专利名称：Glp-1激动剂、组合物、方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及对生物活性蛋白、片段或配体特异性的哺乳动物胰 高血糖素样肽-1 (GLP-1)激动剂(例如GLP-1模拟体)、特定部分和变 体、GLP-1激动剂编码核酸和互补核酸、宿主细胞，及其制备和使 用方法，包括糖尿病相关治疗配方、使用和装置。
相关技术
重组蛋白是一类新兴的治疗剂。重组蛋白作为潜在治疗剂的用 途已提供了 一个发展治疗性蛋白制剂的机会，还包括化学修饰的用 途。此修饰可潜在地增强治疗性蛋白质的治疗效用，例如潜在地通 过增加血清半衰期(例如通过阻断其接触蛋白水解酶)、增强生物活性 和/或减少有害副作用。 一种这样的修饰是使用融合至受体蛋白的免 疫球蛋白片段如enteracept。还已使用抗体Fc结构域构建融合蛋白， 试图提供较长的半衰期或整合例如Fc受体结合、A蛋白结合和补体 结合的功能。
糖尿病是一种正在增长的流行病，估计在有效的药物治愈之前 到2025年有超过3亿人受影响。大部分糖尿病属于两种临床类型。 1型也称为青年发作糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)， 2型也称 为成年发作糖尿病，占全部病例的90-95%。
EDDM的特征在于部分或完全无能力生产胰岛素。 一般认为，1 型糖尿病由进行性自身免疫应答产生，其在有遗传倾向的个体中选 择性破坏产胰岛素的Langerhans胰岛P细胞。
诊断为2型糖尿病的患者的胰腺仍能够合成和分泌胰岛素。但是，胰岛素针对其发挥作用的组织的敏感性受损。另外，许多2型 糖尿病患者在晚期是胰岛素依赖性的，需要注射胰岛素来改善其胰 岛素抗性。
由持续升高的血浆葡萄糖水平产生的并发症包括心血管疾病、 肾病、神经病和视网膜病。通过胰岛素注射或胰岛素泵进行的胰岛
素替代疗法是EDDM的标准治疗。但是，此胰岛素的传递不受控， 经常导致患者血糖在正常范围的上下波动。胰岛素需要型糖尿病治 疗研究中的潜在替代疗法是将正常供体的胰腺或胰岛移植给糖尿病 患者。如果可使用免疫抑制疗法或其它手段在某种程度上改善移植 排斥问题，则胰腺或胰岛细胞可潜在地正常化血糖水平，恢复其中 胰岛响应于葡萄糖分泌胰岛素的生理方式。但是，除并发症伴随需 要免疫抑制方案来防止移植排斥之外，限制该方法的主要因素是人 供体组织的缺乏。另外，用于移植的活供体策略应有可能使供体变 成糖尿病患者。
对于大部分2型糖尿病患者，使用口服药物，试图通过部分地 增加胰岛素敏感性、降低胰岛素抗性和/或增加胰岛素生产来降低血 糖。然而，这样的疗法最终是无效的，例如，在许多情况下，口服 药剂是无效的或随着时间推移而变得无效，在某些阶段需要注射胰 岛素来维持合适的葡萄糖水平。
大部分当前的糖尿病治疗伴有各种严重副作用，包括低血糖和 体重增加。另外，尽管所有的干预都可用，但仍有显著数量的患者 不能将其血糖保持在可接受的范围内。因此，需要提供治疗1型和/ 或2型糖尿病以及由其产生的并发症的替代方法。
胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)是一种37个氨基酸的肽，在口服葡 萄糖挑战后由肠L细胞分泌。随后在第6和第7位之间的内源切割 产生生物活性的GLP-1 (;37)肽。GLP-1 (7-37)肽序列可分为2个结 构域。所述肽的氨基末端结构域可参与信号传导，而所述肽的其余 部分似乎结合螺旋构象中GLP-1受体的胞外环。活性GLP-1似乎响应于葡萄糖结合胰腺上的GLP-1受体，引起胰岛素分泌增力口(促胰岛
素作用)。另外，已经表明，GLP-1减少胃排空，这降低了释放入循 环中的大量葡萄糖，并可减少食物摄取。还已表明，GLP-1抑制胰 高血糖素分泌，由此减少肝脏中的储存葡萄糖的内源释放。这些作 用单独或组合地降低血糖水平。还已在体外和体内研究中表明，GLP-1 抑制凋亡，增加胰腺中(3细胞的增殖。另外，还已表明，GLP-1活性 受控于血糖水平。当血糖水平降至一定阈值水平时，GLP-1无活性。 因此，看起来几乎没有与给予动物GLP-1相关的低血糖风险。
但是，GLP-1在体内被蛋白酶二肽基-肽酶IV (DPP-IV)快速失 活。因此，涉及GLP-1肽的治疗潜在有用性受限于其快速清除和短 半衰期。例如，GLP-1 (7-37)具有仅3-5分钟的血清半衰期。GLP-l (;36) 酰胺在皮下给予时具有约50分钟的时间作用。甚至抗内源蛋白酶切 割的类似物和衍生物也不具有足够长的半衰期以避免在24小时时间 段内重复给予。例如，exenatide抗DPP-IV,但由于短半衰期和体内
药代动力学方面的明显可变性而仍需要每日两次餐前给药。目前处 于临床实验中的另一种化合物NN2211是脂化GLP-1类似物。预期 每曰给药1次。
对于期望在长时间段内保持高药物血液水平的情况，治疗剂的 快速清除是不适合的，因为那样就必须重复给予。而且，长效化合 物对其过去治疗方案已包括仅采用口服药物的糖尿病患者特别重 要。这些患者经常具有极其困难的一段时间过渡到包含多次药物注 射的方案。具有增加的半衰期的GLP-1治疗应具有超出GLP-1肽和 开发中化合物的明显优势。
因此，需要提供改良和/或修饰形式的GLP-1治疗性蛋白，其克 月艮了一个或多个这些难题以及本领域已知的其它难题。
发明概述
如本文所述和/或本文能实现的，并结合本领域所知，本发明提供人GLP-1激动剂，包括GLP-l模拟体(mimetibody),包括修饰的蛋 白、肽、免疫球蛋白、裂解产物和其它特定部分及其变体，以及GLP-1 激动剂或模拟体组合物、编码核酸或互补核酸、载体、宿主细胞、 组合物、制剂、装置、转基因动物、转基因植物，及其制备和使用 方法。
本发明还提供如本文所述和/或本领域已知的至少 一种分离的 GLP-1模拟体或特定部分或变体。该GLP-1模拟体任选可包含至少 一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与 至少一个铰链区的至少 一部分或其片段(H)直接相连，(H)与至少 一部 分可变区(V)直接相连，(V)与任选的接头序列(L)直接相连，(L)与至 少一个GLP-1治疗性肽(P)直接相连。
在一个优选实施方案中， 一对CH3-CH2-铰链-部分V区序列-接 头-治疗肽序列任选地通过締合或共价键(例如但不限于至少 一个Cys-Cys 二硫键或至少一个CH4或其它免疫球蛋白序列)连接成对。在一 个实施方案中，GLP-1模拟体包含式(I):
(I) (P(n)-L(o)國V(p)國H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至
少一个接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结 合特性而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至 少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫 球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的 至少一部分，n是l-10的整数，而o、 p、 q、 r、 s和t可独立地为0-10的整数，模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如但不限于IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl、 IgA2、 IgM、 IgD、 IgE或其任何亚型等 或其任何组合。
抗体序列的可变区序列可为但不限于SEQ ID NO 47-55中至少 一个的至少一部分或其片段，任选还包含至少一个置换、插入或缺 失。CH2、 CH3和铰链区可为但不限于SEQ ID NO 56-64中至少一个的至少一部分或其片段，任选还包含至少一个置换、插入或缺失。
(Kevin,这些序列被纳入到序列表中，但如果你想通过引用并入，那 么我们不需要它们)。
因此，本发明的GLP-1模拟体模拟抗体或免疫球蛋白结构或功 能的至少一部分连同其固有特性和功能，同时提供了 GLP-1治疗性 肽及其固有或获得的体外、体内或原位特性或活性。如本文所述并 结合本领域所知，可改变所述抗体的不同部分和本发明GLP-1模拟 体的治疗性肽部分。
如本文所述或本领域所知，本发明还提供至少一种分离的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，其具有至少一种活性，例如但 不限于与式(I)的P部分对应的至少一种生物活性GLP-1肽或多肽的 已知生物活性。
在一个方面，本发明提供至少一种分离的人GLP-1激动剂或模 拟体，其包含SEQ ID NO 1的至少一种多肽序列，或任选地具有如 本文所述或本领域已知的一个或多个置换、缺失或插入。在另一方 面，本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体模 拟对应于式(I)模拟体P部分的至少一种GLP-1肽或多肽与含至少一 种配体(例如但不限于GLP-1受体)或其片段的至少1-3至完整M酸 序列的至少一个表位结合，其中所述配体结合SEQ ID NO 1的至少 一部分，或任选地具有如本文所述或本领域已知的一个或多个置换、 缺失或插入。所述至少一种GLP-1激动剂或模拟体任选地可以至少 10 — 9 M、至少10 —1C M、至少10 —11 M、至少10 —12 M的亲和性结合 GLP-1受体。由此可按照已知方法筛选GLP-1激动剂或才莫拟体的对 应活性，例如但不限于针对受体或其片段的结合活性。
本发明还提供针对本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体的 至少一种抗独特型抗体。抗独特型抗体或片段特异性结合本发明的 至少一种GLP-1激动剂或模拟体。抗独特型抗体包括含任何分子的 蛋白或肽，其含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于重链或轻链或其配体结合部分的至少一个互补决定区(CDR)、重链或轻链
可变区、重链或轻链恒定区、构架区或其任何部分，它们竟争结合
本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体的GLP-1配体结合区。本 发明的这种独特型抗体可包括或来源于任何哺乳动物，例如但不限 于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿动物、灵长类动物等。
在一个方面，本发明提供分离的核酸分子，所述核酸分子含有 编码至少一种GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独 特型抗体或其特定部分或变体的多核苷酸和与该多核苷酸互补、具 有显著同一性或与该多核苷酸杂交的多核苷酸，包括其至少一种特 定序列、结构域、部分或变体。本发明还提供重组载体，其包含至 少一种所述分离的编码GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模 拟体抗独特型抗体的核酸分子、含此核酸和/或重组载体的宿主细胞， 以及制备和/或使用此GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟 体抗独特型抗体核酸、栽体和/或宿主细胞的方法。
还提供一种分离核酸、含分离核酸的分离核酸栽体和/或含分离 核酸的原核或真核宿主细胞，所述分离核酸编码至少一种分离的哺 乳动物GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗 体。所述宿主细胞任选为选自以下的至少一种COS-l、 COS-7、 HEK293、 BHK21、 CHO、 BSC-1、 HepG2、 653、 SP2/0、 293、 HeLa、 骨髓瘤或淋巴瘤细胞或其任何衍生物、无限增殖化或转化细胞。
本发明还提供至少一种在宿主细胞中表达至少一种GLP-1激动 剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗体或特定部分或变 体的方法，所述方法包括如本文所述和/或本领域已知在以下条件下 培养宿主细胞其中至少一种GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动
表达。还提供生产至少一种GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂 或模拟体抗独特型抗体的方法，所述方法包括在体外、体内或原位 条件下翻译编码GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或才莫拟体抗独特型抗体的核酸，使得GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或 模拟体抗独特型抗体以可检测或可回收量表达。
还提供一种用于生产本发明的至少一种分离的人GLP-1激动剂 或模拟体或GLP-1抗独特型抗体的方法，所述方法包括提供一种能 够以可回收量表达GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1抗独特型抗体的 宿主细胞或转基因动物或转基因植物。
本发明还提供通过以上方法生产的至少一种GLP-1激动剂或才莫 拟体。
本发明还提供至少一种组合物，其包含(a)本文所述的分离的 GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的编码核酸和/或GLP-1激 动剂或模拟体，和(b)合适的载体或稀释剂。所述载体或稀释剂按照 已知方法任选可为药物可接受的。所述组合物任选地还可含有至少 一种其它化合物、蛋白或组合物。
还提供一种组合物，其包含至少一种分离的人GLP-1激动剂或 模拟体和至少一种药物可接受载体或稀释剂。该组合物任选地还可 包含有效量的至少一种化合物或蛋白质，其选自至少一种糖尿病药 物、胰岛素代谢相关药物、葡萄糖代谢相关药物、可检测的标记或 报告物、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药 物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素 药物、用于流体或电解质平衡的药物、血液学药物、抗肿瘤药物、 免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部药物、营养药物、TNF拮抗 剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉剂、非类固醇抗炎药物(NTHE)、 镇痛药、麻醉药、镇静剂、局部麻醉药、神经肌肉阻断剂、抗微生 物剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生 成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、 放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药、P激动剂、 吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
本发明还提供送递治疗或预防有效量的至少一种本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的至少一种组合物、装置和/或方 法。
本发明还提供至少一种GLP-1激动剂或模拟体方法或组合物， 用于在细胞、组织、器官、动物或患者中和/或如本领域所知和/或本 文所述在相关病症之前、之后或期间给予治疗有效量，以调节或治
疗至少一种GLP-1相关病症。
本发明还在一种方法或组合物中提供至少一种GLP-1激动剂或 模拟体、特定部分或变体，其在以治疗有效量给予时用于调节、治 疗或緩解细胞、组织、器官、动物或患者中的下述至少一种症状 ^r謝疾病、免疫疾病、心血管疾病、感染性疾病、恶性疾病和/或神 经疾病，和/或如本领域所知根据多种不同病症的需要，例如但不仅 限于在相关疾病或治疗条件之前、之后或期间进行。
本发明还在一种方法或组合物中提供至少一种GLP-1激动剂或 模拟体、特定部分或变体，其在以治疗有效量给予时用于调节、治 疗或緩解下述至少一种症状糖尿病或胰岛素代谢相关疾病、葡萄 糖代谢相关疾病、骨和关节疾病、心血管疾病、牙或口腔疾病、皮 肤病、耳、鼻或咽喉疾病、内分泌或代谢疾病、胃肠疾病、妇科疾 病、肝或胆疾病、产科疾病、血液疾病、免疫或变应性疾病、感染 性疾病、肌与骨疾病、肿瘤疾病、神经疾病、营养疾病、眼疾病、 儿科疾病、中毒疾病、精神疾病、肾疾病、肺疾病或任何其它已知 疾病(参见例如The Merck Manual,笫 17版，Merck Research Laboratories, Merck and Co, Whitehouse Station, NJ (1999),其通过引 用整体结合到本文中)，所迷给予如本领域所知根据多种不同病症的 需要例如但不限于在相关疾病或治疗条件之前、之后或期间进行。
本发明还提供送递本发明的至少一种GLP-1激动剂或^^莫拟体的 至少一种组合物、装置和/或方法，用于诊断GLP-1相关病症。
本发明还提供至少一种GLP-1激动剂或模拟体方法或组合物， 用于在细胞、组织、器官、动物或患者中和/或在本领域已知和/或本文描述在相关病症之前、之后或期间诊断至少一种GLP-1相关病症。 本发明还提供用于诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的病
