α－淀粉酶突变体的制作方法

专利名称：α－淀粉酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及突变的液化α-淀粉酶，该突变体具有碱性范围内的最适pH，对氧化剂具有极好的抗性，可特别地用作含氧化剂之去污剂的酶，本发明还涉及该突变酶的基因。
背景技术：
多种酶被掺入去污剂中以增强去污能力，据称掺入α-淀粉酶可去除例如淀粉污渍。然而，掺入去污剂中的α-淀粉酶必需是碱性α-淀粉酶，因为去污剂含有表面活性剂，去污剂溶液的pH为碱性范围。
顺便说一句，其中掺入氧化漂白成分以期不仅能除污垢又能起漂白作用的去污剂最近已上市。据称在这种含氧化漂白剂的去污剂中也掺入了α-淀粉酶。然而，在氧化剂的存在下容易灭活普通的α-淀粉酶，因此，α-淀粉酶不能掺入含氧化漂白剂的去污剂。
已进行的研究想赋予这种α-淀粉酶氧化剂抗性。更具体地，WO94/02597通过用非氧化氨基酸，具体为亮氨酸(Leu)，苏氨酸(Thr)或甘氨酸(Gly)取代得自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)之α-淀粉酶的甲硫氨酸残基提供了氧化剂-抗性突变蛋白质。据WO94/18314和WO96/30481报道当上述酶的甲硫氨酸残基中对应于第197位和第15位的Met残基分别被Ala，Ile或Thr以及Leu，Thr，Asp，Ser，Val或Ile取代时，酶的氧化剂抗性和热稳定性增强。然而，这些α-淀粉酶突变体都是最适pH为中性至酸性范围的酶，因此，需要开发具有较高最适pH的碱性α-淀粉酶以用于去污剂中。
另一方面，作为赋予碱性α-淀粉酶氧化剂抗性的技术，WO96/23873仅报道了通过修饰编码α-淀粉酶的SEQ ID NO1(NCIB 12512)得到的具有氧化剂抗性的α-淀粉酶突变体。根据WO96/23873，考虑得自地衣芽孢杆菌之α-淀粉酶的结果(WO94/18314)等，据称当对应于图2 NCIB 12512中第202位的Met被Leu，Phe，Ala，Thr，Val或Ser取代时，所得的α-淀粉酶突变体对用200mM H2O2处理变为氧化剂抗性。然而，据报道因其对氧化的抗性不够强，除了此突变外，还需缺失第181位的Arg和第182位的Gly(Suzuki等，生物化学杂志，264，18933-18938)以使突变体更加稳定。然而，以此方式得到的α-淀粉酶突变体的酶活性半衰期(t1/2)前者为10至20分钟，后者为10至30分钟，因此作为掺入去污剂中既具有氧化剂抗性又具有较长寿命的酶来说，它们不能令人满意。
因此，本发明的目的是提供其最适pH为碱性范围，寿命长，对氧化剂的抗性强的α-淀粉酶及其基因，含有这种α-淀粉酶的去污剂组合物。本发明的内容鉴于上述情况，本发明人已注意到由芽孢杆菌菌种KSM-AP 1378产生的酶(WO94/26881)，该酶是一种液化碱性α-淀粉酶，并进行了多种研究。结果发现当SEQ ID NO1所示氨基酸序列中至少第202位或与其同源的位置的一个甲硫氨酸残基缺失或被另一个任意氨基酸残基取代时，所得α-淀粉酶突变体变得具有强而持久的氧化剂抗性，并在碱性pH范围内具有极好的淀粉酶活性，因此完成了本发明。
根据本发明，提供了α-淀粉酶突变体，其氨基酸序列是通过SEQ IDNO1所示氨基酸序列或与所述氨基酸序列至少95.2％同源的氨基酸序列中的第202位或与其同源的位置的甲硫氨酸残基缺失或被另一个任意氨基酸残基取代得到的，该突变体组成液化碱性α-淀粉酶。
根据本发明，也提供了编码α-淀粉酶突变体的基因。
根据本发明，还提供了含有α-淀粉酶突变体的去污剂组合物。图的简述

图1至4阐明了由芽孢杆菌菌种KSM-AP 1378产生的成熟α-淀粉酶(KSM-AP 1378，KAM)的氨基酸序列和由芽孢杆菌属其它细菌产生的成熟α-淀粉酶的氨基酸序列之间的同源性。NCIB 12512和NCIB 12513是WO95/26397中所述的α-淀粉酶，NCIB 12289是DK 94/0353(DK94-1271)中所述的α-淀粉酶，#707是由芽孢杆菌菌种#707产生的α-淀粉酶，BAA，BSA和BLA分别是由解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)和地衣芽孢杆菌产生的α-淀粉酶。字母下的标记*表示所有α-淀粉酶都存在的同源性。
