变体α-淀粉酶及其使用方法
【专利摘要】本发明描述了与变体α-淀粉酶相关的组合物和方法。
【专利说明】变体Ct-淀粉酶及其使用方法
[0001] 优先权
[0002] 本申请要求提交于2011年12月22日的美国临时申请系列号61/579, 356的优先 权，其全文据此以引用方式并入。
【技术领域】
[0003] 本发明公开了与变体α -淀粉酶相关的组合物和方法。
【背景技术】
[0004] 淀粉由直链淀粉（15-30%重量/重量）和支链淀粉（70-85%重量/重量）的混 合物组成。直链淀粉由α-1，4-连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量（MW)为约60, 000 至约800, 000。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有α -1，6分支点的支链聚合物；其MW 可商达一亿。
[0005] 浓缩右旋糖浆形式的得自淀粉的糖目前通过酶催化法制备，该方法涉及：（1)用 α -淀粉酶将固体淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度为约7-10的糊精，以及（2)用淀 粉葡糖苷酶（也称为葡糖淀粉酶或GA)将所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖化。所得的 糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称为异糖浆 (isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。
[0006] α -淀粉酶通过随机裂解内部α -1，4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关多糖。特别 是来自芽孢杆菌属（Bacilli)的α-淀粉酶已被用于各种不同的用途，包括淀粉液化、纺织 物退浆、造纸和纸浆工业中的淀粉改性，用于烘焙和酿造，食品工业的糖浆的生产，以及用 于动物饲料中以提高可消化性。这些酶也可用于在盘碟洗涤和衣物洗涤过程中除去含淀粉 污垢和污渍。
[0007] -种表征的α -淀粉酶为嗜碱芽孢杆菌属（alkaliphilic Bacillus)物种菌 株TS-23的α-淀粉酶，其产生至少五种呈现出淀粉水解活性的酶（Lin et al.，（1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28:61_68(Lin等人，1998年，《生物技术应用生物化学》，第28 卷，第61-68页））。尽管芽孢杆菌属物种菌株TS-23的α-淀粉酶在宽的pH范围（即， ρΗ4·7至10.8)内是稳定的，但是其最适pH为9。尽管酶在较低温度（如，15-20°C )下 具有活性，但是其最适温度为45°C。这种酶的变体如在国际专利申请W0 2009/061380、TO 2009/100102 和 W0 2010/115028 中已经有所描述。
【发明内容】
[0008] 本发明组合物和方法涉及变体α -淀粉酶多肽及其使用方法。
[0009] 在一个方面，提供变体α -淀粉酶多肽，其在有效氨基酸位置包含至少一个可组 合突变；其中：（i)所述可组合突变为与亲本α-淀粉酶相比，改善了变体α-淀粉酶的至 少一种所需特性，而与亲本α-淀粉酶相比，未显著降低变体α-淀粉酶的表达、活性或稳 定性的突变，（ii)所述有效位置为可用多个不同的氨基酸残基置换的氨基酸位置，所有这 些置换导致符合（i)的要求的变体淀粉酶，并且（iii)所述可组合突变列在表C或表D中， 其使用SEQ ID NO:2进行编号。
[0010] 在一些实施例中，变体可组合突变具有表A中列出的性能特性。在一些实施例中， 可组合突变产生变体，其中关于（i)蛋白质表达、（ii)活性、（iii)微样片活性、和（iv)洗 涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数（PI)大于或等于0.9,并且另 外关于这些特性中的任一者，PI大于或等于1. 0。在一些实施例中，可组合突变产生变体， 其中关于（i)蛋白质表达、（ii)活性、（iii)微样片活性、和（iv)洗涤剂稳定性或热稳定 性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数（PI)大于或等于0.8,并且另外关于这些测试中的 任一者具有大于或等于1. 2的PI。在一些实施例中，可组合突变产生变体，其中关于（i)蛋 白质表达、（ii)活性、（iii)微样片活性、和（iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀 粉酶的最低性能指数（PI)大于或等于0.5,并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或 等于1. 5的PI。