症的方法，包括(a)使含有效量的至少一种本发明分离人GLP-1激动
剂或模拟体的组合物接触或给予细胞、组织、器官或动物。该方法 任选地还可包括每0-24小时、1-7天、1-52周、1-24个月、1-50年 使用0.001-50 mg/kg细胞、组织、器官或动物的有效量或其间的任何 范围或值，或者在体外或原位进行的情况下使用等同的浓度或摩尔 浓度。该方法任选地还可包括通过选自以下的至少一种模式接触或 给予体外、肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、 腹内、嚢内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、 宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、 胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、^f见网膜内、脊柱内、滑 膜内、胸内、子宫内、膀胱内、药团、阴道、直肠、口腔含化、舌 下、鼻内或透皮。该方法任选地还可包括在(a)接触或给予之前、同 时或之后给予至少一种组合物，该组合物含有效量的至少一种化合 物或蛋白质，其选自以下的至少一种糖尿病药物、胰岛素代谢相 关药物、葡萄糖代谢相关药物、可检测的标记或报告物、抗感染药 物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统 (ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于流体或 电解质平4軒的药物、血液学药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、目艮、 耳或鼻药物、局部药物、营养药物、TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌 肉松弛剂、麻醉剂、非类固醇抗炎药物(NSAID)、镇痛药、麻醉药、 镇静剂、局部麻醉药、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗银屑病药、 皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球 蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑 郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药、P激动剂、吸入类固醇、肾上 腺素或类似物、细胞因子、细胞因子拮抗剂、维生素、生长因子或 抗氧化剂。还提供一种医学装置，其包含本发明的至少一种分离的人GLP-1激动剂或模拟体，其中所述装置适于通过选自以下的至少一种才莫式 接触或给予至少一种GLP-1激动剂或模拟体体外、肠胃外、皮下、 肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、嚢内、软骨内、腔内、 体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、 骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠 内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、 药团、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内或透皮。
还提供用于人类药物或诊断用途的制品，其包括包装材料和容 器，该容器含溶液或冻干形式的至少一种本发明分离人GLP-1激动 剂或模拟体。该制品任选可包括将容器作为体外、肠胃外、皮下、 肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、嚢内、软骨内、腔内、 体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、 骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠 内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、 药团、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内或透皮送递装置或系统 的组成部分。
本发明还提供本文描述的任何发明。
附图简述
图1图示了 IgGl支架中的GLP-1模拟体的核苷酸和肽序列，显
示了重要功能结构域。
图2A-2C图解了 GLP-1模拟体的FACS结合测定。
图2A表明，GLP-1模拟体结合过表达GLP-1R的HEK293细胞。
灰色GLP-1模拟体但无二抗；黑色仅二抗；红色阴性对照模
拟体和二抗；蓝色GLP-1模拟体和二抗。
图2B表明，GLP-1模拟体不结合对照HEK293细胞。灰色GLP-1
模拟体但无二抗；黑色仅二抗；蓝色GLP-1 ^^莫拟体和二抗。图2C表明，GLP-1肽类似物(A2S)能够与GLP-1模拟体竟争结 合过表达GLP-1R的HEK293细胞。灰色GLP-1模拟体但无二抗； 黑色GLP-1模拟体和二抗；橙色GLP-1模拟体、0.2 nM竟争剂、 二抗；蓝色GLP-1模拟体、20nM竟争剂、二抗；红色GLP-1模 拟体、lOOnM竟争剂、二抗。
图3A-3E图解了 GLP-1模拟体的cAMP测定。图3A: IgGl支 架中的野生型GLP-1模拟体；图3B: GLP-1肽；图3C: IgG4 (Ala/Ala, Ser—Pro)支架中的GLP-1 (A2G)模拟体；图3D: IgG4 (Ala/Ala， Ser—Pro)支架中的GLP-1 (A2S)模拟体；图3E: IgG4 (Ala/Ala， Ser—Pro) 支架中的野生型GLP-1模拟体。
图4图解了 GLP-1模拟体对DPP-IV裂解的抗性。
图5显示了在人血清中与GLP-1肽相比GLP-1模拟体的提升的 稳定性。
图6表明，GLP-1模拟体在RINm细胞中引起胰岛素分泌。图6A 表明，GLP-1 (7-36)肽和exendin-4肽在RINm细胞中刺激胰岛素释 放。图6B表明，IgGl或IgG4 (AWAla， Ser—Pro)支架中的GLP-1 (A2S) 才莫拟体或IgG4 (Ala/Ala， Ser—Pro)支架中的GLP-1 (A2G)模拟体对于 刺激RINm细胞中的胰岛素分泌有活性。
图7显示了 GLP-1模拟体对糖尿病小鼠中的禁食血糖的影响。 图7A表明GLP-1模拟体降低了禁食血糖。图7B表明所述影响是剂 量依赖性的。
图8A显示了 GLP-1模拟体在体外对分离的大鼠胰岛增殖的作 用。图8B显示了 GLP-1模拟体剂量对大鼠胰岛增殖的影响。
图9显示了 GLP-1模拟体在体外对分离的非人灵长类动物(NHP)
胰岛增殖的影响。
图10A显示了 GLP-1模拟体在体外对分离的人胰岛增殖的影 响。图IOB显示了 GLP-1模拟体剂量对人胰岛增殖的影响。
图11显示了 GLP-1模拟体在体外对分离的大鼠胰岛的胰岛素分泌的影响。
图12显示了与小鼠中的GLP-1 (A2S)模拟体(图12B)相比GLP画1 肽(图12A)的药代动力学模式。
图13显示了小鼠(图UA)、大鼠(图l犯)、猕猴(图DC)和人(图 13D)血液中的GLP-1模拟体的稳定性。
图14显示了 GLP-1模拟体在猕猴中的体内稳定性。
图15图示了在db/db小鼠(图15A)和DIO小鼠(图15B)中口服葡 萄糖挑战之后GLP-1模拟体治疗对血糖的影响。
图16表明GLP-1模拟体以剂量依赖性方式抑制细胞因子诱导的 凋亡。相对于未治疗对照的凋亡百分率对GLP-1 MMB浓度作图。
图17表明，GLP-1模拟体在INS-1E细胞中增加葡萄糖依赖性 的胰岛素分泌。A.柱形图显示了在5.5 mM葡萄糖存在下于各个 GLP-1 MMB浓度分泌的胰岛素量。另外，仅对于3和7.5 mM葡萄 糖分泌的胰岛素作图。B.分泌的胰岛素量对GLP-1 MMB浓度作图。 数据拟合为Hill方程，获得0.07 nM的EC50。
图18表明，GLP-1模拟体在大鼠胰岛(图"A)和人胰岛(图l犯) 中增加葡萄糖依赖性的胰岛素分离。
图19显示了 GLP-1 MMB治疗对正常C57/BLK6小鼠的血糖水 平的影响。
图20显示了在STZ治疗的糖尿病棵小鼠中GLP-1 MMB治疗对 血糖水平(图20A)和葡萄糖耐受(图20B)的影响，所述棵小鼠移植边 际量的人胰岛。在图20A中，血糖对接受每日IP注射的PBS治疗的 对照小鼠(X)和GLP-1 MMB治疗小鼠O)的时间(天数)作图。在第0 天移植边际量的人胰岛(50 IEQ/g),此后监测动物中的血糖。箭头表 示在去除移植的胰岛时导致迅速回复到糖尿病状态。在图20B中， 血糖对PBS治疗的对照小鼠(X)和GLP-1 MMB (0.5 mg/kg)0)的时间 (分钟)作图。在小鼠接受每日IP注射达30天以上后进行IVGTT。动 物过夜禁食，之后进行IV葡萄糖注射(1.5 g/kg)。监测小鼠的血糖，并对注射后时间作图。插图陈述了对照和GLP-1 MMB治疗小鼠的曲 纟戋下面禾口、。
图21显示了 GLP-l MMB对非人灵长类动物(NHP)胰岛中的葡
萄糖诱导性胰岛素分泌的影响。
图22显示了 GLP-l MMB对移植边际量的STZ糖尿病NHP的 外源胰岛素需求(图22A)和血红蛋白Alc(HgbAlc)(图22B)的影响。
发明详述
本发明提供分离的、重组的和/或合成的模拟体或特定部分或变 体，以及包含至少一种多核普酸的组合物和编码核酸分子，该多核 香酸编码至少一种GLP-l激动剂或模拟体。本发明的这种模拟体或 特定部分或变体含特定的GLP-l激动剂或模拟体序列、其结构域、 片段及特定变体，以及制备和应用所述核酸和模拟体或特定部分或 变体的方法，包括治疗性组合物、方法和装置。
本发明还提供如本文所述和/或本领域已知的至少一种分离的 GLP-l激动剂或模拟体或特定部分或变体。该GLP-l模拟体可任选 包含至少一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该 CH2区与至少一个铰链区或其片段(H)直接相连，(H)与至少一部分可 变区(V)直接相连，(V)与任选的接头序列(L)直接相连，(L)与至少一 个GLP-l治疗性肽(P)直接相连。
在一个优选实施方案中，GLP-l模拟体包含式(I):
(I) ((P(n)-L(o)画V(p)-H(q)-CH2(r)画CH3(s))(t) 其中P是至少一种生物活性GLP-l多肽，L是至少一个接头序
列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供
结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H
是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒
定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，
m、 n、 o、 p、 q、 r、 s和t可独立地为0-10之间并包括0和10的整数，模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如但不限于IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl、 IgA2、 IgM、 IgD、 IgE或其任何亚型等或其任 何组合。
因此，本发明的GLP-1模拟体模拟抗体结构连同抗体的固有特 性和功能，同时提供一种治疗性肽及其固有或获得的体外、体内或 原位特性或活性。在其中t-l的一个优选实施方案中，单体CH3-CH2画 铰链-部分J (J先前未描述)序列-接头-治疗性肽可通过締合或共价健 (例如但不限于Cys-Cys 二硫键)连接至其它单体。如本文所述并结合 本领域所知，可改变所述抗体的不同部分和至少一种本发明GLP-1 模拟体的GLP-1治疗性肽部分。
CH3-CH2-铰链部分可被广泛修饰，以形成符合本发明的变体， 前提是保持与补救受体的结合。在这种变体中，人们可去除一个或 多个提供本发明融合分子不需要的结构特征或功能活性的天然位 点。人们例如可通过置换或缺失残基、向位点中插入残基或截断含 位点的部分来去除这些位点。插入或置换的残基还可为改变的氨基 酸，例如肽模拟物或D-氨基酸。CH3-CH2-铰链变体可缺少一个或多 个天然位点或残基，它们影响或参与(l)二硫键形成；(2)与选定宿主 细胞不相容；(3)在选定宿主细胞中表达时的不均一性；(4)糖基化；(5) 与补体相互作用；(6)结合补救受体之外的Fc受体；或(7)抗体依赖性 细胞的细胞毒性(ADCC)。代表性的CH3-CIE-铰链变体包括以下的 分子和序列，其中1.去除了参与二硫键形成的位点。这样的去除可 避免与用于生产本发明分子的宿主细胞中存在的其它含半胱氨酸蛋 白反应。为此，半胱氨酸残基可缺失或被其它氨基酸(例如丙氨酰、 丝氨酰)取代。即便在去除半胱氨酸残基时，单链CH3-CH2-铰链结 构域仍可形成非共价保持在一起的二聚化CH3-CH2-铰链结构域；2. 修饰CH3-CH2-铰链区，以使其与选定宿主细胞更相容。例如，当分 子在如大肠杆菌的细菌细胞中表达时，人们可去除铰链中的PA序 列，该序列可由大肠杆菌中的消化酶如脯氨酸亚氨基肽酶识别；3. —部分铰链区缺失或被其它氨基酸取代，以防止在选定宿主细胞中表
达时的不均一性；4.去除一个或多个糖基化位点。通常被糖基化的 残基(例如天冬酰胺)可赋予细胞溶解响应。这样的残基可缺失或被未 糖基化残基(例如丙氨酸)取代；5.去除涉及与补体相互作用的位点， 例如Clq结合位点。补体募集可能对本发明的分子不利，所以可用 此变体避免；6.去除影响与补救受体之外的Fc受体结合的位点。 CH3-CH2-铰链区可具有与某些白细胞相互作用的位点，它们不是本 发明的融合分子必需的，所以可被去除；7.去除ADCC位点。ADCC 位点是本领域已知的，关于IgGl中的ADCC位点参见例如Molec. Immunol 29 (5) 633-9 (1992)。这些位点同样不是本发明的融合分子所 必需的，所以可去除。
接头多肽通过使激动剂或模拟体具有可变方向和结合特性来提 供结构柔性。在存在时，其化学结构不关键。接头优选由通过肽键 连接在一起的氨基酸组成。因此，在优选实施方案中，接头由通过 肽键连接的l-20个氨基酸组成，其中所述氨基酸选自20个天然氨基 酸。这些氨基酸中有一些可糖基化，这是本领域技术人员众所周知 的。在一个更优选的实施方案中，1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨 酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。再更优选地， 接头大部分由非空间位阻氨基酸如甘氨酸和丙氨酸组成。因此，优 选的接头是聚(Gly-Ser)、聚甘氨酸(具体地说为(Gly)4、 (Gly)5)、聚 (Gly-Ala)和聚丙氨酸。接头的其它特定实例是(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO:65)、 (Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQIDN0 66)、 (Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO 67)和GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO 68)。
为解释以上命名，例如(Gly)3LyS(Gly)4指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。还优选Gly和Ala的组合。此处显示的接头是代表性 的，本发明范围内的接头可长得多，并可包含其它残基。
非肽接头也是可能的。例如，可使用烷基接头，例如可使用其 中s = 2-20的-NH-(CH2)s-C(0)-。这些烷基接头还可被任何非空间位阻基团取代，所述非空间位阻基团例如为低级烷基(例如C广Q)、低
级酰基、卤素(例如Cl、 Br)、 CN、 NH2、苯基等。代表性的非肽接 头是PEG接头，其具有100-5000 kD、优选100-500 kD的分子量。 肽接头可#1改变，以和上述相同的方式形成书1"生物。
本文使用的"GLP-1肽"或"GLP-1肽、变体或衍生物"可为至少一 种GLP-1肽、GLP-1片段、GLP-1同源物、GLP-1类似物或GLP-1 衍生物。GLP-1肽具有约25至约45个天然或非天然氨基酸，它们 与天然GLP-1 (7-37)具有足够的同源性，使得它们通过结合胰腺中P 细胞上的GLP-1受体表现出促胰岛素活性。GLP-1 (7-37)具有SEQ ID NO 15的氨基酸序列His-Ala隱Glu-Gly-Thr國Phe誦Thr-Ser-Asp-Val國Ser-Ser- Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala画Ala陽Lys-Glu-Phe-De-Ala國Trp-Leu-Val-Lys- Gly-Arg-Gly。