图5图解说明了通过氨基酸缺失所得的α-淀粉酶突变体(ΔRG)的热抗性和对螯合剂(EDTA，EGTA和沸石)的抗性。●野生型，○ΔRG，ΔΔRG/Met202 Thr。A表示热抗性(在50mM Tris-HCl，pH8.5的条件下，在多种温度下处理30分钟)，B至D表示对螯合剂的抗性(在50mMTris-HCl，pH8.5的条件下，在多种浓度的多种螯合剂的存在下，于30℃处理30分钟)。
图6图解说明了在α-淀粉酶基因中导入突变，并通过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在细胞外大量产生α-淀粉酶基因突变体。
图7图解说明了在α-淀粉酶基因中导入突变，并通过枯草芽孢杆菌在细胞外大量产生α-淀粉酶基因突变体(图6续)。圆括号中的“序列分析”部分重叠图6。
图8和9图解说明了由枯草芽孢杆菌表达并被完全纯化的，通过第202位甲硫氨酸的氨基酸取代所得的α-淀粉酶突变体对H2O2氧化的抗性。A在本发明的条件下(KAO法)，在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5；存在0.1mM CaCl2)中，用2％H2O2处理规定的一段时间后残留的活性，B在WO96/23873(W法)所述的条件下，在Britton-Robinson缓冲液(pH9.0；存在0.1mM CaCl2)中，用200mM H2O2处理规定的一段时间后残留的活性；为了比较起见，得自NCIB(12215，WO96/23873中的SEQ ID NO1)的α-淀粉酶结果被加到B中(在图中由虚线表示)。○缺乏H2O2时预处理(对照)，和●用规定浓度的H2O2预处理。
图10和11图解说明了由枯草芽孢杆菌表达并被完全纯化的，通过第202位甲硫氨酸的氨基酸取代所得的多种α-淀粉酶突变体对H2O2氧化的抗性。A在本发明的条件下(KAO法)，在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9；存在0.1mM CaCl2)中，用500mM H2O2处理规定的一段时间后残留的活性，B在WO96/23873(W法)所述的条件下，在Britton-Robinson缓冲液(pH9.0；存在0.1mM CaCl2)中，用200mMH2O2处理规定的一段时间后残留的活性；为了比较起见，得自NCIB(12215，WO96/23873中的SEQ ID NO1)的α-淀粉酶结果被加到B中(在图中由虚线表示)。○缺乏H2O2时预处理(对照)，和●用规定浓度的H2O2预处理。
图12图解说明了由枯草芽孢杆菌表达并被完全纯化的α-淀粉酶突变体，ΔRG/Met202Thr对H2O2氧化的抗性。A在本发明的条件下(KAO法)，在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9；存在0.1mM CaCl2)中，用500mM H2O2处理规定的一段时间后残留的活性，○缺乏H2O2时预处理(对照)，和●用规定浓度的H2O2预处理。
图13阐明了由枯草芽孢杆菌表达并被完全纯化的，通过第202位甲硫氨酸的氨基酸取代所得的α-淀粉酶突变体的pH-活性曲线。A野生型，BMet202 Leu。
图14阐明了由枯草芽孢杆菌表达并被完全纯化的，通过第202位甲硫氨酸的氨基酸取代所得的α-淀粉酶突变体的温度活性曲线。在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中，在多种温度下反应5分钟之后测定活性。A野生型，BMet202Leu。实施本发明的最佳方式通过突变液化碱性α-淀粉酶得到本发明的α-淀粉酶突变体。亲代液化碱性α-淀粉酶的例子包括以前由本发明人报道过并描述于WO94/26881中的野生型液化碱性α-淀粉酶[根据布达佩斯条约，保藏于国家生物科学和人类技术研究所，工业科学和技术机构(地址1-3，Higashi 1 chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-0046，日本)，保藏号为芽孢杆菌菌种KSM-AP 1378(FERM BP-3048；原始保藏日1989年7月24日)]。
本发明的α-淀粉酶突变体的氨基酸序列是通过具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的液化α-淀粉酶中至少第202位的甲硫氨酸残基缺失或被另一个任意氨基酸残基取代而得到的。对本文所用的另一个任意氨基酸残基没有特殊限制，只要是非氧化的氨基酸残基即可，例如可优选Thr，Ile，Leu，Ala，Val或Ser。
