配在100ml锥形烧瓶中，每瓶75g。在60。C水浴中温育烧瓶，带有磁力搅拌。在0小时处，将表1中所给出的酶活性给予烧瓶。在24、48和73以及94小时后提取样品。表1.使用的酶活性水平a<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>使用以下方法测定总的干固形物淀粉。通过添加过量的a-淀粉酶(300KNU/kg干固形物)并将样品置于95。C油浴中45分钟完全水解淀粉。随后将样品冷却至60°C,并添加过量的葡糖淀4分酶(600AGU/kgDS)，接着在60。C下温育2小时。在通过0.22微米过滤器过滤后，通过折光率测定法对样品测定淀粉水解产物中的可溶性干固形物。通过HPLC测定糖分布。葡萄糖的量计算为DX。结果示于表4和5中。表4.在100KNU/kgDSa-淀粉酶用量下，可溶性干固形物占总的干物质的百分数<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>参考文献Klein,C.，等，所oc/zem/Wo;31,8740-8746，Miz腳，H.，等，JMo/.扁.(1993)234,1282-1283，Chang,C.,etal,/Mo/.扁.(1993)229,235-238,Larson,S.B.,J^fo/.历o/.(1994)235，1560-1584，Lawson，C丄.，/7kfo/.J5/o/.(1994)236，590-600，Qian,M"等，/M/.肠/.(1993)231,785-799,Brady，R丄.，等，D^to〃o^:5，47，527-535,Swift,H丄，等，爿ctoCV^to〃ogr.B,47，535-544A.Kadziola,博士论文"Analpha-amylasefromBarleyanditsComplexwithaSubstrateAnalogueInhibitorStudiedbyX-rayCrystallography",DepartmentofChemistryUniversityofCopenhagen1993MacGregor，E.A.，FoodHydrocolloids,1987,Vol.1,No.5-6,p.B.Diderichsen和L.Christiansen,CloningofamaltogenicamylasefromBac/〃w5Weoro^2enMo//n'/ws,FEMSMicrobiol,letters:56:pp.53-60(1988)Hudson等,PracticalImmunology,Thirdedition(1989》BlackwellScientificPublications,Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,1989S丄.Beaucage和M.H.Caruthers,TetrahedronLetters22,1981,pp.1859-1869Matthes等，TheEMBOJ.3,1984,pp,801-805.R.K.Saiki等，Science239,1988,pp.487-491.Morinaga等，(984,Biotechnology2:646-639)Nelson和Long,AnalyticalBiochemistry180，1989,pp.147-151Hunkapiller等，1984,Nature310:105-111R.Higuchi,B.Krummel和R,K.Saiki(1988).Ageneralmethodofz'"v"rapreparationandspecificmutagenesisofDNAfragments:studyofproteinandDNAinteractions.jVmc/.爿"Ai饥16:7351-7367.Dubnau等，1971,J.Mol.Biol.56,pp.209-221.Gryczan等,1978,J,Bacteriol.134，pp.318-329.S.D.Erlich，1977,Proc.Natl.Acad.Sd.74,pp.1680-1682.Boel等，1990,Biochemistry22，pp.6244-6249.Sarkar和Sommer,1990,BioTechniques8，pp.404-407.权利要求1.具有α-淀粉酶活性并包含取代R437W的亲本Termamyl-样α-淀粉酶的变体，其中所述位置相应于具有SEQIDNO4之氨基酸序列的亲本Termamyl-样α-淀粉酶的氨基酸序列的位置。2.权利要求1的变体，其中亲本a-淀粉酶是SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的杂合a-淀粉酶。3.权利要求l-2任一项的变体，其中亲本杂合a-淀粉酶是包含如SEQIDNO:4所示的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基和如SEQIDNO:6所示的来源于解淀粉芽孢杆菌的a-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基的杂合a-淀粉酶。4.权利要求1-3任一项的变体，其中亲本杂合Termamyl-样a-淀粉酶进一步具有以下突变H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S(使用SEQIDNO:4中的编号)或LE174。5.权利要求1-3任一项的变体，其中亲本杂合Termamyl-样a-淀4分酶进IDNO:4的编号)或LE429。6.权利要求l-5任一项的变体，其中变体包含一个或多个以下额外的突变R176*、G177*、E469N(使用SEQIDNO:6中的编号)。7.权利要求l-6任一项的变体，其中变体包含额外的突变E469N(使用SEQIDNO:6中的编号)。8.权利要求1-6任一项的变体，其中变体包含额外的突变R176*+G177*+E469N(使用SEQIDNO:6中的编号)。9.权利要求1的变体，其中亲本a-淀粉酶是SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的a-淀4分酶。10.权利要求9的变体，其中变体包含一个或多个以下额外的突变R176*、G177*、N190F、E469N(使用SEQIDNO:6中的编号)。11.权利要求10的变体，其中变体包含额外的突变R176承+G177氺+N190F(使用SEQIDNO:6中的编号)。12.权利要求11的变体，其中变体包含额外的突变E469N(使用SEQIDNO:6中的编号)。13.权利要求1-12任一项的变体，其中亲本Termamyl-样a-淀粉酶具有与SEQIDNO:4具有至少60%、优选70°/。、更优选至少80%、甚至更优选至少约90%、甚至更优选至少95%、甚至更优选至少97%以及甚至更优选至少约99%同一性水平的氨基酸序列。14.一种包含编码根据权利要求1-13任一项的a-淀粉酶变体的DNA序列的DNA构建体。15.—种携有根据权利要求14的DNA构建体的重组表达载体。16.—种用根据权利要求14的DNA构建体或根据权利要求15的载体转化的细胞。17.权利要求16的细胞，其是微生物，特别是细菌或真菌，例如革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、杣烂芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。18.—种包含权利要求1-13的a-淀粉酶变体的组合物。19.一种生产根据权利要求l-13任一项的变体的方法，其中在有利于产生变体的条件下培养根据权利要求16-17任一项的细胞，并随后从培养物中回收变体。20.权利要求1-13任一项的a-淀粉酶变体或权利要求18的组合物在淀粉液化；在洗涤剂组合物，例如洗衣、碗碟清洗和硬表面清洁组合物；乙醇生产，例如燃料、^L用和工业乙醇生产；纺织品、织物或衣物的退浆中的应用。全文摘要本发明涉及亲本Termamyl-样α-淀粉酶的变体，该变体具有改变的特性，具体来说是相对于亲本α-淀粉酶增加的淀粉亲和力。文档编号C12P19/14GK101128579SQ200580048604公开日2008年2月20日申请日期2005年12月22日优先权日2004年12月23日发明者卡斯滕·安德森,安德斯·维克索-尼尔森申请人:诺维信公司