GLP-1片段是截断GLP-1 (7-37)或其类似物或衍生物的N末端 和/或C末端的一个或多个氛基酸后获得的多肽。GLP-1同源物是其 中一个或多个氨基酸已加入到GLP-1 (7-37)或其片段或类似物的N末 端和/或C末端的肽。GLP-1类似物是其中GLP-1 (7-37)的一个或多 个氨基酸已被修饰和/或置换的肽。GLP-1类似物与GLP-1 (7-37)或 GLP-1 (7-37)的片段具有足够的同源性，使得所述类似物具有促胰岛 素活性。GLP-1衍生物被定义为以下分子其具有GLP-1肽、GLP-1 同源物或GLP-1类似物的氨基酸序列，但另外具有一个或多个其氨 基酸侧基、a-碳原子、末端氨基或末端羧睃基团的化学修饰。
本领域已知众多的活性GLP-1片段、类似物和衍生物，任何这 些类似物和衍生物中也可为本发明的GLP-1激动剂或模拟体的一部 分。本领域已知的某些GLP-1类似物和GLP-1片賴乂>开于美国专利 第5,118,666、 5,977,071和5,545,618号，以及Adelhorst等，,編C&m 269 6275 (1994)。实例包括但不限于GLP-1 (7-34)、GLP-l (7-35)、GLP-l (7-36)、 Gln9-GLP-1 (7-37)、 D-Gln9-GLP-1 (7-37)、 Thrl6-Lysl8-GLP-1 (7画37)和Lysl8-GLP画1 (7-37)。"GLP-1激动剂或模拟体"、"GLP-1激动剂或模拟体部分"或 "GLP-1激动剂或模拟体片段"和/或"GLP-l激动剂或模拟体变体"等 具有、模拟或刺激至少一种GLP-1肽、变体或衍生物(例如但不仅限 于SEQE)NO: 1中的至少一种)的至少一种生物活性，例如但不仅限 于在体外、原位和/或优选在体内的配体结合。例如，合适的GLP-1 激动剂或模拟体、特定部分或变体也可调节、增加、改变、活化至 少一种GLP-1受体信号传导或其它可测量或可检测活性。
在本发明方法和组合物中有用的GLP-1模拟体的特征在于具有 与蛋白质配体如GLP-1受体结合的合适亲和性，并任选和优选地具 有低毒性。具体而言，具有下述情况的GLP-1模拟体在本发明中有 用其中独立组分如可变区部分、恒定区(无CH1部分)和构架或其 任何部分(例如可变重链或轻链的J、 D或V区的一部分；至少一个 铰链区、恒定重链或轻链的至少 一部分等)独立地和/或共同地任选和 优选具有低免疫原性。可用于本发明的模拟体任选地特征在于其以 良好到极佳的緩解症状且低毒性长期治疗患者的能力。低免疫原性 和/或高亲和性以及其它未明特性均可有助于达到的治疗效果。"低免 疫原性"在本文被定义为在少于约75%或优选少于约50、 45、 40、 35、 30、 25、 20、 15、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2和/或1%的治疗患 者中出现显著的HAMA、 HACA或HAHA应答，和/或的治疗患者 中出现低滴度(采用双抗原酶免疫测定法检测为少于约300、优选少 于约100)(参见例如Elliott等，丄a"cef 1125-1127 (1994))。
炎>^。本发明的分离核酸可用于生成至少一种GLP-1激动剂或 模拟体、其片段或特定变体，它们可用于在细胞、组织、器官或动 物(包括哺乳动物和人类)中起作用，以调节、治疗、緩解至少一种蛋 白质相关病症，帮助预防该蛋白质相关病症发病，或减少该蛋白质 相关病症的症状，该蛋白质相关病症选自但不仅限于以下的至少一 种糖尿病相关疾病、胰岛素代谢相关疾病、葡萄糖代谢相关疾病、 免疫障碍或疾病、心血管障碍或疾病、感染性疾病、恶性疾病和/或神经障碍或疾病，以及其它已知或特定的蛋白质相关疾病。
这种方法可包括对需要该调节、治疗、緩解、预防或减少症状、 影响或机制的细胞、组织、器官、动物或患者给予有效量的组合物 或药物组合物，它们包含至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部
分或变体。该有效量可包括单次或多次给予约0.0001-500 mg/kg的 量，或单次或多次给予使血清浓度达到0.01-5000 |Lig/ml血清浓度的 量，(需要包括体外浓度)或其中的任何有效范围或数值，所述有效量 可使用本文所述或相关领域已知的方法实施和测定。
f/证。本文所引用的全部出版物或专利由于体现了与本发明同 时的本领域现状，和/或提供了本发明的描述和实现，因而被通过引 用整体结合到本文中。出版物指任何学术或专利出版物，或可以任 何媒介形式获得的任何其它资料，包括所有记录的、电子的或打印 的形式。下述参考文献通过引用整体结合到本文中Ausubel等编辑， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc, NY, NY (1987-2005); Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,笫 2版，Cold Spring Harbor, NY (1989), Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan等编辑， Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc , NY (BAZOOS); Colligan等，Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY， NY, (1997-2005)。
本发明的模拟体。GLP-1模拟体任选地可包含至少一个CH3区， 该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与至少一个4交链 区片段的至少 一部分(H)(例如包含至少 一个核心铰链区)直接相连，(H) 与至少一部分可变区(V)直接相连，(V)与任选的接头序列(L)直接相 连，(L)与至少一个GLP-1治疗性肽(P)直接相连。在一个优选实施方 案中， 一对CH3-CH2-H-V-L-P可通过締合或共价键(例如但不限于 Cys-Cys 二硫键)连接。因此，本发明的GLP-1模拟体模拟抗体结构 连同抗体的固有特性和功能，同时提供了治疗性肽及其固有或获得的体外、体内或原位特性或活性。如本文所述并结合本领域所知， 可改变所述抗体的不同部分和至少一种本发明GLP-1模拟体的治疗 性肽部分。
因此，本发明模拟体提供至少 一种相比已知蛋白的合适特性，
例如但不限于以下的至少一种增加的半衰期、提高的活性、更为 特异的活性、提高的亲和力、提高或降低的清除率、选择的或更为 合适的活性亚型、较小免疫原性、至少一种预期疗效的质量或时程 的提高、较少副作用等。
式(I)的模拟体片段可通过本领域已知和/或本文所述的酶切、合 成或重组技术制备。利用抗体基因也可生产多种截短形式的模拟体， 该抗体基因中的一个或多个终止密码子已被导入天然终止位点的上 游。模拟体的多个部分可通过常规技术化学连接在一起，或者利用 遗传工程技术制备为连续蛋白。例如，可表达编码人类抗体链中至 少一个恒定区的核酸,以生成可用于本发明模拟体的连续蛋白。有 关单链抗体参见例如Ladner等，美国专利第4,946,778号和Bird, R.E. 等，S"e"ce, 242: 423-426 (1988)。
本文所用的术语"人模拟体"指抗体，其中期望该蛋白质的基本 每一部分(例如GLP-1肽、Ch结构域(例如Ch2、 Ch3)、铰链、V)在 人中都基本无免疫原性，仅具有较少的序列变化或变异。相对于未 修饰的人抗体或本发明模拟体而言，这种变化或变异任选并优选地 保留或降低了在人中的免疫原性。因此，人抗体和相应的本发明GLP-1 模拟体与嵌合或人源化抗体截然不同。应指出的是，GLP-1模拟体
可由能表达人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或细胞 产生。
针对合适的配体，例如分离的GLP-1受体或其部分(包括合成分 子，例如合成肽)，可设计出对其至少一种蛋白配体有特异性的人模 拟体。利用鉴定并表征至少一种蛋白质或其部分的配体结合区或序 列的已知技术，可进行该模拟体的制备。在一个优选实施方案中，本发明的至少一种GLP-1激动剂或模
拟体或特定部分或变体由至少一种细胞系、混合细胞系、无限增殖 化细胞或无限增殖化和/或培养细胞的克隆群体产生。采用合适的方
法可产生无限增殖化的蛋白质生产细胞。优选地，该至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体一般通过提供核酸或载体而制 备，该核酸或载体包含来源于至少一个人免疫球蛋白基因座的DNA 或具有与其基本相似的序列，所述至少 一个人免疫球蛋白基因座被 功能重排或可接受功能重排，所述核酸或栽体可进一步包含本文所 述的激动剂或模拟体结构，例如但不限于式(I)，其中如本领域所知， C-末端可变区部分可用作V,铰链区可被用作H, CH2可用作CH2， CH3可用作CH3。
本文所用的术语"功能重排"指来源于免疫球蛋白基因座的核酸 节段，所述免疫球蛋白基因座已经历V(D)J重组，从而生成编码免 疫球蛋白链(例如重链)或其任何部分的免疫球蛋白基因。功能重排的 免疚球蛋白基因可使用合适方法直接或间接鉴定，所述合适方法例 如为核苷酸测序、利用可退火至基因节段之间编码结合处的探针进 行的杂交(例如蛋白质印迹、RNA印迹)或采用可退火至基因节段之
间编码结合处的引物对免疫球蛋白基因进行的酶扩增(例如聚合酶链 反应)。细胞是否产生含特定可变区或含特定序列(例如至少一个P序 列)可变区的GLP-1激动剂或模拟体或部分或变体也可使用合适方法 确定。
本发明的模拟体、特定部分和变体还可如下制备使用至少一 种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的编码核酸，以提供转 基因动物或哺乳动物，例如山羊、奶牛、马、绵羊等，这些动物在 其乳汁中产生所述^^莫拟体或特定部分或变体。使用应用于抗体编码 序列的已知方法可获得所述动物。参见例如但仅限于美国专利第 5,827,690、 5,849,992、 4,873,316、 5,849,992、 5,994,616、 5，565,362、 5,304，489号等，这些专利每个均通过引用整体结合到本文中。本发明的模拟体、特定部分和变体可另外如下制备使用至少 一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的编码核酸，以提供 转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草和玉米)，其在植物 部分或由其所培养的细胞中产生所述模拟体、特定部分或变体。作 为非限制性实例，表达重组蛋白的转基因烟草叶已成功地用于提供 大量的重组蛋白，例如利用"i"导型启动子。参见例如Cramer等，Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999)及其引用的参考文献。此
外，转基因玉米或谷物也已被用于以工业生产水平表达哺乳动物蛋 白质，其具有的生物学活性等同于由其它重组系统生产的或由天然 来源纯化的蛋白。参见例如Hood等，Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999)及其引用的参考文献。包括抗体片段如单链模拟体(scFv)在内 的抗体也已被大量地从包括烟草种子和马铃薯块茎在内的转基因植 物种子中生成。参见例如Conrad等，Plant Mol Biol. 38: 101-109 (1998) 及其引用的参考文献。因此，本发明的模拟体、特定部分和变体也 可根据已知方法利用转基因植物制备。也参见例如Fischer等， Biotechnol Appl Biochem 30 99-108 (1999年10月)；Ma等，Trends Biotechnol. 13.522-7 (1995); Ma等,Plant Physiol 109 341-6 (1995); Whitelam等，Biochem Soc. Trans 22 940-944 (1994)及其中引用的参考 文献。上述参考文献通过引用整体结合到本文中。
本发明的模拟体可以广泛的亲和性(Kd)结合人蛋白配体。在一 个优选实施方案中，至少一种本发明人GLP-1激动剂或模拟体可任 选地以高亲和性结合至少一种蛋白配体。例如，至少一种本发明GLP-1 激动剂或模拟体可以等于或小于约10 —7 M的KD结合至少一种蛋白 配体，或更优选以等于或小于约0.1-9.9 (或其中的任何范围或数值)x10 一7、 10 — 8、 10 — 9、 10 —10、 10 —u、 10 — 12或10 — 13 M或其中的任何范围 或数值的Kd結合。
GLP-1激动剂或模拟体对至少一种蛋白配体的亲和性或亲和力 可采用任何合适方法经实验测定，例如用于测定抗体-抗原结合亲和性或亲和力的方法。(参见例如Berzofsky等，"Antibody-Antigen Interactions,"载于Fw"dawe"to/ /wwwwo/ogy, Paul, W.E.编4辱，Raven Press New York, NY (1984), Kuby, Janis /m聽wo/ogy, W H Freeman and Company New York, NY (1992)，及其中其描述的方法)。在不同条件
(例如盐浓度、pH)下检测时，特定GLP-l激动剂或模拟体-配体相互 作用的检测亲和性可不同。因此，优选采用GLP-l激动剂或模拟体 和配体的标准溶液，和例如本文所述或本领域已知的緩沖剂的标准 緩冲剂，测定亲和性及其它配体结合参数(例如KD、 Ka、 Kd)。
核酸分子。利用本文提供的信息，采用本文描述或本领域已知 的方法，可获得例如编码SEQIDNO 1-6中至少一个的至少90-100% 连续氨基酸以及抗体的至少一部分的核苷酸序列，其中上迷序列被 作为式(I)的P序列插入，以提供本发明的GLP-l激动剂或才莫拟体， 还包括其特定片段、变体或共有序列，或者可获得含这些序列中的 至少一种的沉积载体(deposited vector)、编码至少一种GLP-l激动剂
或模拟体或特定部分或变体的本发明核酸分子。
本发明的核酸分子可以是RNA形式，例如mRNA、 hnRNA、 tRNA 或任何其它形式，或者是DNA形式，包括但不限于通过克隆获得或 合成产生的cDNA和基因組DNA或其任何组合。该DNA可为三链、 双链或单链或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分 均可为编码链，也称为有义链，或者其可为非编码链，也称为反义 链。
本发明的分离核酸分子可包括含有可读框(ORF)并任选地具有一 个或多个内含子的核酸分子、含有GLP-l激动剂或^li拟体或特定部 分或变体的编码序列的核酸分子以及含基本上不同于上述核苷酸序 列的核苦酸序列的核酸分子，所述不同的核苷酸序列由于遗传密码 简并性其仍编码本文所述和/或本领域已知的至少一种GLP-l激动剂 或模拟体。当然，所述遗传密码是本领域周知的。因此，对本领域 技术人员而言，产生这种编码本发明特定GLP-l激动剂或模拟体或特定部分或变体的简并核酸变体是常规工作。参见例如上述Ausubel 等，这种核酸变体包括在本发明中。
如本文所指出的，包含GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变 体的编码核酸的本发明核酸分子可包括但不限于自身编码GLP-1 激动剂或模拟体片段的氨基酸序列的核酸分子；完整GLP-1激动剂 或模拟体或其部分的编码序列；GLP-1激动剂或模拟体、片段或部 分的编码序列，以及其它序列，例如至少一种信号前导肽或融合肽 的编码序列，有或没有上述其它编码序列，例如至少一个内含子， 连同其它非编码序列，包括但不仅限于非编码5'和3'序列，例如在转 录、mRNA加工(包括剪接和多腺苷酸化信号)中起作用(例如mRNA 的核糖体结合和稳定性)的转录、非翻译序列；编码其它氨基酸(例如 可提供其它功能性的氨基酸)的其它编码序列。因此，编码GLP-1激 动剂或才莫拟体或特定部分或变体的序列可融合至标记序列，例如编 码特定肽的序列，该肽有助于纯化含有GLP-1激动剂或模拟体片段 或部分的融合GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。
与本文所述多核苷酸选择性杂交的多核苷酸。本发明提供可在 选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸或包括其特定变体或部分 的其它本文公开多核苷酸杂交的分离核酸。因此，该实施方案的多
核苦酸可用于分离、检测和/或定量含有这种多核苷酸的核酸。
低或中等严格性杂交条件典型但并不专有地应用于与互补序列 相比具有较低序列同 一性的序列。中等和高严格性条件任选地可用 于较高同一性的序列。低严格性条件允许具有约40-99%序列同一性 的序列的选择性杂交，并可用于鉴定直向同源或共生同源序列。
任选地，本发明的多核苦酸编码由本文所述多核苷酸编码的 GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的至少一部分。本发明的 多核苷酸包含可用于与编码本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部 分或变体的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见例如上述Ausubel; 上述Colligan,其中每个文献均通过引用整体结合到本文中。核酸的构建。本发明的分离核酸可采用本领域熟知的(a)重组方 法、(b)合成技术、(c)纯化技术或其组合来制备。