通过SEQ ID NO1第202位的一个甲硫氨酸残基缺失或被另一个氨基酸残基取代而得到的本发明的α-淀粉酶突变体即使在浓度高达500mM的H2O2存在下，其活性的半衰期(t1/2)仍能达到几个小时(野生型α-淀粉酶的t1/2约10至20分钟)，与WO96/23873所述的α-淀粉酶突变体相比，其氧化剂抗性和寿命大大提高。
如上所述，通过用非氧化的氨基酸取代第202位的Met得到的本发明的突变体甚至对高浓度的强氧化剂H2O2都具有很高的抗性。非常令人惊奇的事实是本发明所用的亲代α-淀粉酶的氨基酸序列与WO96/23873所述的NCIB 12512(SEQ ID NO1)的氨基酸序列具有95.1％的同源性。总数为485的氨基酸中仅有24个氨基酸的序列不同。在α-淀粉酶家族高度保守的I，II，III和IV区域中，没有差别。由于本发明亲代α-淀粉酶的序列与NCIB 12513(WO95/26397)，NCIB12289(DK 94-1271)，芽孢杆菌菌种#707，解淀粉芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的序列同源性分别为86.6％，94.7％，86.4％，66.7％，68.6％和68.9％，因此，优选本发明所用的亲代α-淀粉酶与SEQ ID NO1的氨基酸序列至少95.2％同源。
对SEQ ID NO1的α-淀粉酶而言，即使除第202位甲硫氨酸残基以外的其它甲硫氨酸残基，例如第9，10，105，116，208，261，309，382，430和440位的甲硫氨酸残基缺失，或被另一个氨基酸残基取代，不能得到高氧化剂抗性。因此，无需对这些甲硫氨酸残基进行特别地修饰。当第202位甲硫氨酸残基被另一个氨基酸取代时，优选用Thr，Ile，Leu，Ala，Val或Ser取代之。
具有通过进一步缺失SEQ ID NO1第181位的精氨酸残基和第182位的甘氨酸残基得到的氨基酸序列的α-淀粉酶是特别优选的，因为除了具有氧化剂抗性外，它还具有热抗性(对螯合剂的抗性)。
由于从蛋白质工程的角度出发，本发明最初使用的野生型α-淀粉酶氨基酸序列具有优于工业化α-淀粉酶，如地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌之α-淀粉酶的有用特性，通过仅产生Met202X(X任意氨基酸)和缺失RG得到的突变酶即可非常快速地赋予上述野生型α-淀粉酶以氧化抗性和热抗性(对螯合剂的抗性)，通过单独或联合应用这些突变可得到具有很有用的工业特性的α-淀粉酶突变体。
通过例如在编码SEQ ID NO1之氨基酸序列的DNA中导入位点特异性突变以得到编码α-淀粉酶突变体的基因和含有此基因的载体质粒，然后通过使用此质粒转化宿主或染色体同源重组得到转化体，并培养转化体可产生本发明的α-淀粉酶突变体。
首先，根据例如日本专利申请公开特许336392/1996所述的方法可得到编码具有SEQ ID NO1之氨基酸序列的液化碱性α-淀粉酶的DNA。
至于进行位点特异性突变的方法，任何方法都是适用的，只要是常规方法即可。然而，可通过使用例如Clonetech公司生产的Transformer定点诱变试剂盒和TaKaRa公司生产的定点诱变系统Mutan-Super Express Km试剂盒等进行突变。
通过在含可溶性淀粉的培养基上培养转化体可筛选产生氧化剂抗性之α-淀粉酶突变体的克隆。
下文将描述适用于本发明方法之实践的一般方法。染色体DNA的提取方法可根据本领域已知的方法从上述菌株中分离染色体，所述方法如Saito & Miura的方法(Biochim.Biophys.Acta，72，619-629，1963)。将质粒DNA导入大肠杆菌的方法使用感受态细胞(TaKaRa公司)将质粒DNA导入大肠杆菌。顺便说一句，在固体LB培养基中加入0.6％淀粉天青(Sigma公司产品)以选择具有淀粉酶活性的转化体。无细胞提取物和培养物上清液的制备方法在含四环素(15μg/ml)的液体LB培养基(50ml)中将含所需质粒DNA的大肠杆菌摇瓶培养15至24小时，离心培养基，将所得细胞沉淀物悬浮于5ml 50mM Tris-HCl(pH8.0)中。利用超声处理装置对细胞悬浮液进行细胞破碎，离心破碎的细胞悬浮液，取出所得的上清液作为无细胞提取物。另一方面，离心培养后的培养基，所得上清液被用于酶分析。