[0011] 在一些实施例中，可组合突变的可持续性得分为+++、++++或+++++。在一些实施 例中，可组合突变的可持续性得分为++++或+++++。在一些实施例中，可组合突变的可持续 性得分为+++++。在一些实施例中，可组合突变的有效性得分为1或2。
[0012] 在一些实施例中，亲本α -淀粉酶与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的氨基酸序列具 有至少60%氨基酸序列同一性。在一些实施例中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少70%氨基酸序列同一性。在一些实施例中，亲本α-淀粉酶与 SEQ ID NO: 1或SEQ ID Ν0:2的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性。在一些实施例 中，亲本α -淀粉酶与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少90 %氨基酸序列 同一I"生。
[0013] 在另一个方面，提供了包含任何上述变体淀粉酶的组合物。在一些实施例中，该组 合物有效除去衣物、盘碟或织物的淀粉污渍。在一些实施例中，该组合物包含表面活性剂。 在一些实施例中，该组合物为洗涤剂组合物。在一些实施例中，该组合物为衣物洗涤剂或衣 物洗涤添加剂。在一些实施例中，该组合物为人工或自动盘碟洗涤剂。
[0014] 在另一方面，提供一种用于从表面移除含淀粉污渍或污垢的方法，所述方法包括： 在包含有效量的权利要求1-13中任一项所述的变体淀粉酶的含水组合物的存在下温育该 表面，允许多肽水解含淀粉污渍中存在的淀粉组分以产生溶解于含水组合物中的较小淀粉 衍生分子，以及清洗该表面，从而从该表面移除含淀粉污渍。
[0015] 在一些实施例中，含水组合物还包含表面活性剂。在一些实施例中，该表面为纺织 物表面。在一些实施例中，该表面在盘碟上。在一些实施例中，该表面为弄脏的硬质表面。
[0016] 在另一个方面，与包含多核苷酸的表达载体和包含表达载体的宿主细胞一样，提 供编码任何上述多肽的分离的多核苷酸。
[0017] 通过本发明的描述和附图，所述组合物和方法的这些方面和其他方面以及实施例 将显而易见。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图 1 为质粒 pHPLT-Amy TS23t 的图谱。
[0019] 序列的简要说明
[0020] SEQ ID NO: 1示出芽孢杆菌属物种菌株TS-23淀粉酶的成熟形式的氨基酸序列。
[0021] SEQ ID N0:2示出芽孢杆菌属物种菌株TS-23淀粉酶的C-端截短形式的成熟形式 的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0022] 本发明描述了与变体α -淀粉酶相关的组合物和方法。变体淀粉酶包括突变以赋 予性能益处，例如增加的淀粉底物的水解、增强的清洁性能、提高的热稳定性、提高的储存 稳定性、增加的溶解度、改变的pH曲线、降低的钙依赖性、和/或增加的表达。在一些情况 下，性能益处在低温下实现。
[0023] 对象α -淀粉酶为芽孢杆菌属物种菌株TS-23淀粉酶（即，AmyTS23)的变体，或 者与AmyTS23共用至少60%、至少70%、至少80%、或甚至至少90%序列同一性的淀粉酶 的变体。
[0024] 本发明的淀粉酶的示例性应用是在清洁组合物的制备中，例如用于清洁衣物、盘 碟[包括人工和自动盘碟洗涤（ADW)]和其他表面，用于纺织物处理（如，退浆）的洗涤剂 组合物；在动物饲料中用于提高的可消化性，以及用于淀粉液化和糖化。所述组合物和方法 的这些及其他方面在下文详细描述。
[0025] 1.定义和首字母缩略词
[0026] 根据此详细描述，应用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则 单数形式"一个"、"一种"和"该"包括多个指代物。因此，例如，提及"一种酶"包括多个此 种酶，而提及"该剂型"，包括提及一个或多个剂型以及本领域技术人员已知的其等同物，等 等。
[0027] 本文档被组织成多个章节，以便于阅读；然而，读者将会知道，在一个章节中进行 的陈述可以应用到其他章节。因此，本公开不同章节使用的标题不应理解为限制性的。
[0028] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通 常所理解的含义。为了清楚起见，定义以下缩写和/或术语 ：
[0029] 1.1缩写/首字母缩略词
[0030] 如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外规定：
[0031] AE 醇乙氧基化物
[0032] ΑΕ0 醇乙氧基化物
[0033] AE0S 醇乙氧基硫酸盐
[0034] AES 醇乙氧基硫酸盐