所述核酸可方便地包含除本发明多核苷酸之外的序列。例如， 可将含 一 个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入该核酸 中，以帮助分离该多核苷酸。另外，可插入可翻译序列，以帮助分 离本发明的翻译多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本 发明蛋白质的方便途径。本发明核酸除为编码序列外，还任选地为 用于克隆和/或表达本发明多核苷酸的栽体、适体或接头。
也可加入其它序列至这种克隆和/或表达序列，以优化其在克隆 和/或表达方面的功能、帮助分离多核苷酸或促使多核香酸导入细胞 中。克隆载体、表达载体、适体和接头的用途在本领域众所周知。 参见，H口上述Ausubel或上述Sambrook。
构建核酸的重组方法。利用本领域技术人员已知的多种克隆方 法，可从生物来源中获得本发明的分离核酸组合物，例如RNA、 cDNA、基因组DNA或其任何组合。在某些实施方案中，采用在合 适的严格条件下与本发明多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针来鉴 别cDNA或基因组DNA文库中的目标序列。RNA的分离以及cDNA 和基因组文序的构建均是本领域普通技术人员熟知的。(参见例如上 述Ausubel或上述Sambrook)。
用于构建核酸的合成方法。本发明的分离核酸还可通过已知方 法经直接化学合成制备(参见例如上述Ausubel)。化学合成通常生成 单链寡核苷酸，通过与互补序列杂交，或通过使用该单链为模板用 DNA聚合酶聚合，可将该单链寡核苷酸转变为双链DNA。本领域技 术人员会认识到，尽管DNA的化学合成可被限于约100或更多个减* 基的序列，但通过连接较短序列可获得较长序列。
重组表达盒。本发明进一步提供包含本发明核酸的重组表达盒。 本发明核酸序列，例如编码本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部 分或变体的cDNA或基因组序列，可用于构建可导入至少一种期望宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒典型地将包含有效连接至转 录起动调节序列的本发明多核苷酸，其中该转录起动调节序列将引 导所述多核苷酸在预期宿主细胞中的转录。异源和非异源(即内源)启 动子均可用于引导本发明核酸的表达。
在某些实施方案中，充当启动子、增强子或其它元件的分离核 酸可被导入非异源形式的本发明多核苷酸的合适位置(上游、下游或 内含子中)，以上调或下调本发明多核芬酸的表达。例如，如本领域 所知，内源启动子可通过突变、缺失和/或取代在体内或体外被改变。 本发明多核苷酸可按所期望的有义或反义方向被表达。应当理解的 是，对有义或反义方向基因表达的控制可对可观测特征具有直接影 响。另一种抑制方法是有义抑制。导入被设定为有义方向的核酸已 被证明是阻断靶基因转录的 一种有效途径。
载体和宿主细胞。本发明还涉及包含本发明分离核酸分子的载 体、经由该重组栽体遗传改造的宿主细胞，以及通过本领域熟知的
重组技术生产至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。 参见例如上述Sambrook;上述Ausubel等，其中每个文献均通过引 用整体结合到本文中。
所述多核苷酸任选地可连接至用于在宿主内增殖的、含可选择 标记的载体。通常，采用合适的已知方法，例如电穿孔等，将质粒 载体导入细胞中，其它已知方法包括利用载体作为沉淀物，如磷酸 4丐沉淀，或利用载体与带电脂质形成复合体。如果该载体为病毒， 则可用合适包装细胞系将其体外包装，并随后将其转导入宿主细胞 中。
DNA插入片段应有效连接至合适启动子。该表达构建体还含有 任选用于转录起始、终止中的至少 一种和转录区内用于翻译的核糖 体结合位点。该构建体所表达的成熟转录物的编码部分优选包括开 始的翻译起始密码子和适宜地位于待翻译mRNA末端的终止密码子 (例如UAA、 UGA或UAG)， UAA和UAG优选用于哺乳动物或真核细力包表达。
表达载体优选但任选地包括至少一种可选择标记。这种标记包
括例知但不限于用于真核细胞培养物的氨甲蝶呤(MTX)、 二氪叶酸 还原酶(DHFR，美国专利第4,399,216、 4，634，665 、 4,656,134、 4,956,288、 5,149,636、 5,179,017号)、氨千西林、新霉素(G418)、霉 酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS,美国专利笫5,122,464、 5,770,359、 5,827,739号)抗性，和用于在大肠杆菌和其它细菌或原核生物中培养 的四环素或氨千西林抗性基因(上述专利均通过引用整体结合到本文 中)。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。合适 载体是技术人员容易明白的。将载体构建物导入宿主细胞可通过磷 酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电 穿孔、转导、感染或其它已知方法实现。本领域描述了这些方法， 例如上述Sambrook的1-4和16-18章；上述Ausubel的1、 9、 13、 15、 16章。
至少一种本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可以 以修饰形式表达，例如融合蛋白，且不仅可包括分泌信号，还可包 括其它异源功能区。例如，可将附加氨基酸(尤其是带电氨基酸)区加 入GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的N末端，以改善在宿 主细胞中、纯化期间或后续处理和保存期间的稳定性和持久性。同 样，肽部分也可加入本发明的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或 变体，以利于纯化。最终制备GLP-1激动剂或模拟体或其至少一种 片段之前可将该区域除去。这种方法在许多标准实验室手册中有描 述，例如上述Sambrook的17.29-17.42和18.1-18.74章；上述Ausubel 的16、 17和18章。
本领域一般技术人员熟知用于表达本发明蛋白质编码核酸的众 多表达系统。用于生产所述模拟体、其特定部分或变体的示例性细 胞培养物是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统通常为单层细胞形式， 但也可采用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域已发展出能够表达完整糖基化蛋白的大量合适宿主细胞系，包括COS-l (例如
ATCCCRL 1650)、 C0S画7 (例如ATCC CRL-1651)、 HEK293、 BHK21 (例如ATCC CRL-IO)、 CHO (例如ATCC CRL 1610， DG-44)和BSC-1 (例知ATCC CRL-26)细胞系、hepG2细胞、P3X63Ag8.653、 SP2/0-Agl4、 细胞、HeLa细胞等，均可容易地从例如美国典型培养物 保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, Va)获得。优选 宿主细胞包括淋巴来源的细胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。尤其优 选的宿主细胞为P3X63Ag8.653细胞(ATCC登记号CRL-1580)和 SP2/0-Agl4细胞(ATCC登记号CRL-1851)。
用于这些细胞的表达载体可包括一个或多个下述表达控制序 列，例如但不限于复制起点；启动子(例如晚期或早期SV40启动子、 CMV启动子(例如美国专利第5,168,062号、第5,385,839号)、HSVtk 启动子、pgk (磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-la启动子(例如美国专利 笫5,266,491号)、至少一种人免疫球蛋白启动子)；增强子和/或加工 信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例 如SV40大T抗原聚腺苷酸加入位点)和转录终止子序列。参见例如 上述Ausubel等；上述Sambrook等。用于本发明核酸或蛋白质的生 产的其它细胞是已知的和/或可获得的，如来自美国典型培养物保藏 中心细月包系和杂交瘤目录(American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas)(www.atcc.org)或其它已知或商业来源。
当应用真核宿主细胞时，典型地将聚腺苷酸化或转录终止序列 整合入载体中。终止序列实例是牛生长激素基因来源的聚腺苷酸化 序列。也可包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列实例是SV40 来源的VP1内含子(Sprague等，J. Virol 45 773-781 (1983))。另外，如 本领域已知，可将宿主细胞内控制复制的基因序列整合入载体中。
GLP-1激动剂或模拟体或其特定部分或变体的纯化。GLP-1激 动剂或模拟体或特定部分或变体可通过众所周知的方法由重组细胞 培养物回收及纯化，所述方法包括但不限于A蛋白纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、 疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。也可应用
高效液相层析("HPLC")进行纯化。参见例如Colligan, Current Protocols in Immunology, 或Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2002)，例如l、 4、 6、 8、 9、 10章，每个文献 均通过引用整体结合到本文中。
本发明的模拟体或特定部分或变体包括天然纯化产物、化学合 成方法的产物和通过重组技术由真核宿主(包括例如酵母、高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。根据重组生产方法中应用的宿主， 本发明GLP-l激动剂或模拟体或特定部分或变体可为糖基化或非糖 基化的，优选糖基化的。这种方法在许多标准实验室手册中有描迷， 例如上述Sambrook的17.37-17.42节；上述Ausubel的10、 12、 13、 16、 18和20章，上述Colligan, Protein Science, 12-14章，它们全部 通过引用整体结合到本文中。
模拟体、特定片段和/或变体。本发明的分离模拟体包括由本文 更完整论述的本发明任何一种多核苷酸编码的GLP-l激动剂或模拟 体或特定部分或变体，或任何分离或制备的GLP-l激动剂或模拟体 或其特定部分或变体。
优选GLP-l激动剂或模拟体或配体结合部分或变体结合至少一 个GLP-l蛋白配体，由此提供相应蛋白质或其片段的至少一种GLP-1生物活性。在治疗或诊断方面具有重要作用的不同蛋白质是本领域 熟知的，该蛋白质的合适测定或生物活性也是本领域熟知的。
对于本发明，合适的GLP-l肽、变体和衍生物的非限制性实例 为SEQ ID NO 1: His-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0画Xaall誦Xaal2國Xaal3-Xaal4画Xaal5-Xaal6國Xaal7-Xaal8-Xaal9-Xaa20画Xaa21 -Phe-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30画Xaa31，其中Xaa2是Ala、 Gly、 Ser、 Thr、 Leu、 Ile、 Val、 Glu、
Asp或Lys; Xaa3是Glu、 Asp或Lys; Xaa5是Thr、 Ala、 Gly、 Ser、Leu、 Ile、 Val、 Arg、 His、 Glu、 Asp或Lys; Xaa6是Phe、 His、 Trp 或Tyr; Xaa7是Thr或Asn; Xaa8是Ser、 Ala、 Gly、 Thr、 Leu、 Ile、 Val、 Glu、 Asp或Lys; Xaa9是Asp或Glu; XaalO是Val、 Ala、 Gly、 Ser、 Thr、 Leu、 Ile、 Met、 Tyr、 Trp、 His、 Phe、 Glu、 Asp或Lys; Xaall是Ser、 Val、 Ala、 Gly、 Thr、 Leu、 Ile、 Glu、 Asp或Lys; Xaal2 是Ser、 Val、 Ala、 Gly、 Thr、 Leu、 Ile、 Glu、 Asp或Lys; Xaal3 是Tyr、 Phe、 Trp、 Glu、 Asp或Lys; Xaal4是Leu、 Ala、 Met、 Gly、 Ser、 Thr、 Leu、 Ile、 Val、 Glu、 Asp或Lys; Xaal5是Glu、 Ala、 Thr、 Ser、 Gly、 Gln、 Asp或Lys; Xaal6是Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Leu、 Ile、 Val、 Gln、 Asn、 Arg、 Cys、 Glu、 Asp或Lys; Xaal7是Gln、 Asn、 Arg、 His、 Glu、 Asp或Lys; Xaal8是Ala、 Gly、 Ser、 Thr、 Leu、 Ile、 Val、 Arg、 Glu、 Asp或Lys; Xaal9是Ala、 Gly、 Ser、 Thr、 Leu、 Ile、 Val、 Met、 Glu、 Asp或Lys; Xaa20是Lys、 Arg、 His、 Gln、 Trp、 Tyr、 Phe、 Glu或Asp; Xaa21是Glu、 Leu、 Ala、 His、 Phe、 Tyr、 Trp、 Arg、 Gln、 Thr、 Ser、 Gly、 Asp或Lys; Xaa23是Ile、 Ala、 Val、 Leu或Glu; Xaa24是Ala、 Gly、 Ser、 Thr、 Leu、 Ile、 Val、 His、 Glu、 Asp或Lys; Xaa25是Trp、 Phe、 Tyr、 Glu、 Asp或Lys; Xaa26是Leu、 Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Ile、 Val、 Glu、 Asp或Lys; Xaa27是Val、 Leu、 Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Ile、 Arg、 Glu、 Asp或Lys; Xaa28是Lys、 Asn、 Arg、 His、 Glu或Asp; Xaa29是Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Leu、 Ile、 Val、 Arg、 Trp、 Tyr、 Phe、 Pro、 His、 Glu、 Asp或Lys; Xaa30是Arg、 His、 Thr、 Ser、 Trp、 Tyr、 Phe、 Glu、 Asp或Lys;以及Xaa31是Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Leu、 Ile、 Val、 Arg、 Trp、 Tyr、 Phe、 His、 Glu、 Asp、 Lys。
另一组优选的GLP-1肽、变体或衍生物示例于SEQ ED NO 6: His-Xaa2画Xaa3画Gly画Thr-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal O画Ser-Xaal 2-Tyr-Xaal4-Glu-Xaal 6-Xaal 7-Xaal 8-Xaal 9-Lys-Xaa21 -Phe-XaaSS-Ala-Trp-Leu-XaaZT-XaaZS-Gly-XaaSO, 其中Xaa2是Ala、 Gly或Ser; Xaa3是Glu或Asp; Xaa6是Phe或Tyr; Xaa7是Thr或Asn; Xaa8是Ser、 Thr或Ala; Xaa9是Asp或Glu; XaalO是Val、 Leu、 Met或lie; Xaal2 是Ser或Lys; Xaal4是Leu、 Ala或Met; Xaal6是Gly、 Ala、 Glu 或Asp; Xaal7是Gln或Glu; Xaal8是Ala或Lys; Xaal9是Ala、 Val、 Ile、 Leu或Met; Xaa21是Glu或Leu; Xaa23是Ile、 Ala、 Val、 Leu或Glu; Xaa27是Val或Lys; Xaa28是Lys或Asn;而Xaa30是 Arg或Glu。
这些肽可通过已公开和/或本领域已知的方法制备。序列中(以及 在整个说明书中，除非在特定情况下另有说明)的Xaa包括特定氨基 酸残基、衍生物或其修饰的氨基酸。因为酶二肽基-肽酶FV(DPP-IV) 可能是导致所观察到的给予GLP-1在体内快速失活的原因，所以优 选在激动剂或模拟体背景下受保护免遭DPP-IV活性的GLP-1肽、同 源物、类似物和衍生物。