质粒DNA的制备方法根据本领域已知的方法，使用Maniatis等(分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，纽约，美国，1982)所述的方法由重组大肠杆菌制备质粒DNA。测定碱基序列使用Maxam-Gilbert所述的化学修饰法(酶学方法，65，499-559，1980)或双脱氧核苷酸链终止法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，74，5463-5467，1977；Smith等，自然，伦敦，321，674-679，1986)测定碱基序列。导入位点特异性突变的方法根据Clontech公司的方案，使用TaKaRa公司生产的Transformer定点诱变试剂盒(第2代产品)或定点诱变系统Mutan-Super ExpressKm试剂盒导入位点特异性突变。测定淀粉酶活性通过3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定各种酶的淀粉酶活性。于40℃，在含可溶性淀粉的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)反应混合物中反应15分钟之后，通过DNS法测定所形成的还原糖。至于酶活性，将1分钟内形成相当于1μmol葡萄糖的还原糖的酶量定义为1个单位。测定蛋白质含量利用Bio-Rad Laboratories生产的蛋白质检测试剂盒，以牛血清白蛋白为标准测定蛋白质含量。检测对H2O2氧化的抗性(1)首先提前测定样品的淀粉酶活性，然后，用适当缓冲液，如50mM Tris-HCl(pH8.5或8.9)稀释样品以使淀粉酶的酶浓度仅为未稀释即可直接检测的淀粉酶酶浓度的一半。
(2)在试管中各倒入5μl过氧化氢酶(Behringer Mannheim GmbH，20mg/ml)(样品×5管)。
(3)用缓冲液将30％过氧化氢水溶液(Wako Pure ChemicalIndustries有限公司)稀释至终浓度为200mM或500mM。
(4)提供装备有具旋塞的试管(样品×2管)，将步骤(1)中制备的经稀释的酶溶液(1ml)和缓冲液(1ml)的混合溶液倒入其中的一个试管，将步骤(1)中制备的经稀释的酶溶液(3ml)倒入另一个试管，将试管置于30℃或40℃下保温。
(5)在含经稀释的酶溶液(3ml)的试管中快速加入步骤(3)中制备的过氧化氢水溶液(3ml)，并于4℃下保温，将内容物充分混合。放置规定的一段时间后，各取出700μl反应混合物样品，倒入步骤(2)提供的含过氧化氢酶的试管中以终止氧化。倒入后，将试管置于冰浴中直至测完活性为止。同时，也将步骤(4)中于30℃或40℃中保温的无过氧化氢样品转移至冰浴中。
(6)通过DNS法测定各个样品残留的淀粉酶活性以找出它们对氧化剂(过氧化氢)的抗性。顺便说一句，为了进一步证实仅在30℃或40℃下保温不会使淀粉酶活性退化这一事实，同时也测定步骤(5)中置于冰浴中的无过氧化氢样品和步骤(1)中制备的经稀释酶溶液的淀粉酶活性。
根据本发明如此得到的α-淀粉酶突变体具有很高的和持久的氧化剂抗性，因此，可用作含氧化剂和漂白剂的去污剂，液化和糖化淀粉的组合物等中的成分。
除了上述α-淀粉酶突变体外，本发明的去污剂组合物还可含有一种或多种下述酶，所述酶可选自脱支酶(支链淀粉酶，异淀粉酶，新支链淀粉酶等)，α-糖苷酶，葡糖淀粉酶，蛋白酶，纤维素酶，脂肪酶，果胶酶，原果胶酶，果胶酸裂解酶，过氧化物酶，漆酶和过氧化氢酶。
另外，可掺入通常掺入典型去污剂中的表面活性剂，如阴离子表面活性剂，兼性表面活性剂，非离子型表面活性剂和阳离子表面活性剂；二价金属离子螯合剂，碱化剂，无机盐，防止再弄脏的试剂，氯清除剂，还原剂，漂白剂，荧光染料稳定剂，香料，防块结剂，酶激活物，抗氧化剂，防腐剂，着色剂，上蓝剂，漂白激活物，酶稳定剂，相调节剂等。
必要时，可为最终所需的应用适当选择去污剂组合物的形式，可以例如液体，粉末或颗粒的形式提供去污剂组合物。本发明的去污剂组合物可用作洗衣去污剂，漂白去污剂，自动洗碗机去污剂，排水管清洗剂，人工洗牙机等的去污剂。优选用作洗衣去污剂，漂白去污剂或自动洗碗机的去污剂。实施例下列实施例将更详细地描述本发明，然而，这些实施例并不以任何方式限制本发明。实施例1(1)在液化碱性α-淀粉酶基因中导入突变使用TaKaRa公司生产的定点诱变系统Mutan-Super Express Km试剂盒，和能用另一个氨基酸的密码子取代第202位Met密码子的导入突变的引物来突变编码第202位Met的密码子。