[0035] AOS α -烯烃磺酸盐
[0036] AS 烧基硫酸盐
[0037] cDNA 互补 DNA
[0038] CMC 羧甲基纤维素
[0039] DNA 脱氧核糖核酸
[0040] DTMPA 二亚乙基三胺五乙酸
[0041] EC 酶学委员会
[0042] EDTA 乙二胺四乙酸
[0043] E0 环氧乙烷（聚合物片段）
[0044] GA 葡糖淀粉酶
[0045] IPTG 异丙基-β -D-硫代半乳糖苷
[0046] kDa 千道尔顿
[0047] LAS 直链烷基苯磺酸盐
[0048] LAT 地衣芽抱杆菌（B. licheniformis)淀粉酶
[0049] MW 分子量
[0050] MWU 改良的伍格母单位；1. 6 X l(T5mg/MWU =活性单位
[0051] NOBS 壬酰基氧基苯磺酸盐
[0052] NTA 次氨基乙酸
[0053] OxAm Purastar HPAM5000L (丹尼斯克美国公司（Danisco US Inc.))
[0054] PEG 聚乙二醇
[0055] PI 等电点
[0056] PVA 聚（乙烯醇）
[0057] PVP 聚（乙烯吡咯烷酮）
[0058] RNA 核糖核酸
[0059] SAS 烷基磺酸盐
[0060] SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0061] sp. 物种
[0062] TAED 四乙酰基乙二胺
[0063] w/v 重量/体积
[0064] w/w 重量/重量
[0065] v/v 体积/体积
[0066] wt% 重量百分比
[0067] V 摄氏度
[0068] H20 水
[0069] dH20或者DI去离子水
[0070] dIH20 去离子水，Milli-Q 过滤
[0071] g或者gm克
[0072] μ g 微克
[0073] mg 毫克
[0074] kg 千克
[0075] μ L 和 μ 1 微升
[0076] mL 和 ml 毫升
[0077] mm 毫米
[0078] μ m 微米
[0079] Μ 摩尔浓度
[0080] mm 毫摩尔浓度
[0081] μπι 微摩尔浓度
[0082] U 单位
[0083] sec 秒
[0084] min (s)分钟
[0085] hr(s) 小时
[0086] DO 溶解氧
[0087] Ncm 牛顿厘米
[0088] EtOH 乙醇
[0089] eq. 当量
[0090] N 当量浓度
[0091] ds或DS 干固形物含量
[0092] 1. 2 定义
[0093] 术语"淀粉酶"或"淀粉分解酶"是指除其他方面外还能够催化淀粉的降解的 酶。α-淀粉酶为裂解淀粉中的a-D-(1 - 4)0-糖苷键的水解酶。一般来讲，α-淀粉酶 (EC 3. 2. 1. 1 ; a -D-(1 - 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶）定义为以随机方式裂解淀粉分子内的 a -D- (1 - 4) 0-糖苷键从而生成含有三个或更多个（1-4) - α -连接的D-葡萄糖单元的多 糖的内切作用酶。相反地，外切淀粉分解酶如β -淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2 ; a -D-(l - 4)-葡 聚糖麦芽糖水解酶）和一些产物特异性淀粉酶如麦芽糖α -淀粉酶（EC 3. 2. 1. 133)从底 物的非还原端裂解多糖分子。β -淀粉酶、α -葡萄糖苷酶（EC 3. 2. 1. 20 ; a -D-葡糖苷葡 萄糖水解酶）、葡萄糖淀粉酶（EC 3. 2. 1. 3 ; a -D-(l - 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶）和产物特 异性淀粉酶如麦芽四糖苷酶（EC 3. 2. 1. 60)和麦芽六糖苷酶（EC 3. 2. 1. 98)可产生特定长 度的麦芽低聚糖。一些细菌α-淀粉酶主要从淀粉和相关的α-1，4-葡聚糖产生麦芽四糖 (G4)、麦芽五糖（G5)或麦芽六糖（G6)，而大多数α-淀粉酶进一步将它们转化为葡萄糖和 /或麦芽糖作为最终产物。
[0094] 如本文所用，术语"淀粉"指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何材料，由具 有式（C 6H1(l05)x (其中X可以是任何数字）的直链淀粉和支链淀粉构成。该术语包括植物基 材料，如谷物、草、块茎和根，并且更具体地讲是从小麦、大麦、玉米、裸麦、大米、高梁、糠、木 薯、小米、马铃薯、甘薯和木薯获得的材料。