部分地或优选基本上提供至少一种GLP-1生物活性的GLP-1激 动剂或模拟体或其特定部分或变体，可结合GLP-1配体，由此提供 至少一种活性，否则该活性是由GLP-1与至少一种配体如GLP-1受 体结合或其它蛋白质依赖或介导的机制所介导的。此处所用的术语 "GLP-1激动剂或模拟体活性"指GLP-1激动剂或模拟体，取决于测 定，其可以以约20-10,000%、优选至少约60、 70、 80、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 700、 800、 900、 1000、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000%或以上调节或引起至少一种GLP-1依赖性活性。
GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体提供至少一种蛋白质 依赖性活性的能力优选地通过本文所述和/或本领域已知的至少 一 种 合适的蛋白质生物测定来评价。本发明的人GLP-1激动剂或模拟体 或特定部分或变体可与任何类(IgG、 IgA、 IgM等)或同种型相似，并 可包含至少一部分K或人轻链。在一个实施方案中，人GLP-1激动剂或才莫拟体或特定部分或变体包含至少一种同种型(例如IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4)的IgG重链可变区片段、铰链区、CH2和CH3。
至少一种本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体结合 至少一种配体、亚单位、片段、部分或其任何组合。至少一种本发 明GLP-1激动剂或模拟体、特定部分或变体的至少一种GLP-1肽、 变体或衍生物任选地可结合该配体的至少一个特定表位。该结合表 位可包含蛋白配体(例如GLP-1受体或其部分)序列连续氨基酸的至少 1-3个氨基酸至完整指定部分的至少一种氨基酸序列的任何组合。
这种模拟体可通过下述方法制备采用已知技术将GLP-1激动
剂或模拟体的式(I)不同部分连接在一起；采用已知的重组DNA技术 或使用其它任何合适方法，例如化学合成法，制备并表达编码GLP-1激动剂或^i拟体的至少一种核酸分子。
采用本领域已知的合适方法，例如噬菌体展示(Katsube, Y等,/"〃 Mo/MW, 1(5) 863-868 (1998))或使用转基因动物的方法，可制备与人 GLP-1配体(例如受体)结合并包含限定重链或轻链可变区或其部分的 模拟体。GLP-1激动剂或模拟体、特定部分或变体可利用编码核酸 或其部分在合适宿主细胞中表达。
本发明还涉及含有与本文所述氨基酸序列基本相同的序列中氨 基酸的模拟体、配体结合片段和免疫球蛋白链。优选地，该模拟体 或其配体结合片段可以高亲和性(例如小于或等于约10 —7 M的Kd)結
合人GLP-1配体，例如受体。与本文所述序列基本相同的氨基酸序 列包括含保守氨基酸置换以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨 基酸置换指第一个氨基酸被具有与所述第一个氨基酸相似化学和/或 物理特性(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二个氨基酸置 换。保守置换包括在以下组别内一种氨基酸被另一种置换赖氨酸 (K)、精氨酸(R)和组氨酸(H);天冬氨酸(D)和谷氨酸(E);天冬酰胺(N)、 谷氨酰胺(Q);丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、 K、 R、 H、 D和 E;丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)、 F、 W和Y; C、 S和T。
氨基酸密码。组成本发明模拟体或特定部分或变体的氨基酸通 常被缩写。通过由本领域熟知的氨基酸单字母代码、三字母代码、 名称或三个核苷酸的密码子标明该氨基酸，可表示该氨基酸名称(参 见Alberts, B等，Molecular Biology of The Cell,第3版，Garland Publishing, Inc, New York, 1994》
本发明的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可包括本文 特指的来源于自然突变或人为操作的一个或多个氨基酸置换、缺失
SEQ ID NO 47-64中提出的序列。
当然，技术人员应根据包括上述因素在内的许多因素来确定氨 基酸置换的数量。 一般来说，按照本文的说明，对至少一种GLP-1 激动剂或模拟体的氨基酸置换、插入或缺失的数量不应超过40、 30、 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 12、 11、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 l个氨基酸，例如l-30或其中的任何范围或数值。
在本发明式I ((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t))中，式I的 V、 H、 CH2和CH3部分可为任何合适的人或人相容的序列，例如 图1-18和表1提供的序列，或本领域已知的序列，或其任何组合或 共有序列，或其任何融合蛋白，优选为人源的，或进行改造，以在 给予人时使免疫原性最小。
P部分可包含本领域已知或本文描述的至少一种GLP-1治疗性 肽，例如但不限于SEQ ID NO 1提供的肽或其任何组合或共有序列 或其任何融合蛋白。在一个优选实施方案中，P部分可包含至少一种 GLP-1肽，其具有SEQ ID NO 6中至少一个的序列或其任何组合或
共有序列或其任何融合蛋白。
任选的接头序列可为本领域已知的任何合适肽接头。优选序列 包括G和S的任何组合，例如X1-X2-X3-X4-. -Xn,其中X可为G或S, n可为5-30。非限制性实例包括GS、 GGS、 GGGS(SEQIDNO 16)、 GSGGGS (SEQ ID NO 17)、 GGSGGGS (SEQ ID NO 18)、 GGSGGGSGG (SEQ ID NO 19)和GGGSGGGSGG (SEQ ID NO 20)等。
在本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体中对功能而 言必不可少的氨基酸可通过本领域已知方法鉴定，例如定点诱变或 丙氛酸扫描诱变(例如上述Ausubel, 8、 15章；Cunningham和Wells, Science 244 1081-1085 (1989))。后一方法在分子中的每一个残基上均 导入单丙氨酸突变。随后，检验所获突变分子的生物活性，例如但 不限于本文指出或本领域已知的至少一种蛋白质相关活性。对GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体结合关键的位点也可通过例如结 晶、核磁共振或光亲和标记的结构分析法来鉴定(Smith等，J Mol Biol 224:899-904 (1992)和de Vos等，Science 255.306-312 (1992))。
本发明模拟体或特定部分或变体可包含式(I)的P部分，例如但 不仅限于SEQ ID NO 1和6中至少一个的至少一部分。GLP-1激动
剂或模拟体或特定部分或变体任选地还可包含为式(I)P部分的至少一 种多肽的至少一个功能部分，SEQ ID NO 1和6中至少一个的至少 90-100%。可增强或保持至少 一种上述活性的非限制性变体包括但不 限于任一上述多肽，该多肽还包含至少一种突变，该突变与不显著 影响所述GLP-1激动剂或模拟体的合适生物活性或功能的至少一个 置换、插入或缺失相对应。
在一个实施方案中，P氨基酸序列或其部分与SEQIDNO 1和6 中至少一个的相应部分的相应氨基酸序列具有约90-100%同一性(即 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100或其中的任何范围 或数值)。优选地，利用本领域已知的合适计算机算法确定90-100% 氨基酸同一性(即90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100 或其中的任何范围或数值)。
本发明模拟体或特定部分或变体可包含来源于本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的任何数量的连续氨基酸残基，其
中该数量选自GLP-1激动剂或模拟体中连续残基数的10-100%组成 的整数。任选地，此连续氨基酸的子序列在长度上为至少约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250或更多个氨基酸，或为其中任何范围或数 值的氨基酸。此外，该子序列的数量可为选自1-20的任何整数，例 如至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20或更大的整数。
技术人员应理解的是，本发明包括本发明的至少一种生物活性 GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。生物活性模拟体或特定 部分或变体具有的特定活性为天然(非合成)、内源或相关和已知的插 入或融合蛋白或特定部分或变体的活性的至少20%、 30%或40%, 优选为至少50%、 60%或70%，最优选为至少80%、 90%或95%-100%。
测定并定量检测酶活性和底物特异性的方法是本领域技术人员熟知 的。
另一方面，本发明涉及本文所述通过共价连接有机部分而被修 饰的人模拟体和配体结合片段。这种修饰可产生具有改良药代动力 学特性(例如延长的体内血清半衰期)的GLP-1激动剂或模拟体或配体 结合片段。有机部分可以是线性或分支亲水聚合基团、脂肪酸基团 或脂肪酸酯基团。在具体实施方案中，亲水聚合基团可具有约800 至约120,000道尔顿的分子量，可为聚烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、 聚丙二醇(PPG))、糖聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，脂肪 酸或脂肪酸酯基团可包含约8至约40个碳原子。
本发明的修饰模拟体和配体结合片段可包含一个或多个与GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体直接或间接地共价键合的有机部 分。与本发明GLP-1激动剂或模拟体或配体结合片段键合的各有机部分均可独立为亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。本文 所用的术语"脂肪酸"包括单羧酸和二羧酸。本文所用的术语"亲 水聚合基团"指在水中比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚 赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，本发明包括通过共价附着 聚赖氨酸而得以修饰的GLP-1激动剂或模拟体。适于修饰本发明模 拟体的亲水聚合物可为线性的或分支的，包括例知聚链烷二醇(例如
PEG、单曱氧基-聚乙二醇(mPEG)、 PPG等)、糖类(例如葡聚糖、纤 维素、寡糖、多糖等)、亲水氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨 酸、聚天冬氨酸等)、聚环氧烷(例如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和 聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明GLP-1激动剂或模拟体的亲 水聚合物作为单独分子实体时具有约800至约150,000道尔顿的分子 量。例如，可采用PEG簡、PEG懇、PEG漏、PEG婦、PEG画。、PEG,房、 PEGm,和PEG2M()()，其中下标为该聚合物的道尔顿平均分子量。
亲水聚合基团可被1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取 代。被脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水聚合物可通过应用合适的 方法制备。例如，包含胺基团的聚合物可被偶联至脂肪酸或脂肪酸 酯的羧化物，而脂肪酸或脂肪酸酯上的活性羧化物(例如经由N,N-羰 基二咪唑活化)可被偶联至聚合物上的羟基基团。
适于修饰本发明模拟体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或 者可含有一个或多个不饱和单位。适于修饰本发明模拟体的脂肪酸 包括例如n-十二烷酸(Cu,月桂酸)、n-十四烷酸(C！4，肉豆蔻酸)、n-十八烷酸(C^，硬脂酸)、n-二十烷酸(C2。，花生酸)、11-二十二烷酸((^22， 山嵛酸)、n-三十烷酸(C3。)、 11-四十烷酸((34。)、顺式-A9-十八烷酸(C,8, 油酸)、全顺式-A5,8,ll,14-二十烷四烯酸(C2。，花生四烯酸)、辛二酸、 十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括 含线性或分支低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基可包含1个至约12 个、优选1个至约6个碳原子。
修饰的人模拟体和配体结合片段可采用合适方法制备，例如通过与一种或多种修饰剂反应。本文所用的术语"修饰剂"指包含活 化基团的合适有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。"活 化基团"指一种化学部分或官能团，其可在适当条件下与第二化学 基团反应，从而在修饰剂与第二化学基团之间形成共价健。例如， 胺反应性活化基团包括亲电子基团，例如甲苯磺酸酯、曱磺酸酯、
卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可与硫醇反 应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰、丙烯酰、吡咬基二硫 化物、5-巯基-2-硝基硫代苯曱酸(TNB-硫醇)等。醛官能团可被偶联 至含有胺或酰肼的分子上，且叠氮基团可与三价磷基团反应，形成 氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将活化基团导入分子中的合适方法是本 4页域已^口的(参见{列3口 Hermanson， G.T.，万/oco"y"g加e rec/2m々w^s, Academic Press San Diego， CA (1996))。活化基团可直接地或通过接 头部分如二价C广Ci2基团(其中一个或多个碳原子可被例如氧、氮或 硫的杂原子取代)键合至有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸 酯)。合适的接头部分包括例如四乙二醇、-(CH2)3-、 -NH-(CH2)6-NH-、 -(CH2)2-NH-和-CH2-0-CH2-CHrO-CH2-CH2-0-CH-NH-。包含接头部 分的修饰剂例如可如下产生在l-乙基-3-(3-二曱基氨丙基)碳二亚胺 (EDC)存在下使单-Boc-烷基二胺(例如单Boc-乙烯二胺、单Boc-二氨 基己烷)与脂肪酸反应，以在游离胺与脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键。 可如下除去产物中的Boc保护基用三氟乙酸(TFA)处理，以暴露可 与所述另一羧酸酯偶联或可与马来酸酐反应的伯胺，并使所获产物 环化，以生成该脂肪酸的活化马来酰亚胺衍生物(参见例如Thompson 等，W0 92/16221,其通过引用整体结合到本文中)。
本发明的修饰模拟体可通过使人GLP-l激动剂或模拟体或配体 结合片段与修饰剂反应而得以生成。例如，通过应用胺反应性修饰 剂，例如PEG的NHS酯，可以非位点特异性方式将有机部分键合至 GLP-l激动剂或模拟体。修饰的人模拟体或配体结合片段也可通过 还原GLP-l激动剂或模拟体或配体结合片段的二硫键(例如链内二硫键)来制备。随后，可使还原的GLP-1激动剂或模拟体或配体结合片
段与硫醇反应性修饰剂反应，以产生本发明的修饰GLP-1激动剂或 模拟体。采用合适方法，例如反向蛋白水解(Fisch等，历oco"ywga" C72em, 3 147-153 (1992), Werlen等，说oco"7'wg加e C/2e附，5 411-417 (1994)， Kumaran等，6(10) 2233-2241 (1997), Itoh等，说oo尸g C/ 亂，24(1) 59-68 (1996)， Capellas等，5/o&c/mo/说麵g, 56(4):456-463 (1997》和Hermanson, G T,肠c呵'wg她rec/zm々wes， Academic Press: San Diego, CA (1996)中所描述的方法，可制备含有机部分的修 饰人模拟体和配体结合片段，其中所述有机部分键合至本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的特定位点。
GLP-1模拟体组合物。本发明还提供至少一种GLP-1激动剂或 模拟体或特定部分或变体组合物，其包含本文所述和/或本领域已知 的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六 种或更多种模拟体或其特定部分或变体，它们以非天然组合物、混 合物或形态提供。这种组合物的百分率以重量、体积、浓度、摩尔 浓度来计，或以本领域所知或本文所述的液体或无水溶液、混合物、 悬液、乳剂或胶体的摩尔浓度来计。