例如，当24聚体5’TACCTTGTGTATGCAGACATTGAT3’用作导入突变的引物时，位于此序列第7至9位的CTG序列是编码Leu的序列，其对应于退火的模板序列中编码第202位Met的ATG序列的位置，以致于通过用序列CTG取代序列ATG，甲硫氨酸残基被亮氨酸残基取代(下文简称为Met202Leu)。
在本发明中，在第202位Met导入突变得到除Met202Leu外的5个氧化抗性α-淀粉酶突变体。导入这种突变所用的引物如下5’TACCTTXXX*TATGCAGACATTGAT3’Met202Ala GCAMet202IleATCMet202SerTCAMet202ThrACAMet202ValGTGMet202CysTGC(*XXX是3个被取代的碱基)导入突变的具体方法如下所述。(a)将α-淀粉酶基因导入质粒载体pKF19K中以导入突变通过PCR由大量产生α-淀粉酶的质粒pHSPLAMY2上的高表达启动子区域扩增含液化α-淀粉酶结构基因的2.1kb的片段，并将此片段插入质粒pKF19K的SmaI位点(称之为pKF19LAMY)。(b)PCR导入突变在反应试管(0.5ml)中制备下列反应混合物，反应混合物的组成模板DNA(pKF19LAMY)10ng，选择引物5pmol，导入突变的磷酸化引物5pmol，10×LA PCR缓冲液II 5μl，dNTP混合物(各2.5mM)8μl和TaKaRa LA Taq0.5μl(共50μl)。在下述条件下进行PCR反应将94℃解离1分钟，55℃退火1分钟和72℃延伸3分钟的循环重复25次，然后于4℃下反应10分钟。用PCR片段纯化试剂盒(BehringerMannheim GmbH)纯化扩增的DNA并用于转化。(c)导入大肠杆菌MV1184菌株并证实突变通过一般的感受态细胞法，使用大肠杆菌MV1184感受态细胞(TaKaRa公司)将PCR产物导入大肠杆菌MV1184菌株(araΔ(lac-proAB)rpsLthi(80 lacZΔM15)Δ(srl-recA)306∷Tn10(tetr)F’[traD36proAB+lacIqlacZΔM15])。由含卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基(细菌培养用胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂1.5％)上长出的一些转化体菌落制备质粒DNA，进行序列分析以证实突变。(2)筛选具有氧化剂抗性的α-淀粉酶突变体为了得到根据上述方法产生的α-淀粉酶突变体，首先以12,000rpm离心各个转化体的培养基达15分钟，然后回收培养物上清液。在各个培养物上清液中加入过氧化氢水溶液以使其终浓度为2％。将混合物在30℃下放置30分钟之后，测定培养物上清液残留的淀粉酶活性，同时，也测定在相同条件下处理的各个无过氧化氢培养物上清液的淀粉酶活性。
将用过氧化氢处理后的残留活性与野生型酶的活性相比较，得到经判断对氧化剂具有高抗性的18个突变体(保留了85至100％的活性)。由选定的11个转化体制备各个质体以对它们进行序列分析。结果表明第202位的氨基酸甲硫氨酸残基被苏氨酸残基(2个克隆)，丝氨酸残基(2个克隆)，缬氨酸残基(2个克隆)，亮氨酸残基(1个克隆)，异亮氨酸残基(3个克隆)或丙氨酸残基(1个克隆)取代。在被取代的氨基酸中，这些突变体与通过位点特异性突变得到的氧化抗性α-淀粉酶突变体同时出现。这些α-淀粉酶突变体基因或蛋白质被称为Met202Thr，Met202Ile，Met202Leu，Met202Ala，Met202Val和Met202Ser。至于Met202Cys，当酶被完全纯化并与水混合时，混合物变得不透明，酶沉淀下来。酶分子之间可能形成了二硫键，从而变得不可溶。(3)用60％硫酸铵沉淀通过离心大肠杆菌表达的培养基得到的α-淀粉酶突变体(上清液)。分别透析沉淀物，然后浓缩DEAE-Toyoperl 650S柱上的各个未吸附部分，得到部分纯化的突变酶制品。证实所得制品的氧化剂(H2O2)抗性。结果，除Met 202Cys外的α-淀粉酶突变体甚至在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中，在1至3％H2O2存在下，于30℃处理30分钟之后，其残留活性仍至少为75％。(4)类似地，下列引物适用于用各个适当的氨基酸取代其它甲硫氨酸残基，即第9，105，116，382和430位的Met残基。