[0095] 关于多肽的术语"野生型"、"亲本"或"参考"是指不在一个或多个氨基酸位置处 包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语"野生 型"、"亲本"或"参考"是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注 意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵 盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。
[0096] 关于多肽的术语"变体"是指不同于特定野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多 肽，因为它在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失。类似地，关于多 核苷酸的术语"变体"是指核苷酸序列不同于指定的野生型多核苷酸、亲本多核苷酸或参考 多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的身份从上下文来看将是显而 易见的。
[0097] 当结合对象细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语"重组"表明对象已通过引入异 源核酸或蛋白质、或者变更天然的核酸或蛋白质而得到改性，或者细胞衍生自已经过此类 改性的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在天然（非重组）形式的细胞中发现的基因，或 者以不同的水平或在不同于自然界中存在的条件下表达天然基因。
[0098] 如本文所用，"可组合突变"是可用于制备组合变体的任何氨基酸位置处的突变。 可组合突变改善分子（在这种情况下，为淀粉酶）的至少一种所需特性，而未明显降低表 达、活性或稳定性。可组合突变可分组如下：
[0099] 级1:产生这样的变体的突变：其中关于（i)蛋白质表达、（ii)活性、（iii)在pH 8(16°C、32°C或50°C )或pH10(16°C或50°C )下的CS-28微样片活性、和（iv)洗涤剂稳定 性或热稳定性，相对于确定亲本蛋白质的最低性能指数（PI)大于或等于0.9,并且另外关 于这些测试中的任一者具有大于或等于1. 0的PI。
[0100] 组卫:产生这样的变体的突变：其中关于⑴蛋白质表达、（ii)活性、（iii)在pH 8(16°C、32°C或50°C )或pH10(16°C或50°C )下的CS-28微样片活性、和（iv)洗涤剂稳定 性或热稳定性，相对于确定亲本蛋白质的最低性能指数（PI)大于或等于0.8,并且另外关 于这些测试中的任一者具有大于或等于1. 2的PI。
[0101] 级￡:产生这样的变体的突变：其中关于⑴蛋白质表达、（ii)活性、（iii)在pH 8(16°C、32°C或50°C )或pH10(16°C或50°C )下的CS-28微样片活性、和（iv)洗涤剂稳定 性或热稳定性，相对于确定亲本蛋白质的最低性能指数（PI)大于或等于0.5,并且另外关 于这些测试中的任一者具有大于或等于1. 5的PI。
[0102] 可组合突变的特性汇总于下表中。
[0103] 表A.毎鉬可鉬合突夺的件能特件
[0104]
【权利要求】
1. 一种变体α-淀粉酶多肽，其在有效氨基酸位置包含至少一个可组合突变；其中： (i) 所述可组合突变为与亲本α -淀粉酶相比，改善所述变体α -淀粉酶的至少一种所 需特性，而与亲本α-淀粉酶相比，未显著降低所述变体α-淀粉酶的表达、活性或稳定性 的突变， (ii) 所述有效位置为可用多个不同的氨基酸残基置换的氨基酸位置，所有所述置换导 致符合（i)的所述要求的变体α-淀粉酶，并且 (iii) 所述可组合突变列在表C或表D中，其使用SEQ ID NO:2进行编号。
2. 根据权利要求1所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变具有表A中列出的性能特 性。
3. 根据权利要求1所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变产生变体，其中关于（i)蛋 白质表达、（ii)活性、（iii)微样片活性、和（iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于所述亲 本淀粉酶的最低性能指数（PI)大于或等于0.9,并且另外关于这些特性中的任一者，PI大 于或等于1.0。
4. 根据权利要求1所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变产生变体，其中关于（i)蛋 白质表达、（ii)活性、（iii)微样片活性、和（iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于所述亲 本淀粉酶的所述最低性能指数（PI)大于或等于0.8,并且另外关于这些测试中的任一者具 有大于或等于1.2的PI。