以重量、体积、浓度、摩尔浓度或本领域所知或本文所述的液 体、气体或无水溶液、混合物、悬液、乳剂或胶体的摩尔浓度计， 该组合物可包含0.00001-99.9999%或其中的任何范围或数值，例如但 不限于0.00001、 0.00003、 0.00005、 0.00009、 0.0001、 0.0003、 0.0005、 0.0009、 0.001、 0.003、 0.005、 0.009、 0.01、 0,02、 0.03、 0.05、 0.09、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0,9、 1.0、 1.1、 1.2、 1.3、 1.4、
1.5、 1.6、 1.7、 1.8、 1.9、 2.0、 2.1、 2.2、 2.3、 2.4、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3.0、 3.1、 3.2、 3.3、 3.4、 3.5、 3.6、 3.7、 3.8、 3.9、 4.0、 4.3、 4.5、
4.6、 4.7、 4.8、 4.9、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、95、 96、 97、 98、 99、 99.1、 99.2、 99.3、 99,4、 99.5、 99.6、 99.7、 99.8、 99.9%。因此，本发明的这种组合物包括但不限于0.00001-100 mg/ml 和/或0.00001-100 mg/g。
本发明提供至少一种GLP-1模拟体组合物，其在以治疗有效量 给予时促进胰岛分化、增加(3-细胞量和/或增加胰岛素分泌，以及减 少胰岛和/或产胰岛素细胞的凋亡、抑制胰高血糖素分泌、延迟胃排 空和减少食物摄取。本发明还提供至少一种GLP-1模拟体组合物， 其在以治疗有效剂量给予时在变成糖尿病的高风险个体中延迟糖尿 病发作或预防糖尿病。本发明还提供至少一种GLP-1模拟体组合物， 其在以治疗有效剂量给予时调节或治疗由于各种代谢障碍引起的高 血糖。本发明还提供至少一种GLP-1模拟体组合物，其在以治疗有 效剂量给予时调节或治疗由于疾病或障碍引起的至少一种胰腺机能 失调，所述疾病或障碍包括但不限于糖尿病、胰腺炎、胰腺肿瘤、 月夷&，癌和相关病症。
GLP-1模拟体组合物任选地还可包括有效量的至少 一种化合物 或蛋白质，其选自以下的至少一种糖尿病药物、胰岛素代谢相关 药物、葡萄糖代谢相关药物、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、 中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、 胃肠(GI)道药物、激素药物、用于流体或电解质平衡的药物、血液学 药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部药物、 营养药物等。这种药物均是本领域熟知的，包括本文所列各药物的 配方、适应症、剂量和给予(参见例如Nursing 2001 Handbook of Drugs, 第21版,Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001, Health Professional's Drug Guide 2001, Shannon, Wilson, Stang编辑,Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ, Pharmcotherapy Handbook, Wells等编辑,Appleton & Lange, Stamford, CT,各个文献均通过引用整体结合到本文中)。
糖尿病相关药物可为以下的至少一种才各列酮、胰岛素和衍生 物、磺酰脲、米格列奈、双胍、a-葡糖苷酶抑制剂、蛋白酪氨酸磷酸酶-lB、糖原合酶激酶3、糖原异生抑制剂、丙酮酸脱氢酶激酶(PDH)
抑制剂、脂解抑制剂、脂肪氧化抑制剂、肉毒碱棕榈酰转移酶I和/
或II抑制剂、(3-3肾上腺素受体激动剂、钠和葡萄糖共转运体(SGLT) 抑制剂或对以下的一种或多种起作用的化合物T细胞的至少一种自 身免疫抑制、免疫调节、活化、增殖、迁移和/或抑制细胞功能、抑 制T细胞受体/肽/MHC-II相互作用、诱导T细胞无反应性、缺失自 反应性T细胞、减少穿过血脑屏障的运输、改变促炎细胞因子(Thl) 和免疫调节细胞因子(Th2)的平衡、抑制基质金属蛋白酶抑制剂、神 经保护、减少神经胶质增生、促进髓鞘再生成。
抗感染药物可为选自以下的至少一种杀阿米巴药或抗原生动 物药、驱肠虫药、抗真菌药、抗疟药、抗结核药或抗麻风药、氨基 糖苷类药、青霉素、头孢菌素、四环素、磺胺、氟喹诺酮、抗病毒 药、大环内酯抗感染药和其它抗感染药。CV药物可为选自以下的至 少一种变力性药、抗心律不齐药、防心绞痛药、抗高血压药、抗 血脂药和其它心血管药物。CNS药物可为选自非麻醉性镇痛药中的 至少一种或选自以下的至少一种退热剂、非类固醇抗炎药、麻醉 药或阿片样镇痛药、镇静-催眠药、抗惊厥药、抗抑郁药、抗焦虑药、 抗精神病药、中枢神经系统刺激剂、抗帕金森病药和其它中枢神经 系统药物。ANS药物可为选自以下的至少一种胆碱能药物(拟副交 感神经药)、抗胆碱能药、肾上腺素能药(拟交感神经药)、肾上腺素 能阻断剂(抗交感神经药)、骨骼肌松弛药和神经肌肉阻断剂。呼吸道 药物可为选自以下的至少一种抗组胺剂、支气管舒张药、祛痰剂 或镇咳药和其它呼吸药物。GI道药物可为选自以下的至少一种抗 酸剂、吸附剂、抗气胀药、消化酶、胆结石增溶剂、止泻药、緩泻 药、止吐剂和抗溃痴药。激素药物可为选自以下的至少一种皮质 类固醇、雄激素、促蛋白合成类固醇、雌激素、孕酮、促性腺激素、 抗糖尿病药物、至少一种胰高血糖素、曱状腺激素、曱状腺激素拮 抗剂、垂体激素和类曱状旁腺药物。用于体液和电解液平衡的药物可为选自以下的至少一种利尿剂、电解质、置换溶液、酸化剂或 ^威化剂。血液药物可为选自以下的至少一种补血药、抗凝血药、 血液衍生物和溶栓酶。抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种烷基 化药物、抗代谢物、抗菌素抗肿瘤药物、可改变激素平衡的抗肿瘤 药物和其它抗肺瘤药物。免疫调节药物可为选自以下的至少一种 免疫抑制剂、疫苗、类毒素、抗毒素、抗蛇毒素、免疫血清和生物 反应调节物。眼、耳和鼻用药可为选自以下的至少一种眼科抗感 染药、眼科抗炎症药、缩瞳药、扩瞳药、眼部血管收缩剂和其它眼、 耳、鼻用药。局部用药可为选自以下的至少一种局部抗感染药、 抗齊螨剂、抗虱剂和局部皮质类固醇。营养药可为选自以下的至少 一种维生素、矿物质和热质。参见例如上述A^wra'"g Z>wg Z/aw必ooA:中的内容。
至少一种杀阿米巴药或抗原生动物药可为选自以下的至少一 种阿托伐醌、盐酸氯喹、磷酸氯喹、曱硝基羟乙唑、盐酸曱硝基 羟乙唑、戊烷脒羟乙基磺酸盐。至少一种驱肠虫药可为选自以下的 至少一种曱苯咪峻、双羟萘酸壹嗜咬、p塞苯咪唑。至少一种抗真 菌剂可为选自以下的至少一种两性霉素B、两性霉素B胆固醇基 硫酸盐复合物、两性霉素B脂质复合物、两性霉素B脂质体、氟康 唑、氟胞嗜啶、微小尺寸灰黄霉素、超微小尺寸灰黄霉素、伊曲康 唑、酮康唑、制霉菌素、盐酸特比萘芬。至少一种抗疾药可为选自 以下的至少一种盐酸氯喹、磷酸氯喹、强力霉素、硫酸羟化氯喹、 盐酸曱氟喹、磷酸伯氨喹、息疾定、含周效磺胺的息症定。至少一 种抗结核药或抗麻风药可为选自以下的至少一种氯苯吩。秦、环丝 氨酸、氨苯砜、盐酸乙胺丁醇、异烟肼、吡，秦酰胺、利福布汀、利 福平、利福喷汀、硫酸链霉素。至少一种氨基糖苷类药物可为选自 以下的至少一种硫酸卡那霉素、硫酸艮他霉素、硫酸新霉素、辟u 酸链霉素、硫酸妥布霉素。至少一种青霉素可为选自以下的至少一 种阿莫西林/棒酸钾、三水合阿莫西林、氨卡西林、氨千西林钠、三水合氨千西林、氨千西林钠/舒巴坦钠、氯唑西林钠、双氯西林钠、 美洛西林钠、萘夫西林钠、苯唑西林钠、千星青霉素G、青霉素G
钾、青霉素G普普卡因、青霉素G钠、青霉素V钾、哌拉西林钠、 哌拉西4木钠/他唑巴坦钠、替卡西林二钠、替卡西林二钠/棒酸钾。至 少一种头孢菌素可为选自以下的至少一种头孢克洛、头孢羟氨千、 头孢唑林钠、头孢地尼、盐酸头孢吡坊、头孢克肝、头孢美哇钠、 头孢尼西钠、头孢派酮钠、头孢遙將钠、头孢替坦二钠、头孢西丁 钠、头孢泊肟普塞酯、头孢丙烯、头孢他咬、头孢布坦、头孢哇肝 钠、头孢曲松钠、头孢呋辛醋氧乙酯、头孢呋辛钠、盐酸头孢氨千、 一水合头孢氨千、头孢拉定、氯碳头孢。上述至少一种四环素可为 选自以下的至少一种盐酸地美环素、强力霉素钙、盐酸多西环素 (doxycycline hyclate)、 盐酸多西环素(doxycycline hydrochloride), ~-水合强力霉素、盐酸米诺环素、盐酸四环素。至少一种磺胺可为选 自以下的至少一种增效磺胺曱基异嚼唑、磺胺嘧啶、磺胺曱基异 嗨唑、石黄胺二曱异瞎唑、石黄胺乙酰异嚼唑。至少一种氟喹诺酮可为 选自以下的至少一种曱磺酸阿拉曲伐沙星、环丙沙星、依诺沙星、 左氧呋沙星、盐酸洛美沙星、萘啶酸、氟哌酸、氧氟沙星、司帕沙 星、曱磺酸曲伐沙星。至少一种抗病毒药物可为选自以下的至少一 种硫酸阿巴卡韦、无环鸟苷钠、盐酸金刚烷胺、安普那韦、西多 福韦、曱磺酸地拉维定、去羟肌苷、依非韦伦、泛昔洛韦、福米韦 生钠、磷曱酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米呋啶、拉米呋啶/ 齐多呋啶、曱磺酸奈非那韦、内维拉平、磷酸奥司他韦、三氮唑核 苷、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那维、曱石黄酸沙奎那维、司他 呋啶、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎纳米韦、齐多呋啶。至少一种 大环内酯抗感染药可为选自以下的至少一种阿奇霉素、克拉霉素、 地红霉素、红霉素基质、无味红霉素、琥珀酸乙酰红霉素、乳糖酸 红霉素、硬脂酸红霉素。至少一种其它抗感染药可为选自以下的至 少一种氨曲南、杆菌肽、琥珀酸钠氯霉素、盐酸氯洁霉素、盐酸氯洁霉素棕榈酸酯、氯洁霉素磷酸酯、亚胺培南和西司他丁钠、美 罗培南、呋喃妥因大晶体、呋喃妥因微晶体、奎奴普丁/达福普汀、
盐酸壮观霉素、三曱氧千二氨嘧啶、盐酸万古霉素。(参见例如JVwraZ"g 200/ Drwg 7fa"必ooA:中的24-214页)。
至少一种变力性药物可为选自以下的至少一种乳酸氨联吡啶 酮、地高辛、乳酸米立农。至少一种抗心律失常药可为选自以下的 至少一种腺苷、盐酸乙胺碘呋酮、硫酸阿托品、曱苯磺酸溴千胺、 盐酸硫氮酮、双异丙吡胺、磷酸双异丙吡胺、盐酸艾司洛尔、乙酸 哌氟酰胺、富马酸伊布利特、盐酸利多卡因、盐酸麦西雷丁、盐酸 莫雷西。秦、苯妥英、苯妥英钠、盐酸普普卡因胺、盐酸普罗帕酮、 盐酸普奈洛尔、酸式硫酸奎尼定、葡糖酸奎尼定、聚半乳糖醛酸奎 尼定、硫酸奎尼定、梭达罗、盐酸妥卡尼、盐酸异搏定。至少一种 防心绞痛药可为选自以下的至少一种苯磺酸氨氯地平、亚硝酸戊 酯、盐酸千普地尔、盐酸硫氮酮、二硝酸异山梨醇酯、 一硝酸异山 梨醇酯、萘情心安、盐酸尼卡地平、硝苯吡啶、硝酸甘油、盐酸心
得安、异搏定、盐酸异搏定。至少一种抗高血压药可为选自以下的 至少一种盐酸酯丁酰心安、苯磺酸阿姆罗赫、氨酰心安、盐酸贝 那普利、盐酸贝他洛尔、富马酸比索洛尔、坎地沙坦酯、卡托普利、 盐酸山羊豆苷、卡维地洛、可乐宁、盐酸可乐宁、二氮嗪、盐酸硫 氮酮、甲磺酸多沙唑"秦、依那普利拉、马来酸依那普利、曱磺酸依 普罗沙坦、非洛地平、曱磺酸非诺多泮、福辛普利钠、醋酸氯压胍、 硫酸胍那决尔、盐酸谷氨法新、盐酸肼苯哒溱、厄贝沙坦、伊拉地 平、盐酸柳胺节心定、赖诺普利、氯沙坦钾、曱基多巴、盐酸曱基 多巴盐、琥珀酸美多心安、酒石酸美多心安、长压定、盐酸莫昔普 利、萘羟心安、盐酸尼卡地平、硝峭吡啶、乳链菌肽、硝普盐钠、
硫酸环戊丁心安、培哚普利、曱磺酸芬托拉明、心得静、盐酸哌唑 嗪、盐酸普奈洛尔、盐酸喹那普利、雷米普利、替米沙坦、盐酸特 拉唑。秦、马来酸噻吗心安、群多普利、缬沙坦、盐酸异搏定。至少一种抗血脂药可为选有以下的至少一种阿托伐他汀钓、西立伐他
汀钠、胆苯烯胺、盐酸考来替泊、非诺贝特(孩t粉化)、氟伐他丁钠、 吉非贝齐、洛伐他汀、烟酸、普伐他汀钠、辛伐他汀。至少一种综
合性CV药物可为选自以下的至少一种阿昔单抗、前列地尔、盐酸 阿布他明、西洛他唑、二硫酸氯吡格雷、双嗜啶胺醇、埃替非巴肽、 盐酸曱氧胺福林、己酮可可碱、盐酸p塞溱氯匹定、盐酸替罗非班。(参 见例如A^rw"g200/ Z)rwg/faw必ooA:中的215-336页)。
至少一种非麻醉性镇痛药或退热剂可为选自以下的至少一种 醋氨酚、阿司匹林、三水杨酸胆碱镁、二氟苯水杨酸、水杨酸酶。 至少一种非甾族抗炎药可为选自以下的至少一种塞来昔布、环氟 拉唤钾、环氟拉溱钠、伊托多雷、苯氧苯丙酸钙、氟联苯丙酸、异 丁苯丙酸、茚曱新、三水合茚曱新钠、酮丙酸、酮咯酸氨丁三醇、 萘丁美酮、甲氧萘丙酸、曱氧萘丙酸钠、丙嗪、吡氧噻嗪、罗非昔 布、舒林酸。至少一种麻醉药或阿片样镇痛药可为选自以下的至少 一种盐酸阿芬太尼、盐酸丁丙诺啡、酒石酸布托啡诺、磷酸可待 因、硫酸可待因、枸橼酸芬太尼、芬太尼透皮系统、芬太尼经粘膜、 盐酸二氬吗啡酮、度冷丁、盐酸美沙酮、盐酸吗啡、碌u酸吗啡、酒 石酸吗啡、盐酸环丁甲羟氢吗啡、盐酸羟基二氢可待因酮、梳状1,4-羟基二氢可待因酮、盐酸氧吗啡酮、盐酸镇痛新、盐酸镇痛新和盐 酸纳络酮、乳酸镇痛新、盐酸丙氧吩、萘磺酸丙氧吩、盐酸瑞芬太 尼、柠檬酸舒芬太尼、盐酸曲马多。至少一种镇痛药-催眠药可为选 自以下的至少一种水合氯醛、三唑氮、盐酸氟胺安定、戊巴比妥、 戊巴比妥钠、苯巴比妥钠、司可巴比妥钠、双香豆素、三唑苯二氮、 扎莱普隆、酒石酸唑吡坦。至少一种抗惊厥药可为选自以下的至少 一种醋唑磺胺钠、卡马西平、氯硝安定、氯氮二钾、安定、双丙 戊酸钠、乙琥胺、磷苯妥英钠、加巴喷丁、拉莫三溱、硫酸镁、苯 巴比妥、苯巴比妥钠、苯妥英、苯妥英钠、苯妥英钠(稀释)、普里米 酮、盐酸替加宾、托吡酯、丙戊酸钠、丙戊酸。至少一种抗抑郁药可为选自以下的至少一种盐酸阿米替林、双羟萘酸阿米替林、氯 哌氧、盐酸丁氨苯丙酮、氢溴酸西酞普兰、盐酸氯米帕明、盐酸脱 曱丙咪嗪、盐酸多虑平、盐酸氟西汀、盐酸丙咪。秦、双羟萘酸丙咪 嗪、米氮平、盐酸奈法唑酮、盐酸去曱替林、盐酸帕罗西汀、硫酸
苯乙肼、盐酸舍曲林、硫酸反苯环丙胺、马来酸三曱丙咪n秦、盐酸
万拉法新。至少一种抗焦虑药可为选自以下的至少一种阿普唑仑、 盐酸丁螺旋酮、曱氨二氮、盐酸甲氨二氮、氯氮二钾、安定、盐酸
多虑平、双幾萘酸终溱、盐酸羟溱、双羟萘酸羟。秦、氯羟安定、曱 丙氨酯、盐酸咪达唑仑、去曱羟安定。至少一种抗精神病药可为选
自以下的至少一种盐酸氯丙溱、氯氮平、癸酸氟非那溱、庚酸氟 非那溱、盐酸氟非那嗪、氟哌啶醇、癸酸氟哌啶醇、乳酸氟哌啶醇、 盐酸克塞平、琥珀酸克塞平、苯磺酸曱砜哒嗪、盐酸莫林酮、奥氮 平、奋乃静、哌迷清、普鲁氯嗪、富马酸喹硫平、利培酮、盐酸曱 硫哒溱、氨砜噻吨、盐酸氨砜噻吨、盐酸三氟啦。秦。至少一种中枢 神经系统刺激剂可为选自以下的至少一种硫酸安非他明、咖啡碱、 硫酸右旋安非他明、盐酸吗吡啉酮、盐酸脱氧麻黄碱、盐酸利他林、 莫达非尼、佩默林、盐酸苯丁胺。至少一种抗帕金森病药可为选自 以下的至少一种盐酸金刚胺、曱磺酸苯托品、盐酸比哌立登、乳 酸比哌立登、曱磺酸溴麦角环肽、卡比多巴-左旋多巴、恩他卡朋、 左旋多巴、曱磺酸培高利特、二盐酸普拉克索、盐酸罗匹尼罗、盐 酸司来吉兰、托卡朋、盐酸三己芬迪。至少一种其它中枢神经系统 药物可为选自以下的至少一种盐酸丁氨苯丙酮、盐酸多奈哌齐、 达哌啶醇、马来酸氟伏沙明、碳酸锂、柠檬酸锂、盐酸纳雷曲坦、 曱基丙烯酸烟碱、烟碱透皮系统、异丙酚、苯曱酸利扎曲普坦、盐 酸西布曲明、琥珀酸舒马普坦、盐酸塔克林、佐米曲普坦。(参见例 如7Vwra,"g Z)rwg Z/朋必ooA:中的337-530页)。
至少 一种胆碱能药(例如拟副交感神经药)可为选自以下的至少一 种氯化氨曱酰曱胆碱、氯化膝西隆、溴化新斯的明、甲基硫酸新斯的明、水杨酸毒扁豆碱、溴化3-二曱氨基甲酰氧基-l-甲基吡咬。
至少一种抗胆减能药可为选自以下的至少一种硫酸阿托品、盐酸
双环胺、胃长宁、莨菪碱、硫酸莱菪碱、溴化丙胺太林、东莨菪碱、 丁基溴化东茛菪^ 咸、氢溴化东茛菪^s威。至少一种肾上腺素能药(拟交 感神经药)可为选自以下的至少一种盐酸多巴酚丁胺、盐酸多巴胺、 酸式酒石酸间羟胺、酸式酒石酸去甲肾上腺素、盐酸苯肾上腺素、 盐酸假麻黄碱、硫酸假麻黄碱。至少一种肾上腺素能阻断剂(抗交感 神经药)可为选自以下的至少一种曱磺酸双氢麦角胺、酒石酸麦角 胺、马来酸二曱麦角新碱、盐酸普奈洛尔。至少一种骨骼肌松弛剂 可为选自以下的至少一种氯苯氮丁酸、肌安宁、氯羟苯唑、盐酸 环苯扎林、硝苯呋海因钠、氨曱酸愈甘醚酣、盐酸替扎尼定。至少 一种神经肌肉阻断剂可为选自以下的至少一种苯磺酸阿曲库铵、 苯磺酸顺阿曲库铵、多库氯铵、米库氯铵、泮库溴铵、哌库溴铵、 雷库溴铵、罗库溴铵、氯琥珀胆碱、氯化筒箭毒碱、维库溴铵。(参 见例如A^7"g200/ Dn/g7/a"必ooA:中的531-84页)。
