一种中温α-淀粉酶高产菌株及其构建方法

专利名称：一种中温α-淀粉酶高产菌株及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其是一种中温a-淀粉酶高产菌株及其构建方法。
背景技术：
a-淀粉酶(a-l，4-glucan-glucanhydrolaseEC 3.2丄1)又称为液化型淀粉酶，它能从淀粉分 子的内部任意切开a-l,4糖苷键，从而产生分子量比较小的麦芽糖糊精。淀粉在a-淀粉酶 的作用下，淀粉分子会迅速降解，粘度下降，即完成液化。a-淀粉酶具有相当大的商业价 值，广泛应用于淀粉深加工工业、酒精工业、啤酒工业、柠檬酸工业、味精及淀粉糖化工 业、制药工业及纺织业。(X-淀粉酶可由微生物发酵产生，也可由植物、动物提取，目前工 业生产上大都以微生物发酵法大规模生产a-淀粉酶。枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪 芽抱杆菌、米曲霉、黑曲霉等都是有实用价值的a-淀粉酶产生菌，由枯草芽孢杆菌AS 1.108 生产的中温a-淀粉酶被广泛应用于淀粉深加工行业。
目前，现行大规模工业化淀粉水解工艺中的主流方向为使用耐高温a-淀粉酶对淀粉进 行瞬间高温喷射液化，液化时淀粉醪的内部温度达到105-110°C。其应用方法是1、在啤 酒酿造过程中，待辅料与水混合均匀后， 一次加入淀粉酶，迅速升温，在95-97°C，保温 30min左右。2、在酒精生产中，加入淀粉酶，pH6.5-7.0，搅匀后用泵送入蒸煮锅或连续 蒸煮加热器，温度可控制在100±5°C，时间为100min，冷却后糖化。3、在味精、淀粉糖 行业应用时，调整pH至6.0-6.5，加入淀粉酶。如采用间隔液化，在液化罐中可迅速升温 至100i5。C，在95-100'C保温30min以上；如采用喷射液化，喷射温度可在105。C左右， 并在95X:保温60-120 min。耐高温a-淀粉酶由于其热稳定性好，适合于在高温下液化淀粉， 因此被广泛应用食品、制药等行业。
但是，在水解过程中，由于需要长时间保温，在水解及发酵过程中，对工业电及汽的 消耗是相当大的。当前，我国节能减排工作己进入攻坚阶段，作为我国"十一五"规划中一 重要任务，已不仅是政府的一个行动目标，而且还是每一个企业理应承担的社会责任，让 城市居民能获得一个较好的生存环境。节能减排更是一个人类解决环境问题的必经之路。
通过攻关，为了使我国单位发酵产品耗水量、耗能量显著减少，针对酶制剂在工业应 用等方面存在的缺陷，进行新品特异酶制剂的开发、研究酶基因筛选与酶功能的智能评价 技术、研究生物酶定向改造和分子设计技术、研究酶基因高效表达技术、酶生产下游关键 技术以及酶工程在淀粉制糖、生物制品生产等中的应用技术非常重要。
因此，采用低压喷射器加热式中温连续蒸煮工艺设备对淀粉进行水解势在必行。枯草 杆菌AS 1.108a-淀粉酶是我国产量最大用途最广的一种高效液化型淀粉酶，它是由耐热性 能高的枯草杆菌经诱变后逐级扩大培养、再经提纯而获得的一种浅灰褐色粉末状有臭味的 酶制剂，主要作用是能将原料中的淀粉质液化为糊精，其在6(TC以下较为稳定，最适作用温度55-6(TC，在70-9(TC之间随着温度升高其反应速度加快，但失活也加快，在75'C下 反应10min或9(TC下工作5min，酶活力损失很少。但在75。C反应30min时，酶活力丧失 1/3; 90'C下工作30min时，酶活力几乎全部丧失。酶在pH6.0-7.0较为稳定，最适作用 pH6.0-6.5， pH5.0以下失活较严重。
最近人们逐渐使用中温-淀粉酶，由于其最适作用温度在50-7(TC左右，所以其在淀 粉糊化时具有活性，而在焙烤过程中则会逐渐失活，最终在焙烤完成时活性丧失；而且，在 加工过程中a-淀粉酶会水解淀粉生成聚合度在4-9的糊精，这些糊精也具有抗老化性。但 是，现在中温a-淀粉酶仅能从极少的一些微生物中提取。在淀粉工业中，由于a-淀粉酶在 适宜条件下对淀粉具有较强的水解能力，控制反应的条件，可以控制淀粉的水解率，从而 将淀粉水解成多孔状的多孔淀粉。淀粉在高温条件下发生糊化，因此生产多孔淀粉多采用 中温a-淀粉酶；另外，将a-淀粉酶和其它淀粉酶如糖化酶、普鲁兰酶等协同使用会提高反 应效率和淀粉成孔效果。现在多孔淀粉的研制多采用a-淀粉酶和其它酶协同反应，以淀粉 为浆料的纺织品退浆时，中温a-淀粉酶尤其适用于不耐高温的丝稠、化纤棉毛织品的退浆 工艺。
我国对细菌a-淀粉酶的研究作了大量工作。1965年我国开始应用枯草芽孢杆菌AS 1.108生产a-淀粉酶，发酵单位为200U/mL左右，以后经过长期不懈的努力，何纪春等以 AS 1.108变异株209出发，经UV和NTG复合诱变，得到诱变株8a5，产酶活力比出发株 提高17-35%，而且具有比原株生长快、产酶早的优点，中试和生产规模(x-淀粉酶活力分 别达到529U/mL和505U/mL，经济效益显著。