5. 根据权利要求1所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变产生变体，其中关于（i)蛋 白质表达、（ii)活性、（iii)微样片活性、和（iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于所述亲 本淀粉酶的所述最低性能指数（PI)大于或等于0.5,并且另外关于这些测试中的任一者具 有大于或等于1.5的PI。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变的可持续性得 分为 +++、++++ 或 +++++。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变的可持续性得 分为 ++++ 或 +++++。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变的可持续性得 分为+++++〇
9. 根据前述权利要求中任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变的有效性得分 为1或2。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本α -淀粉酶与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60%氨基酸序列同一性。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本α -淀粉酶与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2的所述氨基酸序列具有至少70%氨基酸序列同一性。
12. 根据前述权利要求中任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本α -淀粉酶与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的所述氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性。
13. 根据前述权利要求中任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本α -淀粉酶与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2的所述氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列同一性。
14. 一种组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的变体淀粉酶。
15. 根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物对于从衣物、盘碟或纺织物除去 含淀粉污渍是有效的。
16. 根据权利要求14或15所述的组合物，其还包含表面活性剂。
17. 根据权利要求14-16中任一项所述的组合物，其中所述组合物为洗涤剂组合物。
18. 根据权利要求14-17中任一项所述的组合物，其中所述组合物为衣物洗涤剂或衣 物洗涤添加剂。
19. 根据权利要求14-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物为人工或自动盘碟 洗涤剂。
20. -种从表面除去含淀粉污渍或污垢的方法，所述方法包括： 在包含有效量的根据权利要求1-13中任一项所述的变体淀粉酶的含水组合物的存在 下温育所述表面， 让所述多肽水解所述含淀粉污渍中存在的淀粉组分以产生溶解于所述含水组合物中 的较小淀粉衍生分子，以及 清洗所述表面， 从而从所述表面上移除所述含淀粉污渍。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述含水组合物还包含表面活性剂。
22. 根据权利要求20或21所述的方法，其中所述表面为纺织物表面。
23. 根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述表面为在盘碟上。
24. 根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述表面为染污的硬质表面。
25. -种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1-13中任一项所述的多肽。
26. -种表达载体，其包含根据权利要求25所述的多核苷酸。
27. -种宿主细胞，其包含根据权利要求26所述的表达载体。
【文档编号】C12N9/24GK104066838SQ201280063219
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2011年12月22日
【发明者】L·G·卡斯康-佩雷拉, M·科尔克曼 申请人:丹尼斯科美国公司