Met9Leu 5′ACGAATGGGACCCTGATGCAGTATTTT3′Met105Ile5′GGGGATGTCGTGATCAATCATAAAGGT3′Met116Asp5′GACGGGACAGAGGACGTAAATGCGGTG3′Met382Leu5′GGTGTTCCTTCGCTGAAATCTAAAATT3′Met430Ile5′CTTGCAACTATTATCTCCGATGGGCCA3′至于这些氨基酸取代，当随机选择氨基酸时，据认为正常的蛋白质结构因空间结构位阻而不能被采用，或即使采用了，其活性表达也受到抑制，因此，选择对应于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶之氨基酸序列的氨基酸(见图1至6)。根据日本专利申请(KOHYO)500243/1995(通过PCT途径)所述，通过取代得自嗜热脂肪芽孢杆菌之液化α-淀粉酶的第202位和208位的一个或两个甲硫氨酸残基得到的突变体被稳定化，在WO96/23878中，甚至对得自NCIB 2512的α-淀粉酶也有相同的描述，因此，5’GCAGACATTGATTATGATCATCCAGAA3’被合成为突变引物以制备Met208Tyr。
顺便说一句，如果Suzuki等(生物化学杂志，264，18933-18933，1989)的已知报道，即在本发明的α-淀粉酶中甚至再特异性缺失2个氨基酸，精氨酸和甘氨酸的话，预期不仅氧化剂抗性有所增强，热稳定性也会提高。因此，通过使用导入突变的下列引物使野生型α-淀粉酶的基因和具有Met202Thr突变的α-淀粉酶基因中第181位的精氨酸和第182位的甘氨酸(所述位置对应于Suzuki等的报道)缺失，从而通过缺失产生2个α-淀粉酶突变体(下文分别简称为ΔRG和ΔRG/Met202Thr)。ΔRG5’AAAATATATAAATTC(AGA)(GGT)ACCGGAAAGGCATGGGACTGG3’(圆括号中的碱基表示缺失的碱基)在枯草芽孢杆菌细胞中表达上述突变质粒，然后纯化所产生的α-淀粉酶突变体以测定对H2O2氧化的抗性，结果示于表1。
表1

于30℃，在50mM Tris-HCl(pH8.5)中用H2O2预处理30分钟。在每个样品中，表示为将无H2O2系统之活性看成100％的相对值。
由表1可明显看出，应懂得Met9Leu，Met105Ile，Met116Asp，Met382Leu，Met430Ile，Met208Tyr和ΔRG都只具有与野生型酶相同的氧化抗性，即对氧化剂没有抗性。另一方面，通过将ΔRG突变导入表现出高氧化剂抗性的Met202Thr得到的ΔRG/Met202Thr表现出与对照Met202Leu类似的高氧化剂抗性。另外，从图5中可明显看出相对于野生型酶而言，此酶和ΔRG在热抗性和螯合剂(EDTA，EGTA和沸石)抗性方面大有改善。(5)对如此得到的对高浓度H2O2氧化具有高抗性的7个α-淀粉酶突变体进行混合培养。根据原生质体法(Chang & Cohen，Mol.Gen.Genet.，168，111-115，1979)将各个突变基因转化至枯草芽孢杆菌ISW1214菌株(LeuA8metB5hsaM1)(见图6和7)以于30℃，在Sakaguchi烧瓶中培养3天，培养所用的液体培养基含有4％玉米浸汁；1％胰蛋白月示；1.0％肉汁浸膏；0.1％磷酸二氢钾；MgSO4，0.01％NH2O；2％麦芽糖；0.1％CaCl2；和15μg/ml四环素。用硫酸铵(至60％饱和)分级分离所得的培养物上清液，对10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5；含有2mMCaCl2)透析24小时。透析后，使透析物穿过用相同缓冲液平衡过的DEAE-Toyopearl柱，然后将如此处理的溶液上样于用上述缓冲液平衡过的CM-Toyopearl柱。结果，溶液吸附于柱上，通过NaCl浓度梯度洗脱所需的酶。在PM-10膜滤器(Amicon公司)上浓缩此洗脱物之后，用上述缓冲液透析所得浓缩物，从而得到完全纯化的制品，所得的所有制品在SDS电泳(Laemmli，自然，伦敦，227，680-685，1970)上都只有一条带，它们的分子量都是约55Kda。