近年来我国酶制剂工业蓬勃发展，品种产量也不断增加，但是同国外酶制剂行业比较 尚有一段差距。国外中温a-淀粉酶发酵水平达900U/mL (60'C下测定)，而我国中温a-淀 粉酶发酵水平为300-500U/mL，因此亟需提高我国a-淀粉酶发酵水平，特别是为了节约工 业用粮，就需要运用基因工程手段，获得中温a-淀粉酶的高效表达，以显著提高经济效益 和社会效益。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种中温a-淀粉酶菌株及其构建方法； 是将经过PCR获得的枯草芽孢杆菌AS 1.108中温a-淀粉酶基因克隆到枯草芽孢杆菌表达 质粒pWB980上，并转入WB600，使中温a-淀粉酶获得高效表达。
本发明采取的技术方案是
一种中温a-淀粉酶高产菌株，其出发菌枯草芽孢杆菌AS 1.108中温a-淀粉酶基因核 苷酸序列如下
RALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYGSQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYADNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAVLYPDDIEIRCNTFFQ。
一种中温a-淀粉酶高产菌株的构建方法，其步骤是
(1) 枯草芽孢杆菌AS 1.108中温a-淀粉酶基因的获得及原核表达载体的构建；
① 获得根据genebank中已报道的枯草芽孢杆菌淀粉酶基因为依据，设计引物，利用 PCR得到中温a-淀粉酶的成熟肽基因；
上游引物P1为5- CGCGGATCC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3，下划线部分为 5awHI酶切位点；
下游引物P2: 5- CCCAAGCTT AC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3 ，下划线部分为 ///m/III酶切位点；
模板为枯草芽孢杆菌AS 1.108基因组DNA，其扩增的反应条件为95。C预变性2 min， 以95。C变性30 s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin30s，扩增30个循环，再以72 °C延伸20 min， PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化， 得到中温a-淀粉酶的成熟肽基因；
② 重组质粒pET22twwy;的构建与鉴定将得到中温a-淀粉酶的成熟肽基因和载体 pET22b用万amHI和/fz'mfll1双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4 DNA 连接酶作用下定向连接am;;至pET22b，将连接产物电击转化入DH5a感受态细菌中， 在LA(Amp)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用ScwiHI和//!>1^11 双位点单、双酶切鉴定，测序；
(2) 枯草芽孢杆菌AS 1.108中温a-淀粉酶基因的克隆和表达；
① .测序得到完整淀粉酶成熟肽基因，重新设计引物，更换酶切位点； 上游引物P3为5-CCCAAGCTT AC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3，下划线部分
为/Z/wdn酶切位点；
下游引物P4为5-CGCGGATCC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3，下划线部分为 5amHI酶切位点；
模板为重组质粒pET22b-am"扩增的反应条件为95'C预变性2min，以95'C变性 30 s， 56'C退火30s， 72。C延伸lmin30s，扩增30个循环，再以72 。C延伸20 min， PCR扩 增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化，得到PCR 纯化产物；
② .重组质粒pWB980-am_y的构建与鉴定将PCR纯化产物和载体pWB980用BawHI
和/// ^111双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下
定向连接fl，至pWB980，将连接产物化学转化入WB600感受态细菌中，在LA(Kan)
培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用S"wHI和7^"cffll双位点单、