至少一种抗组胺剂可为选自以下的至少一种马来酸溴苯吡胺、 盐酸西替利嗪、马来酸氯苯吡胺、富马酸铁线莲亭、盐酸二苯环庚 啶、盐酸苯海拉明、盐酸非索非那定、氯雷他定、盐酸异丙嗪、茶 异丙。秦、盐酸丙吡咯啶。至少一种支气管扩张药可为选自以下的至 少一种舒喘宁、硫酸舒喘宁、氨茶碱、硫酸阿托品、硫酸麻黄碱、 肾上腺素、酒石酸氢肾上腺素、盐酸肾上腺素、异丙托溴铵、异丙 基肾上腺素、盐酸异丙基肾上腺素、硫酸异丙基肾上腺素、盐酸左 旋沙丁胺醇、硫酸异丙喘宁、胆茶^5咸、醋酸吡布特罗、羟萘甲酸沙 美特罗、硫酸特普他林、茶碱。至少一种祛痰剂或镇咳药可为选自 以下的至少一种退咳露、磷酸可待因、硫酸可待因、氢溴酸右美 沙芬、盐酸苯海拉明、愈创木酚甘油醚、盐酸二氬吗啡酮。至少一 种其它呼吸药物可为选自以下的至少一种乙酸半胱氨酸、二丙酸 氯地米松、贝雷克坦、布地奈德、小牛表面蛋白(calfactant)、色甘酸钠、链道酶Ot、前列腺环素钠、9-去氟肤轻松、丙酸氟替卡松、孟鲁 司特钠、奈多罗米钠、帕利珠单抗、丙炎松、扎鲁司特、齐留通。(参
见例如M/ra,'"g Z>wg//a"^ooA:中的585-642页)。
至少一种抗酸剂、吸附剂或抗气胀药可为选自以下的至少一种 碳酸铝、氬氧化铝、碳酸钙、氢氧化镁铝、氮氧化镁、氧化镁、二 曱基硅油、碳酸氢钠。至少一种消化酶或胆结石增溶剂可为选自以 下的至少一种胰酶、胰脂肪酶、脱氧熊胆酸。至少一种止泻药可 为选自以下的至少一种硅镁土、碱式水杨酸铋、聚卡波非钙、盐 酸氰苯哌酯或硫酸阿托品、洛哌丁胺、醋酸奥曲肽、阿片酊、阿片 酊(含樟脑)。至少一种緩泻药可为选自以下的至少一种比沙可啶、 钙聚丙烯酸树脂、鼠李、鼠李芳香流浸膏、鼠李流浸膏、蓖麻油、 琥珀辛酯磺酸辆、琥珀辛酯磺酸钠、甘油、乳果糖、柠檬酸镁、氢 氧化镁、硫酸镁、曱基纤维素、矿物油、聚乙二醇或电解质溶液、 欧车前、番泻叶、磷酸钠。至少一种止吐剂可为选自以下的至少一 种盐酸氯丙嗪、萘苯海明、多拉司琼曱磺酸盐、屈大麻酚、盐酸 格雷西隆、盐酸氛苯千嗪、曱氧氯普胺盐酸、盐酸奥丹西隆、奋乃 静、甲哌氯丙嗪、乙二磺酸甲哌氯丙嗪、马来酸曱哌氯丙嗪、盐酸 异丙。秦、东K菪碱、马来酸硫乙哌丙嗪、盐酸曲美苄胺。至少一种 抗溃疡药可为选自以下的至少一种曱腈咪胍、盐酸曱腈咪胍、法 莫替丁、达克普隆、迷索前列醇、尼扎替丁、奥美拉唑、雷贝拉唑 钠、雷尼替丁枸橼酸铋、盐酸雷尼替丁 、硫糖铝。(参见例如M/m'"g 2(^7 Drag Z/a"必ooA:的643-95页)。
至少一种皮质类固醇可为选自以下的至少一种倍他米松、醋 酸倍他米松或倍他米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠、醋酸可的松、地 塞米松、醋酸氟美松、地塞米+^畴酸钠、醋酸氟氢可的*>、氬化可 的松、醋酸氬化可的松、氮化可的松环戊丙酸酯、氬可松磷酯钠、 氢化可的松琥珀酸钠、曱基强的松龙、醋酸曱基强的松龙、曱氬泼 尼松龙琥珀酸钠、氬化泼尼松、醋酸氢化泼尼爭>、氮化泼尼松磷酸钠、强的松龙叔丁乙酯、强的松、氟羟泊尼松龙、曲安奈德、双醋 酸去炎松。至少一种雄激素或者促蛋白合成类固醇可为选自以下的
至少一种达那唑、氟羟曱睾酮、曱睾酮、癸酸诺龙、苯丙酸诺龙、 睾酮、环戊丙酸睾酮、庚酸睾酮、丙酸睾酮、睾酮透皮体系。至少 一种雌激素或孕酮可为选自以下的至少一种酯化雌激素、雌二醇、 环戊丙酸雌二醇、雌二醇/醋炔诺酮透皮体系、戊酸雌二醇、雌激素(缀 合物)、派噪站,酮、乙炔雌二醇、乙炔雌二醇和炔雌醇、乙炔雌二醇 和双醋炔诺醇、乙炔雌二醇和炔雌醇、乙炔雌二醇和双醋炔诺醇、 乙炔雌二醇和左旋曱炔诺酮、乙炔雌二醇和炔诺酮、乙炔雌二醉和 醋炔诺酮、乙炔雌二醇和炔肟酯、乙炔雌二醇和曱基炔诺酮、乙炔 雌二醇和炔诺酮和醋酸盐和富马酸铁、左旋甲炔诺酮、醋酸曱羟孕 酮、曱氢龙和诺炔酮、炔诺酮、醋酸炔诺酮、曱基炔诺酮、黄体酮。 至少一种促性腺激素可为选自以下的至少一种乙酸加尼瑞克、醋 酸高纳瑞林、乙酸希司曲林、绝经促性素。至少一种抗糖尿病药或 胰高血糖素可为选自以下的至少一种阿卡波糖、氯磺丙脲、谷胱 甘肽、格列曱嗪、胰高血糖素、优降糖、胰岛素、盐酸曱福明二甲 双胍、米格列醇、演算吡咯列酮、瑞格列奈、马来酸罗格列酮、曲 格列酮中。至少一种甲状腺激素可为选自以下的至少一种左旋曱 状腺素钠、碘甲腺氨酸钠、复方曱状腺素、干曱状腺粉。至少一种 甲状腺激素拮抗剂可为选自以下的至少一种曱疏咪唑、坱化钾、 碘化钾(饱和溶液)、丙硫尿嗜啶、放射性硪(碘化钠1311)、浓碘溶液。 至少一种垂体激素可为选自以下的至少一种促肾上腺皮质激素、a 1-24促肾上腺皮质激素、desmophressin acetate、乙酸亮脯利特、长 效促肾上腺皮质激素、人蛋氨生长素、生长激素、加压素。至少一 种类曱状旁腺药物可为选自以下的至少一种骨化二醉、降钙素(人)、 降钙素(鮭鱼)、钙三醇、二氢速甾醇、依替膦酸二钠。(参见例如A^"/"g DragHa"必ooA:中的696-796页)。
至少一种利尿剂可为选自以下的至少一种乙酰哇胺、乙酰p坐胺钠、盐酸氨氯吡脒、丁苯氧酸、氯噻酮、利尿酸钠、利尿酸、利 尿磺胺、双氰氯噻嗪、茚磺笨酰胺、甘露醇、美拉托宗、安体舒通、 托拉塞米、三氨苯蝶啶、脲。至少一种电解质或置换溶液可为选自
以下的至少一种乙酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钩、葡乳醛酸
钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、磷酸钙(二元)、磷酸钙(三
元)、葡聚糖(高分子量)、葡聚糖(低分子量)、羟乙基淀粉、氯化镁、
硫酸镁、乙酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、Ringer氏注射 液、Ringers氏注射液(乳酸化)、氯化钠。至少一种酸化剂或4i化剂 可为选自以下的至少一种碳酸氢钠、乳酸钠、氨基丁三醇。(参见 例如iVwra/"g 200/ Dn/g/Z""必ooA:中的797-833页)。
至少一种补血药可为选自以下的至少一种富马酸铁、葡萄糖 酸铁、硫酸亚铁、硫酸亚铁(干燥)、右旋糖酐铁、l山梨醇铁、多糖-铁复合物、萄糖酸铁钠复合物。至少一种抗凝血剂可为选自以下的 至少一种阿地肝素钠、达肝素钠、达那肝素钠、依诺肝素钠、肝 素钩、肝素钠、千丙酮香豆素钠。至少一种血液衍生物可为选自以 下的至少一种白蛋白5%、白蛋白25%、抗血友病因子、抗抑制剂 促凝剂复合物、抗凝血酶III (人)、IX因子(人)、IX因子复合物、血 浆蛋白组分。至少一种溶血检药可为选自以下的至少一种阿替普 酶、阿尼链酶、瑞替普酶(重组)、链激酶、尿激酶。(参见例如A^ra/"g
i>wg//a"^ooA:中的834-66页)。
至少一种烷基化药物可为选自以下的至少一种白消安、卡铂、 卡氮芥、苯丁酸氮芥、顺氯氨铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、环己亚 硝脲、盐酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、盐酸苯丙氨酸氮芥、链脲霉素、 替莫唑胺、辟^替派。至少一种抗z氏谢物可为选自以下的至少一种 卡培他滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、 羟基脲、巯基噤呤、氨曱蝶呤、氨曱蝶呤钠、硫鸟。票呤。至少一种 抗生素抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种硫酸博莱霉素、放线 菌素D、柠稼酸柔红霉素脂质体、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、丝裂霉素、戊糖 苷、普卡霉素、戊柔比星。至少一种可改变激素平衡的抗胂瘤药物 可为选自以下的至少一种阿那曲唑、比卡鲁胺、雌二醇氮芥磷酸 钠、依西美坦、氟他胺、乙酸戈舍瑞林、来曲唑、乙酸亮脯利特、 醋酸曱地孕酮、尼鲁米特、柠檬酸三苯氧胺、睾内脂、枸橼酸托瑞
米芬。至少一种其它抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种天冬酰 胺酶、卡介苗(BCG)(活体膀胱内)、氮烯咪胺、多烯紫衫醇、鬼臼乙 叉苷、磷酸鬼臼乙叉苷、盐酸吉西他滨、盐酸伊立替康、邻氯苯对 氯苯二氯乙烷、盐酸米托蒽醌、紫衫醇、培加帕酶、卟吩姆钠、盐 酸曱基下肼、利妥昔单抗、替尼泊苷、盐酸拓朴替康、曲妥珠单抗、 全反维生素A酸、硫酸长春花碱、硫酸长春花新碱、酒石酸长春瑞 宾。(参见例如M/rw'"g Z)rwgZ/a"必ooA:中的867-963页)。
上述至少一种免疫抑制剂可为选自以下的至少一种硫唑嘌呤、 巴利昔单抗、环孢素、达克珠单抗、淋巴细胞免疫球蛋白、莫罗单 抗-CD3、霉酚酸吗琳乙酯、盐酸霉酚酸吗琳乙酯、西罗莫司、他克 莫司。上述至少一种疫苗或类毒素可为选自以下的至少一种BCG 疫苗、霍乱疫苗、白喉和破伤风类毒素(吸附型)、白喉和^^伤风类毒 素和非细胞百曰咳疫苗吸附型、白喉和破伤风类毒素和全细胞百曰 咳疫苗、b型嗜血杆菌结合疫苗、曱型肝炎疫苗(灭活)、乙型肝炎疫 苗(重组)、流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B (纯化的表面抗原)、 流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B (亚病毒体或纯化的亚病毒体)、 流感病毒疫苗1999_2000三联型A&B (全病毒体)、日本脑炎病毒疫 苗(灭活)、Lyme氏疏螺旋体病疫苗(重组OspA)、麻渗和腮腺炎和风 瘆病毒疫苗(活疫苗)、麻渗和腮腺炎和风渗病毒疫苗(减毒活疫苗)、 麻療病毒疫苗(减毒活疫苗)、脑膜炎双球菌多糖菌苗、腮腺炎病毒疫 苗(活疫苗)、鼠疫疫苗、肺炎球菌疫苗(多价疫苗)、脊髓灰质炎病毒 疫苗疫苗(灭活)、脊髓灰质炎病毒疫苗(口服三联活疫苗)、狂犬病疫 苗(吸附型)、狂犬病疫苗(人类二倍体细胞)、风渗和腮膝炎病毒疫苗(活疫苗)、风渗病毒疫苗(减毒活疫苗)、破伤风类毒素(吸附型)、破伤风 类毒素(液体)、伤寒疫苗(口服)、伤寒疫苗(肠胃外给予)、伤寒Vi多 糖疫苗、水痘病毒疫苗、黄热病疫苗。至少一种抗毒素或抗蛇毒素
可为选自以下的至少一种黑寡妇蜘蛛抗蛇毒素、响尾蛇科抗蛇毒 素(多价的)、白喉抗毒素(马)、金黄珊瑚蛇毒血清。至少一种免疫血 清可为选自以下的至少一种巨细胞病毒免疫球蛋白(静脉内)、乙型 肝炎免疫球蛋白(人)、免疫球蛋白肌内、免疫球蛋白静脉内、狂犬病 免疫球蛋白(人)、呼吸道合胞体病毒免疫球蛋白静脉内(人)、Rh"D) 免疫球蛋白(人)、Rho(D)免疫球蛋白静脉内(人)、破伤风免疫球蛋白 (人)、水痘-带状疱疹免疫球蛋白。至少一种生物反应调节物可为选 自以下的至少一种阿地流津、依泊艾汀a、非拉司汀、注射用乙酸 格拉替雷、复合干扰素-1、干扰素a-2a (重组)、干扰素a-2b (重组)、 干扰素P-la、干扰素(3-lb (重组)、干扰素y-lb、盐酸左旋四咪唑、重 组人白介素11、沙格司亭。(参见例如M/ra"g T/朋必ooA: 中的964-1040页)。
至少一种眼科抗感染药可选自以下的至少一种杆菌肽、氯霉 素、盐酸环丙沙星、红霉素、硫酸艮他霉素、吡啶羧酶0.3%、硫酸 多粘菌素B、磺胺醋酸钠10%、磺胺醋酸钠15%、磺胺醋酸钠30%、 托普霉素、阿糖腺苷。上述至少一种眼科抗炎症药可为选自以下的 至少一种地塞米松、地塞米松磷酸钠、二氯苯胺苯乙酸钠0.1%、 氯曱龙、氟比洛芬钠、酮咯酸氨丁三醇、醋酸强的松龙(悬液)、强的 松龙磷酸钠(溶液)。上述至少 一种缩瞳剂可为选自以下的至少 一种: 氯乙酰胆碱、氯甲酰胆碱(目艮内)、氨曱酰胆碱(局部)、依可琪酯、毛 果芸香碱、盐酸毛果芸香碱、硝酸毛果芸香碱。至少一种扩瞳剂可 为选自以下的至少一种硫酸阿托品、盐酸环戊通、盐酸肾上腺素、 硼酸肾上腺素、氢澳酸后马托品、盐酸苯肾上腺素、氢溴酸东茛菪 碱、托品酰胺。至少一种眼血管收缩剂可为选自以下的至少一种 盐酸萘唑啉、盐酸幾间唑啉、盐酸四氬萘唑啉。至少一种其它眼药可为选自以下的至少一种盐酸阿可乐定、盐酸倍他洛尔、酒石酸
溴莫尼定、盐酸山羊豆苷、盐酸地匹福林、盐酸杜塞酰胺、富马酸 依美斯汀、荧光素钠、延胡索酸甲哌噻庚酮、拉坦前列素、盐酸左 布诺洛尔、盐酸美替卜拉格、氯化钠(高渗)、马来酸p塞吗心安。至少
一种耳用药可为选自以下的至少一种硼酸、过氧化氬脲、氯霉素、
油酸三乙醇胺多肽-冷凝液。至少一种鼻用药可为选自以下的至少一
种二丙酸氯地米松、布地奈德、硫酸麻黄碱、盐酸肾上腺素、9-去
氟肤轻松、丙酸氟替卡松、盐酸萘唑啉、盐酸羟间唑啉、盐酸苯肾
上腺素、盐酸四氢萘唑啉、丙炎松、盐酸丁千唑啉。(参见例如M/raz'"g
20W Z)rag/Za"必ooA:中的1041-97页)。
至少一种局部抗感染药可为选自以下的至少一种无环鸟苷、
两性霉素B、壬二酸乳脂、杆菌肽、硝酸布康唑、磷酸氯林肯霉素、
克霉唑、硝酸益康唑、红霉素、硫酸艮他霉素、酮康唑、醋酸高磺
胺、曱硝基羟乙唑(局部)、硝酸霉抗唑、莫匹罗星、盐酸萘替芬、硫
酸新霉素、硝基糖腙、制霉菌素、磺胺嘧啶银、盐酸特比奈酚、特
康唑、盐酸四环素、瘗康唑、托萘酯。至少一种抗齊螨剂或抗虱剂
可为选自以下的至少一种克罗他米通、林丹、千氯菊脂、除虫菊
酯。至少一种局部皮质类固醇可为选自以下的至少一种双丙酸倍
他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯氟美松、丙缩轻强龙、去氧米松、
地塞米松、地塞米松磷酸钠、双醋二氟松、丙酮肤轻松、氟新诺龙
酯、氟氢缩松、丙酸氟替卡松、氯氟松、氢化可的松、醋酸氢化可
的松、丁酸氢化可的松、戊酸氬化可的松、糠酸莫美他松、丙炎松。
(参见例如iVwm'"g200/ Dn^/f朋必ooA:中的1098-1136页)。
上述至少一种维生素或矿物质可为选自以下的至少一种维生
素A、复合维生素B、氰钴胺素、叶酸、氰钴胺素、曱酰四氢叶酸4丐、 烟酸、烟酰胺、盐酸吡喷醇、核黄素、盐酸辟u胺素、维生素C、维生 素D、胆钙化醇、麦角钙化醇、维生素D类似物、度骨化醇、帕利 骨化醇、维生素E、维生素K类似物、维生素K1、氟化钠、氟化钠(局部)、痕量元素、铬、铜、碘、锰、硒、锌。至少一种热质可为选自
以下的至少一种氨基酸浸剂(晶状)、右旋糖中的氨基酸浸剂、含电 解质的氨基酸浸剂、右旋糖中含电解质的氨基酸浸剂、针对肝衰竭 的氨基酸浸剂、针对高代谢压力的氨基酸浸剂、针对肾衰竭的氨基 酸浸剂、右旋糖、脂肪乳浊液、中链脂肪酸甘油三酯。(参见例如7Vwra'"g 2007 Z)rwg/7a"必oc^中的1137-63页)。
本发明还提供至少一种任何合适的和/或有效量的组合物或药物 组合物，该组合物或药物组合物包含至少一种GLP-1激动剂或模拟 体或特定部分或变体，任选地还包含有效量的至少 一种其它化合物、 蛋白或组合物，所述其它化合物、蛋白或组合物选自以下的至少一 种TNF拮抗剂(例如但不限于TNF化学或蛋白质拮抗剂、TNF单 克隆或多克隆抗体或片段、可溶性TNF受体(例如p55、 p70或p85) 或片段、其融合多肽，或小分子TNF拮抗剂，例如TNF结合蛋白I 或II (TBP-I或TBP-II)、奈瑞莫单抗、英利昔单抗、依那西普、CDP-571、 CDP-870、阿非莫单抗、来那西普等)、抗风湿药(例如氨曱蝶呤、 醋硫葡金、金硫代葡萄糖、硝基咪唑硫嘌呤、依那西普、硫代苹果 酸金钠、硫酸羟基氯喹、来氟米特、柳氮磺胺吡啶)、肌肉松弛剂、 麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部 麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂(例如氨基糖苷类、抗真菌剂、抗 寄生虫药、抗病毒药物、氨基曱酰、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内 酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗菌剂)、抗银屑病药、皮质类固 醇、促蛋白合成类固醉、糖尿病相关药物、矿物质、营养物质、曱 状腺药物、维生素、钙相关激素、止泻药、镇咳药、止吐剂、抗溃 疡药、緩泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如epoetin a)、非拉司 汀(例如G陽CSF、 Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、 Leukine)、免疫、 免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环孢素、达克珠单抗)、 生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节物、扩瞳剂、睫状肌麻 痹药、烷基化药物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经 药、兴奋剂、多奈哌齐、塔克林、哮喘药、(3激动剂、吸入型类固醇、 白细胞三烯抑制剂、曱基黄。票呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、链
球菌DNA酶a (Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。所述细
胞因子的非限制性实例包括但不限于IL-1至IL-23中的任一种。合
适剂量是本领域熟知的。参见例如Wells等编辑，Pharmacotherapy
Handbook,第2版，Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR
Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000)，上述参考文献每个均通
过引用整体结合到本文中。