于30℃，在含2％(588mM)H2O2的50mM Tris缓冲液(pH8.5)中分开保温所得各个α-淀粉酶突变体的完全纯化的制品之后，测定它们残留的淀粉酶活性，籍此测定它们的氧化剂抗性(KAO法)。结果，如图8至12所示，野生型α-淀粉酶和ΔRG的活性快速降低，而各个α-淀粉酶突变体甚至在保温1小时之后仍表现出至少为80％的高残留活性。另外，各个α-淀粉酶突变体甚至在H2O2的浓度增加为2M的条件下(于30℃处理30分钟)，仍表现出高的残留淀粉酶活性，因此，说明了这样一个事实，即它们获得了非常高的抗氧化剂能力。另一方面，WO/23873公开了氧化剂抗性有所改善的α-淀粉酶突变体。然而，据说这些α-淀粉酶突变体在含有200mM H2O2和0.1mM CaCl2的50mM Britton缓冲液(pH9.0)中，40℃处理20分钟之后仍表现出20至43％的残留活性(W法)。使用这种W法测定本发明α-淀粉酶突变体的氧化剂抗性。结果，甚至在处理1小时之后，它们仍表现出至少为80％的残留活性(见图8至12)，因此，说明了这样一个事实，即相对于WO/23873中的突变酶而言，它们获得了非常高的氧化剂抗性。
通过上述方法测定所得α-淀粉酶突变体的蛋白质含量以计算出它们的比活，结果，野生型α-淀粉酶的比活为4000至5500，而Met202Ser的比活为700至750，Met202Thr的比活为2200至2400，Met202Val的比活为1100至1400，Met202Ala的比活为1350至1500，Met202Cys的比活为1450至1600，Met202Ile的比活为1600至1800，Met202Leu的比活为1600至2000，ΔRG的比活为3500至4500，ΔRG/Met202Thr的比活为2000至2500，NCIB12512，NCIB12523和NCIB12285的比活为4000至4500，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的比活约为1300(各为单位/mg蛋白质)。实施例2于40℃，含有10mM TEAD/20mM NaBO4漂白系统的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中，将所得的H2O2氧化-抗性α-淀粉酶突变体Met202Leu和Met202Thr保温1小时，处理后，测定上述突变体的残留淀粉酶活性。结果，野生型几乎完全失活，而Met202Leu和Met202Thr分别保留了77％和80％的活性。实施例3将颗粒状的Met202Thr(5％，w/v)掺入A Company的超浓缩去污剂中之后，在温度被控制于40℃，相对温度为80％的储藏室中将去污剂储存4周。挑出颗粒，溶解于含2mM CaCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中，然后离心(12,000×g，20分钟)溶液。测定所得上清液的残留淀粉酶活性，当处理前的野生型和Met202Thr的比活各被看成100时，前者的残留活性为55％，后者的残留活性为88％。实施例4使用上述技术纯化由枯草芽孢杆菌ISW 1214在细胞外产生的重组α-淀粉酶，Met202Leu，Met202Ile，Met202Thr，Met202Val，Met202Cys，Met202Ala和Met202Ser，野生型α-淀粉酶和ΔRG。对所得的纯化制品进行SDS电泳，结果，它们分别被测定为一条带，它们的分子量约为55KDa，其得率为40至60％。参考实施例1在Britton-Robinson宽范围缓冲液与多种类型缓冲液混合的缓冲液系统中(各为50mM)研究所得氧化剂抗性α-淀粉酶突变体的pH-活性曲线。例如，各个缓冲液系统中Met202Thr的结果示于图13，甚至当使用任何缓冲液系统时，pH-活性曲线显示出与野生型基本上相同的曲线。参考实施例2在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中研究所得氧化剂抗性α-淀粉酶突变体Met202Thr的温度-活性曲线(反应时间5分钟)。其结果的一个例子示于图14。工业实用性本发明的α-淀粉酶突变体具有碱性范围内的最适pH，极佳的α-淀粉酶活性，和高的，持久的氧化剂抗性，因此，可特别地用作含漂白剂和氧化剂的去污剂成分，和液化及糖化淀粉的组合物的成分。