双酶切鉴定，测序。
而且，所述将连接产物转化入DH5a感受态细菌中的电击转化的方法为
(1) 在-80°C冰箱中取出感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上预冷；
(2) 打开电击仪，调整到Ecl档，电压为1800V;
(3) 将上述连接产物10pL与感受态细菌40^L混合，在冰上震动电转杯以确保细胞与 DNA悬液位于电转杯底部；
(4) 用纸巾擦去电转杯上的冷凝水和冰渣，放入电转仪中，启动对细胞的电脉冲；
(5) 脉冲结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下迅速加入90(^LSOC培养液于电转 杯中，混匀后转入Ep管中，于37。C恒温箱中培养lh;用培养lh的电转产物涂布在LA(Amp) 平板上，倒置平皿于37。C恒温箱中培养12-16h。
而且，所述将连接产物转化入WB600感受态细菌中的化学转化的方法为(1) 将活化的WB600转接至3mlLB培养基中，37°C、 250 r/min培养过夜；取160 nl 上述培养液转接至8 ml SPI培养基，37°C ， 250 r/min培养至对数生长末期；
(2) 取0.2 ml步骤(l)获得的培养液至2 ml SPII培养基中，37°C ， 100 r/min培养90 min;
(3) 加入20ul 1Ommol/L EGTA， 37°C ， 100 r/min培养10 min;
(4) 分装成0.5ml每管，各加入5ulDNA， 37°C， 250r/min培养90 min，取菌液涂布筛 选平板。
而且，所述SPI培养基为SP盐溶液加入1 %的浓度为50。/。葡萄糖溶液、1%的 100%CAYE，其中CAYE包括2%蛋白胨及10%酵母膏。
而且，所述SPII培养基为在SPI培养基加入1%的50mmol/L CaCl2溶液、1 %的250 mmol/LMgCl2溶液。
而且，所述AS 1.108淀粉酶基因原核表达载体pWB980，大小为1112bp，具有P43 启动子，^cS信号肽序列，卡那霉素抗性标志。 本发明的优点和积极效果是
本发明利用表达载体pWB980，首次实现了去信号肽的枯草芽孢杆菌AS 1.108中温a-淀粉酶基因(flw少)在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达。该基因含有1,431个碱基， 编码447个氨基酸。经SDS-PAGE检测，重组酶(AMY)的分子质量为49.1KDa，最适 的作用温度和pH分别为6(TC和6.0。该酶的酶活是出发菌株的2倍左右，并解决了出发 菌株在发酵过程中产生的臭味和发酵周期长的难题。不但节约了工业用粮，降低了成本， 给淀粉原料的深加工提供了更好的条件，而且极大的减少了能源的消耗，更适用于工业化 的生产和应用，不仅具有重要的经济效益，也具有明显的社会效益。


图l为本发明a-淀粉酶基因与原核表达载体pET22b的构建示意图2为本发明a-淀粉酶基因与原核表达载体pWB980的构建示意图3为本发明重组酶最适温度测定曲线图4为本发明重组酶耐热性测定曲线图5为本发明重组酶最适pH测定曲线图6为本发明重组酶pH稳定性测定曲线图。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不 能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
一种中温a-淀粉酶高产菌株，其出发菌枯草芽孢杆菌AS 1.108中温a-淀粉酶基因核 苷酸序列如下
RALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYGSQFWPNITNTSAEF(5YGEILQDSASRDAAYA
DNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAVLYPDDIEIRCNTFFQ。
一种中温a-淀粉酶高产菌株的构建方法，其步骤是
1.枯草芽孢杆菌AS 1.108中温a-淀粉酶的基因的获得及测序
7(l).根据genebank中已报道的枯草芽孢杆菌淀粉酶基因为依据，设计引物，利用PCR 得到中温a-淀粉酶的成熟肽基因。
上游引物P1为5- CGCGGATCC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3 (下划线部分为
5awHI酶切位点)
下游引物P2: 5- CCCAAGCTT AC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3 (下划线部分为 ///mffll酶切位点)。模板为枯草芽孢杆菌AS 1.108基因组DNA;扩增的反应条件为95°C 预变性2min，以95。C变性30 s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin30s，扩增30个循环，再 以72 。C延伸20min， PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA 试剂盒回收纯化，以得到中温a-淀粉酶成熟肽基因；
(2).重组质粒pET22b-a考的构建与鉴定(图2):将步骤(l冲纯化的PCR产物和载体 pET22b用5"wHI和///"tfln双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4 DNA 连接酶作用下定向连接a附少至pET22b，将连接产物电击转化入DH5a感受态细菌中， 在LA(Amp)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用5頻HI和历m/ni 双位点单、双酶切鉴定，测序；
AS 1.108淀粉酶基因原核表达载体的构建方法，该电击转化的方法步骤为
a).在-8(TC冰箱中取出感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上预冷；
(2) .打开电击仪，调整到Ecl档，电压为1800V;
(3) .将上述连接产物10pL与感受态细菌40^L混合，在冰上震动电转杯以确保细胞与 DNA悬液位于电转杯底部；
(4X用纸巾擦去电转杯上的冷凝水和冰渣，放入电转仪中，启动对细胞的电脉冲； (5).脉冲结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下迅速加入卯0pLSOC培养液于电转
杯中，混匀后转入Ep管中，于37i:恒温箱中培养lh;用培养lh的电转产物涂布在LA(Amp)
平板上，倒置平皿于37'C恒温箱中培养12-16h。
2、枯草芽孢杆菌AS 1.108中温a-淀粉酶的基因的克隆和表达
a).测序得到完整淀粉酶成熟肽基因，重新设计引物，更换酶切位点
上游引物P3为5-CCCAAGCTT AC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3 (下划线部分 为历"Jin酶切位点)
下游引物P4为5-CGCGGATCC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3 (下划线部分为 S羅HI酶切位点)。模板为重组质粒pET22b-函"扩增的反应条件为95'C预变性2min， 以95°〇变性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸1 min 30s，扩增30个循环，再以72 °C延伸 20min， PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯 化；
(2).重组质粒pWB980-amy的构建与鉴定(图3):将纯化的PCR产物和载体pWB980 用万awHI和///ndl1双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4 DNA连接 酶作用下定向连接awj;至pWB980，将连接产物转化入WB600感受态细菌中，在LA(Kan) 培养基中筛选培养，将获得的转化子和对照菌株对应点接在两块含有1%可溶性淀粉的LB (20吗/ml卡那霉素)平板上，37。C培养24 h。取一块平板用I2/KI溶液(0,088 g 12 20.176 gKIl-l)染色，在另一块平板上挑取透明圈大的菌落，采用S"mffl和历"Jin双位点单、 双酶切鉴定，测序；
AS 1.108淀粉酶基因原核表达载体的构建，化学转化的方法步骤为(l).将活化的WB600转接至3ml LB培养基中，37°C， 250 r/min培养过夜。取160 pl 培养液转接至8 ml SPI培养基[SP盐溶液(0.2%( NH4)2S04, 1.4% K2HP04, 0.6% KH2P04，
0. 02% Mgs04.7H20, 0.1%柠檬酸钠)加入1 %的浓度为50%葡萄糖溶液，1 %的 100。/。CAYE(2。/。蛋白胨，10%酵母膏)]中，37°C， 250r/min培养至对数生长末期(约5 h)。
(3) .取0.2 ml培养液至2 ml SPII (SPI培养基加入1 %的50 mmol/L CaCl2溶液，1 % 的250mmol/LMgCl2溶液)培养基中，37°C， 100 r/min培养90 min 。
(4) .加入20^1 1Ommol/L EGTA， 37°C ， 100 r/min培养10min。
(5) .分装成0.5 ml每管，各加入5(alDNA， 37°C， 250r/min培养90min，取菌液涂布 筛选平板。