序列表SEQ ID NO1的资料序列长度485序列类型氨基酸拓扑结构线性序列类型肽序列描述His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His5 10 15Leu Pro Ash Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala20 25 30Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly85 90 95Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn115 120 125Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp130 135 140Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys165 170 175Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met195 200 205Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His225 230 235 240Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr245 250 255Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val275 280 285Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly290 295 300Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys305 310 315 320His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro325 330 335Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser370 375 380Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr385 390 395 400Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu405 410 415Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp420 425 430Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly435 440 445Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile450 455 460Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser465 470 475 480Val Trp Val Lys Gln48权利要求
1.α-淀粉酶突变体，其具有的氨基酸序列是通过使SEQ ID NO1所示组成液化碱性α-淀粉酶的氨基酸序列或与所述氨基酸序列至少95.2％同源的氨基酸序列中的第202位或与其同源的位置的甲硫氨酸残基缺失或被另一个任意氨基酸残基取代得到的。
2.根据权利要求1的α-淀粉酶突变体，其中所述另一个任意的氨基酸残基是Thr，Ile，Leu，Ala，Val或Ser。
3.根据权利要求1或2的α-淀粉酶突变体，其具有的氨基酸序列是通过SEQ ID NO1的第202位甲硫氨酸残基缺失或被另一个任意氨基酸残基取代，第181位精氨酸残基和第182位甘氨酸残基缺失而得到的。
4.编码根据权利要求1至3中任一项的α-淀粉酶突变体的基因。
5.含有根据权利要求1至3中任一项的α-淀粉酶突变体的去污剂组合物。
全文摘要
本发明涉及α－淀粉酶突变体,其具有的氨基酸序列是通过使SEQID NO:1所示液化碱性α－淀粉酶序列的氨基酸残基中的第202位或与其同源的位置的至少一个甲硫氨酸残基缺失或被另一个任意氨基酸残基取代得到的。本发明还涉及含有α－淀粉酶突变体的去污剂组合物。该α－淀粉酶突变体具有碱性范围内的最适pH,极佳的α－淀粉酶活性,和高的,持久的氧化剂抗性,因此,可特别地用作含漂白剂和氧化剂的去污剂组合物中的成分。
文档编号C12N15/56GK1251613SQ9880382
公开日2000年4月26日 申请日期1998年3月31日 优先权日1997年3月31日
发明者秦田勇二, 井川香织, 伊藤进, 五十岚一晓, 萩原浩, 林康弘, 荒木裕行, 尾崎克也 申请人:花王株式会社 被以下专利引用 (1),