下面叙述中温(X-淀粉酶的表达及酶制剂制作
在活化培养基(牛肉粉5.0g， NaC12.0g，酵母粉2.0g，蛋白胨10g，粗淀粉10g， 葡萄糖50g(单消)，琼脂粉17g， H20 lOOOmL)上培养36h，挑取枯草芽孢杆菌 pWB-^^y/WB600单菌落接种到50mL种子培养基/250mL三角瓶(种子培养基配方牛肉 粉1.50g，酵母粉1.50g，蛋白胨5.00g，磷酸二氢钾(无水)1.32g，磷酸氢二钾3.68g， 葡萄糖l.OOg， NaC13.00g， H20 1000mL)， 37°C， 200r/min培养16h。然后按2%接种量 转接至50mL发酵培养基/250mL挡板三角瓶(豆饼粉26g，棉籽饼粉21g，磷酸氢二钾 28.8g，磷酸二氢钾(无水)6.7g，柠檬酸三钠2.0g，玉米浆20g， (NH4)2S04 5.0g， CaCl2 0.45g， 乳糖10g(单消)，H2O 1000mL) ， 42°C， 300r/min培养96h。
发酵液离心，去除菌体，活性碳脱色，膜过滤去除小分子物质，喷雾干燥或冷冻干燥 获得粉状酶制剂。
产品性能测定
l.a-淀粉酶活力的测定
酶活力单位定义在60'C、 pH6.0条件下，lmin液化lmg可溶性淀粉成为糊精所需 要的酶量，即为1个酶活力单位，以U/mL (U/g)表示。测定方法(QB/T1803-93)如下
1. 酶液制备用缓冲液配制成酶溶液，使其最终酶浓度控制在65U/mL-70U/mL范围之 内。2.测定(1)吸取可溶性淀粉溶液(20g/L) 20mL和磷酸缓冲液(pH=6.0) 5mL于 试管中。在60。C恒温水浴中预热3min-5min。 (2)加入稀释好的待测酶液L00mL，立即计 时，摇匀，准确反应5min。 (3)立即吸取1.00mL反应液移入预先装有O.lmol/L HC1 0.5mL 和5mL稀碘液的试管中摇匀。(4)以O.lmol/L HC1 0.5mL和5mL稀碘液的混合液作空白， 于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定吸光度(A)。根据吸光度查表，求得测试酶液 的浓度(C)。 3.计算X=CxN式中X-样品的酶活力U/mL (U/g) ; C-测试的酶液浓 度U/mL; N-样品的稀释倍数；所得结果表示至整数。
将重组菌发酵液，12000r/min离心10min去除细胞，测定上清液中的酶活(记为细胞 外酶活)。
2.01-淀粉酶性质的研究
将发酵液离心去除菌体，活性碳脱色，膜过滤去除小分子之后获得的浓縮酶液，进行 酶学性质的研究。
(1).温度对酶活力的影响① 该酶最适反应温度的测定在不同温度(30°C、 40°C、 50°C、 6(TC、 70°C、 80°C、 卯。C、 100'C) ， pH6.0的条件下测定重组酶液的酶活，将最高活力定为100% (图4)。
② 该酶的热稳定性测定将重组酶液分别置于不同温度(50°C、 60°C、 70°C、 80°C) pH6.0的条件下保温2h，每隔20min取出，各自测定其残余酶活力，以相应温度下未保 温的酶液活力为100%，绘制温度稳定性曲线(图5)。
重组a-淀粉酶的最适温度为60°C，在5(TC到7(TC之间相对酶活为80%以上。50到 7(TC保温120min，酶活基本没有损失，残余酶活保持在80%以上，与原始酶的性质基本 一致。
(2). pH对酶活力的影响
① 该酶最适反应pH的测定在不同pH值(3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0)
6(TC的下测定重组酶液的酶活，将最高活力定为100% (图6)。
② 该酶的pH稳定性测定将重组酶液在不同pH (3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0)条件下在6(TC保温60min，各自测定其残余酶活力，以相应pH下未保温的酶 活力为100%，绘制pH稳定性曲线(图7)。
原始a-淀粉酶的最适pH为6.0，在pH5.5-6.5之间，相对酶活在90%以上，pH3.5以 下完全失活。重组a-淀粉酶最适pH为6.0，在pH5.5时相对酶活达到80%。原始a-淀粉 酶在pH 5.5-6.5范围内较稳定，残余酶活为80%以上，重组a-淀粉酶在pH 5.5-6.5范围内 较稳定，残余酶活为80%以上。结果表明，原始a-淀粉酶经克隆后所得重组a-淀粉酶的 酶学特性并没有改变。SEQUENCE LISTING <110〉天津科技大学
〈120> —种中温a -淀粉酶高产菌株及其构建方法 <130> 20090224 <160〉 5
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1 〈211〉 446 〈212〉 PRT
<213>枯草芽孢杆菌AS 1. 108中温a -淀粉酶基因核苷酸序列 <400> 1
Ser Ala Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu Leu Thr Ala Pro Ser lie 15 10 15
Lys Ser Gly Thr lie Leu His Ala Trp Asn Trp Ser Phe Asn Thr Leu 20 25 30
Lys His Asn Met Lys Asp lie His Asp Ala Gly Tyr Thr Ala lie Gin 35 40 45
Thr Ser Pro lie Asn Gin Val Lys Glu Gly Asn Gin Gly Asp Lys Ser 50 55 60
Met Ser Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr His Pro Thr Ser Tyr Gin lie Gly 65 70 75 80
Asn Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gin Glu Phe Lys Glu Met Cys Ala Ala 85 90 95Ala Glu Glu Tyr Gly lie Lys Val 100
Thr Thr Ser Asp Tyr Ala Ala lie 115 120
Asn Trp Thr His Gly Asn Thr Gin 130 135
lie Val Asp Ala Val lie Asn His 105 110
Ser Asn Glu Val Lys Ser lie Pro 125
lie Lys Asn Trp Ser Asp Arg Trp 140
Asp Val Thr Gin Asn Ser Leu Leu Gly Leu Tyr Asp Trp Asn Thr Gin 145 150 155 160
Asn Thr Gin Val Gin Ser Tyr Leu Lys Arg Phe Leu Glu Arg Ala Leu 165 170 175
Asn Asp Gly Ala Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His lie Glu 180 185 190
Leu Pro Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Ser Gin Phe Trp Pro Asn lie Thr 195 200 205
Asn Thr Ser Ala Glu Phe Gin Tyr Gly Glu lie Leu Gin Asp Ser Ala 210 215 220
Ser Arg Asp Ala Ala Tyr Ala Asn Tyr Met Asp Val Thr Ala Ser Asn 225 230 235 240
Tyr Gly His Ser lie Arg Ser Ala Leu Lys Asn Arg Asn Leu Gly Val 245 250 255
Ser Asn lie Ser His Tyr Ala Ser Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Val 260 265 270
Thr Trp Val Glu Ser His Asp Thr Tyr Ala Asn Asp Asp Glu Glu Ser
275 280 285Thr Trp Met Ser Asp Asp Asp lie Arg Leu Gly Trp Ala Val lie Ala 290 295 300
Ser Arg Ser Gly Ser Thr Pro Leu Phe Phe Ser Arg Pro Glu Gly Gly 305 310 315 320
Gly Asn Gly Val Arg Phe Pro Gly Lys Ser Gin lie Gly Asp Arg Gly 325 330 335
Ser Ala Leu Phe Glu Asp Gin Ala lie Thr Ala Val Asn Arg Phe His 340 345 350
Asn Val Met Ala Gly Gin His Glu Glu Leu Ser Asn Pro Asn Gly Asn 355 360 365
Asn Gin lie Phe Met Asn Gin Arg Gly Ser His Gly Val Val Leu Ala 370 375 380
Asn Ala Gly Ser Ser Ser Val Ser lie Asn Thr Ala Thr Lys Leu Pro 385 390 395 400
Asp Gly Arg Tyr Asp Asn Lys Ala Gly Ala Gly Ser Phe Gin Val Asn 405 410 415
Asp Gly Lys Leu Thr Gly Thr lie Asn Ala Arg Ser Val Ala Val Leu 420 425 430
Tyr Pro Asp Asp lie Glu lie Arg Cys Asn Thr Phe Phe Gin 435 440 445
〈210〉 2 〈211〉 29 <212〉 腿 〈213> 上游引物Pl〈400〉 2
cgcggatccc ttacagcacc gtcgatcaa 29
〈210> 3
〈211〉 30
<212〉 腿
<213〉下游引物P2
〈400〉 3
cccaagctta ctcaatgggg aagagaaccg 30
<210〉 4
<211> 31
〈212〉 腿
〈213〉 上游引物P3
<400〉 4
cccaagctta ccttacagca ccgtcgatca a 31
〈210> 5
〈211> 28
〈212> 画 〈213〉下游引物P4
<400> 5
cgcggatcct caatggggaa gagaaccg 28
权利要求
1、一种中温α-淀粉酶高产菌株，其特征在于其出发菌枯草芽孢杆菌AS1.108中温α-淀粉酶基因核苷酸序列如下SAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTAIQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYHPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNEVKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYGSQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVESHDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNVMAGQHEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAVLYPDDIEIRCNTFFQ。
2、 一种如权利要求l所述的中温a-淀粉酶高产菌株的构建方法，其特征在于其步骤是.(1) 枯草芽孢杆菌AS 1.108中温a-淀粉酶基因的获得及原核表达载体的构建；① 获得根据genebank中已报道的枯草芽孢杆菌淀粉酶基为依据，设计引物，利用PCR 得到中温a-淀粉酶的成熟肽基因；上游引物P1为5- CGCGGATCC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3，下划线部分为 SawHI酶切位点；下游引物P2: 5- CCCAAGCTTAC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3，下划线部分为 历m/in酶切位点；模板为枯草芽孢杆菌AS 1.108基因组DNA，其扩增的反应条件为95"预变性2min， 以95。C变性30 s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin30s，扩增30个循环，再以72 °C延伸20 min， PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化， 得到中温a-淀粉酶的成熟肽基因；② 重组质粒pET22b-amy的构建与鉴定将得到中温a-淀粉酶的成熟肽基因和载体 pET22b用SflwHI和///"dll双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4 DNA 连接酶作用下定向连接am;;至pET22b，将连接产物电击转化入DH5a感受态细菌中， 在LA(Amp)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用&mffl和历mmi 双位点单、双酶切鉴定，测序；(2) 枯草芽孢杆菌AS 1.108中温cx-淀粉酶基因的克隆和表达；① .测序得到完整淀粉酶成熟肽基因，重新设计引物，更换酶切位点； 上游引物P3为5-CCCAAGCTT AC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3，下划线部分为/Z/"JIII酶切位点；下游引物P4为5-CGCGGATCC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3 ，下划线部分为 5amHI酶切位点；模板为重组质粒pET22b-薩"扩增的反应条件为95。C预变性2min，以95'C变性30 s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin30s，扩增30个循环，再以72'C延伸20min， PCR扩 增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化，得到PCR 纯化产物；② .重组质粒pWB980-aw;/的构建与鉴定将PCR纯化产物和载体pWB980用^wjHI 和M"Jin双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下 定向连接cw^至pWB980,将连接产物化学转化入WB600感受态细菌中，在LA(Kan)培TGH ST YKTswGspAENs甜TEAsspYYMsDG§ w Hw G N詣:酵g肌w L wG K MT A nw隱SS F YS G N…g隐wA L Ms群GpGGGpspsssIoGpA jV EA正G虹DDDsMwToGAMFR养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用^W7HI和/Z/"dlI双位点单、双 酶切鉴定，测序。
3、 根据权利要求2所述的中温0t-淀粉酶高产菌株的构建方法，其特征在于所述将 连接产物转化入DH5a感受态细菌中的电击转化的方法为(1) 在-8(TC冰箱中取出感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上预冷；(2) 打开电击仪，调整到Ecl档，电压为1800V;(3) 将上述连接产物10pL与感受态细菌40pL混合，在冰上震动电转杯以确保细胞与 DNA悬液位于电转杯底部；(4) 用纸巾擦去电转杯上的冷凝水和冰渣，放入电转仪中，启动对细胞的电脉冲；(5) 脉冲结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下迅速加入900^iLSOC培养液于电转 杯中，混匀后转入Ep管中，于37'C恒温箱中培养lh;用培养lh的电转产物涂布在LA(Amp) 平板上，倒置平皿于37'C恒温箱中培养12-16h。
4、 根据权利要求2所述的中温a-淀粉酶高产菌株的构建方法，其特征在于所述将 连接产物转化入WB600感受态细菌中的化学转化的方法为(1) 将活化的WB600转接至3ml LB培养基中，37°C 、 250 r/min培养过夜；取160 pl 上述培养液转接至8mlSPI培养基，37°C， 250r/min培养至对数生长末期；(2) 取0.2 ml步骤(l)获得的培养液至2 ml SPII培养基中，37°C ， 100 r/min培养90 min;(3) 加入20^110mmol/L EGTA， 37°C ， 100 r/min培养10 min;(4) 分装成0.5 ml每管，各加入5^1DNA， 37°C， 250r/min培养90 min，取菌液涂布 筛选平板。
5、 根据权利要求4所述的中温a-淀粉酶高产菌株的构建方法，其特征在于所述SPI 培养基为SP盐溶液加入1 %的浓度为50%葡萄糖溶液、1%的100%CAYE，其中CAYE 包括2%蛋白胨及10%酵母膏。
6、 根据权利要求4所述的中温a-淀粉酶高产菌株的构建方法，其特征在于所述SPII 培养基为在SPI培养基加入1%的50mmol/L CaCl2溶液、1 %的250 mmol/L MgCl2溶液。
7、 根据权利要求2所述的中温a-淀粉酶高产菌株的构建方法，其特征在于所述 AS 1.108淀粉酶基因原核表达载体pWB980，大小为1112bp，具有P43启动子，sac5信 号肽序列，卡那霉素抗性标志。
全文摘要
本发明涉及一种中温α-淀粉酶菌株及其构建方法，是将经过PCR获得的枯草芽孢杆菌AS 1.108中温α-淀粉酶基因克隆到枯草芽孢杆菌表达质粒pWB980上，并转入WB600，使中温α-淀粉酶获得高效表达。该中温α-淀粉酶基因含有1，431个碱基，编码447个氨基酸。经SDS-PAGE检测，重组酶的分子质量为49.1KDa，最适的作用温度和pH分别为60℃和6.0。该酶的酶活是出发菌株的2倍左右，并解决了出发菌株在发酵过程中产生的臭味和发酵周期长的难题。不但节约了工业用粮，降低了成本，给淀粉原料的深加工提供了更好的条件，而且极大的减少了能源的消耗，更适用于工业化的生产和应用，不仅具有重要的经济效益，也具有明显的社会效益。
文档编号C12N15/75GK101531987SQ20091006792
公开日2009年9月16日 申请日期2009年2月24日 优先权日2009年2月24日
发明者刘逸寒, 静 孙, 王建玲, 王春霞, 路福平 申请人:天津科技大学