这种组合物还可包括与至少一种本发明抗体或多肽締合、结合、 共同配制或共同给予的毒素分子。该毒素任选地可起选择性杀死病 理细胞或组织的作用。该病理细胞可为癌细胞或其它细胞。这种毒 素可为但不仅限于纯化或重组毒素或含毒素的至少一个功能性细胞 毒素结构域的毒素片段，所述毒素例如选自以下的至少一种蓖麻 毒蛋白、白喉毒素、蛇毒毒素或细菌毒素。术语毒素还包括由任何 天然、突变或重组细菌或病毒所产生的内毒素和外毒素，所迷任何 天然、突变或重组细菌或病毒可在人类和其它哺乳动物中引起包括 中毒性休克在内的任何病理状况，并可导致死亡。这种毒素可包括 但不限于产肠毒素的大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、热稳定肠毒素 (ST)、志贺菌细胞毒素、气单胞菌肠毒素、中毒性休克综合征毒素-l (TSST-1)、葡萄球菌肠毒素A(SEA)、 B (SEB)或C (SEC)、链球菌肠 毒素等。这种细菌包括但不限于以下的菌抹产肠毒素大肠杆菌(ETEC) 种、肠出血大肠杆菌(例如血清型0157:H7菌抹)、葡萄球菌种(例如 金黄色葡萄球菌、酿脓葡萄球菌)、志贺菌种(例如志贺氏痢疾杆菌、 福氏志贺杆菌、波伊德氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏杆菌)、沙门氏菌 种(例如伤寒杆菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌)、梭状芽胞杆菌 种(例如产气荚膜梭状芽孢杆菌、艰难杆菌、肉毒杆菌)、弯曲杆菌种(例如空肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌)、螺杆菌种(例如幽门螺杆菌)、 气单胞菌种(例如温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌)、类 志贺邻单胞菌、小肠结肠炎椰尔森菌、弧菌种(例如霍乱弧菌、副溶
血性弧菌)、克雷白杆菌种、铜绿假单胞菌和链球菌。参见例如Stein 编辑，INTERNAL MEDICINE,笫3版，1-13页，Little, Brown and Co , Boston, (1990), Evans 等编辑，Bacterial Infections of Humans Epidemiology and Control,第2版，239-254页，Plenum Medical Book Co , New York (1991), Mandell等，Principles and Practice of Infectious Diseases,笫3版，Churchill Livingstone, New York (1990)， Berkow等 编辑，7T2e A/en:A: A^f肌"/,第16版，Merck and Co, Rahway, N J, 1992; Wood等，FEMS Microbiology Immunology, 76.121-134 (1991), Marrack 等，Science, 248 705^11 (l"0)，上述参考文献的内容通过引用整体 结合到本文中。
本发明的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物还可 含有至少一种任何的合适助剂，例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳 定剂、緩沖剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂等。优选药物可接受 助剂。这些无菌溶液的非限制性实例及制备方法均是本领域熟知的， 例^口^f旦不卩艮于Gennaro编4專,i em/wgtow k 尸/wrmacew"ca/ 5We"ces,笫 18版，Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990。如本领域熟知的或本 文所描述的，可以常规方法选择出与GLP-1激动剂或模拟体组合物 的给予方式、溶解度和/或稳定性相容的药物可接受载体。
用于本发明组合物的药物赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白 质、肽、氨基酸、脂质和糖类(例如糖、包括单糖、二糖、三糖、四 糖和寡糖；衍生糖，例如醛醇、糖醛酸、酯化糖等；以及多糖或糖 聚合物)，它们可单独或组合存在，单独或组合地占1-99.99%的重量 或体积。代表性的蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，例如人血清白蛋 白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可发挥緩冲作 用的代表性氨基酸/GLP-l激动剂或模拟体或特定部分或变体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、 半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨 酸、天冬酰苯丙氨酸曱酯等。 一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于本发明的糖类赋形剂包括例如单糖，例如果糖、麦芽糖、
半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、 海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、 葡聚糖、淀粉等；和糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳 糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、肌醇等。适用于本发明的优选糖 类赋形剂为甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
GLP-1激动剂或模拟体组合物也可包括緩冲剂或pH调节剂，典 型的緩冲剂是从有机酸或碱制得的盐。代表性緩冲剂包括有机酸盐， 例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或 苯二曱酸的盐；Tris、盐酸三羟曱基曱烷或磷酸盐緩冲剂。适用于本 发明组合物的优选緩冲剂为有机酸盐，例如柠檬酸盐。
另外，本发明的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体組合 物可包括聚合的赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、ficolls (—种 聚糖)、葡萄糖结合剂(例如环糊精，例如2-羟丙基-p-环糊精)、聚乙 二醇、调味剂、抗菌剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性 剂(例如聚山梨醇酯，例如"TWEEN20"和"TWEEN80")、脂质(例 如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
适用于本发明GLP-1激动剂或模拟体组合物的这些及其它已知 药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如在"Remington The Science & Practice of Pharmacy"第 19版,Williams & Williams, (1995),和在"Physician's Desk Reference"笫52版,Medical Economics, Montvale， NJ (1"8)中所列出的药物赋形剂和/或添加剂，上述参考文 献的公开内容通过引用整体结合到本文中。优选的载体或赋形剂材 料为糖类(例如糖和糖醇)和緩冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合剂。
制剂。如上所述，本发明提供了稳定制剂，该制剂优选可包含含盐水或选定盐的合适緩冲剂，以及任选的含有防腐剂的防腐溶液 和制剂和适合药用或兽用的多用途防腐制剂，并包含在药物可接受
制剂中的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。防腐 制剂含有至少一种已知的防腐剂或任选地选自以下的至少一种苯 酚、间-曱酚、对-曱酚、邻-曱酚、氯甲酚、苯曱醇、亚硝酸苯汞、 苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如六水合物)、对羟基苯曱酸烷 基酯(曱酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、氯化千乙氧铵、脱氢 乙酸钠和硫柳汞，或它们在水性稀释剂中的混合物。可据本领域所 知使用任何合适的浓度或混合物，例如0.001-5%,或其中的任何范 围或数值，例如但不限于0.001、 0.003、 0.005、 0.009、 0.01、 0.02、 0.03、 0.05、 0.09、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0、 1.1、 1.2、 1.3、 1.4、 1.5、 1.6、 1.7、 1.8、 1.9、 2.0、 2.1、 2.2、 2.3、 2.4、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3.0、 3.1、 3.2、 3.3、 3.4、 3.5、 3.6、 3.7、 3.8、 3.9、 4.0、 4.3、 4.5、 4.6、 4.7、 4.8、 4.9、 5.0或其中的任何范围或数 值。非限制性实例包括无防腐剂、0.1-2%间曱酚(例如0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.9、 1.0%)、 0.1-3%苯曱醇(例如0.5、 0.9、 1.1、 1.5、 1.9、 2.0、 2.5%)、 0.001-0.5%硫柳汞(例如0.005、 0.01%)、 0.001-2.0%苯酚(例如 0.05、 0.25、 0.28、 0.5、 0.9、 1.0%)、 0.0005-1.0%对羟基苯甲酸烷基 酯(例如0.00075、 0.0009、 0.001、 0.002、 0.005、 0.0075、 0.009、 0.01、 0.02、 0.05、 0.075、 0.09、 0.1、 0.2、 0.3、 0.5、 0.75、 0.9、 1.0%)等。
如上所述，本发明提供一种制品，该制品包括包装材料和至少 一个西林瓶，所述西林瓶含有至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特 定部分或变体和指定緩冲剂和/或防腐剂的溶液，任选地在水性稀释 液中，其中所述包装材料包括标示了上述溶液可在1、 2、 3、 4、 5、 6、 9、 12、 18、 20、 24、 30、 36、 40、 48、 54、 60、 66、 72小时或 更长时间段内保存的标签。本发明还包括一种制品，该制品包括包 装材料、含至少一种冻干的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变 体的笫 一个西林瓶以及含指定緩冲剂或防腐剂的水性稀释液的笫二个西林瓶，其中所述包装材料包括一个标签，指示患者如何将至少 一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体在水性稀释液中重构
以形成可在24小时或更长时间段内保存的溶液。
根据本发明应用的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分 或变体可通过重组方法生产，包括由哺乳动物细胞或转基因制品生 产，或者可由如本文所述或本领域所知的其它生物来源纯化。
本发明产品中至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变 体量的范围包括重构后(如果是湿/干体系的话)产生约10 pg/ml至约 1000 mg/ml浓度的量，但更低和更高浓度也是可行的，取决于拟定 送递载体，例如溶液制剂不同于透皮药贴、肺、经粘膜或渗透或賴: 量泵法。
优选地，上述水性稀释液任选地还包含药物可接受防腐剂。优 选防腐剂包括选自下列的防腐剂苯酚、间-曱酚、对-曱酚、邻-曱 酚、氯曱酚、苯曱醇、对羟基苯曱酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁 酯等)、苯扎氯铵、氯化千乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或它们的 混合物。用于制剂中的防腐剂浓度是足以产生抗微生物作用的浓度。 该浓度取决于所选防腐剂，且可由技术人员容易地测定。
其它赋形剂，例如等渗剂、緩沖剂、抗氧化剂、防腐增强剂， 可任选和优选地加入稀释剂中。等渗剂，如甘油，通常以已知浓度 使用。优选加入生理可耐受緩冲剂，以改善pH控制。所述制剂可覆 盖大范围的pH,如由约pH4至约pH 10，优选范围是约pH5至约pH 9,最优选范围为约pH 6.0至约pH 8.0。优选地，本发明制剂具有约 6.8至约7.8之间的pH值。优选的緩冲剂包括磷酸盐緩冲剂，最优 选磷酸钠，尤其是磷酸緩冲盐溶液(PBS)。
其它添加剂，如药物可接受增溶剂，如Tween20 (聚氧乙烯(20) 山梨糖醇酐单月桂酸酯)、Tween 40 (聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈 酸酯)、Tween 80 (聚氧乙烯pO)山梨糖醇酐单油酸酯)、Pluronic FM (聚 氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG (聚乙二醇)或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188， Pluronic polyl、其 它嵌段共聚物和螯合剂如EDTA和EGTA,任选地可加入所述制剂 或組合物中，以减少聚集。如果使用泵或塑料容器给予所迷制剂， 那么这些添加剂尤其有用。药物可接受的表面活性剂的存在减轻了 蛋白质聚集的倾向。
本发明制剂可通过一种方法制备，该方法包括将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体与选自以下的防腐剂在水性稀释 剂中混合苯酚、间-曱酚、对-曱酚、邻-曱酚、氯曱酚、苯曱醇、 对羟基苯曱酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、氯化 千乙氧铵、脱氬乙酸钠和硫柳汞或它们的混合物。使用常规溶解和 混合方法将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体与防 腐剂在水性稀释剂中混合。为制备合适制剂，例如，将测定量的至 少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的緩沖溶液与所需 防腐剂的緩冲溶液以 一定量组合，该量足以提供所需浓度的蛋白质 和防腐剂。本领域一顧:技术人员应知晓该方法的变化。例如，力口入 组分的顺序、是否采用其它添加剂、制备该制剂的温度和pH都是针 对所用浓度和给予途径可优化的因素。
要求保护的制剂可作为澄清溶液或双西林瓶提供给患者，双西 ^^f瓦含有一瓶冻干的至少一种GLP-1激动剂或^^莫拟体或特定部分或 变体，其用含有水、防腐剂和/或赋形剂(优选在水性稀释液中的磷酸 盐緩沖剂和/或盐水和选定盐)的笫二个西林瓶重构。单溶液瓶或需重 构的双瓶均可重复使用多次，并可满足患者治疗的一个或多个周期， 因而可提供比现时可用治疗方案更为便利的治疗方案。
本发明要求保护的制品适用于在立即到24小时或以上的时间段 内给予。因此，本发明要求保护的制品为患者提供了显著益处。本 发明制剂任选地可在约2至4(TC的温度下安全保存并长时间保持蛋 白质的生物活性，因而允许包装标签标示该溶液可在6、 12、 18、 24、 36、 48、 72或96小时或以上的时间段内保存和/或使用。如采用防腐稀释剂，则该标签可包括使用达1-12个月、半年、 一年半和/或两 年中的至少一种。
可通过一种方法制备本发明的至少一种GLP-1激动剂或^^莫拟体 或特定部分或变体的溶液，所述方法包括将至少一种GLP-1激动剂 或模拟体或特定部分或变体混合在水性稀释液中。混合使用常规溶 解和混合方法进行。为制备合适的稀释液，例如，以足以提供所需 浓度的蛋白质和任选的防腐剂或緩沖液的量，将测定量的至少一种 GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的水溶液或緩冲液配伍。 本领域一般技术人员应知晓该方法的变化。例如，加入组分的顺序、 是否采用其它添加剂、制备该制剂的温度和pH都是针对所用浓度和 给予途径可优化的因素。
要求保护的产品可以澄清溶液或双西#木瓶提供给患者，双西林 瓶含有一瓶冻干的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变 体，其用含有水性稀释剂的第二个西林瓶重构。单溶液瓶或需重构 的双瓶均可重复使用多次，并可满足患者治疗的一个或多个周期， 因而可提供比现时可用治疗方案更为便利的治疗方案。
可通过提供给药房、诊所或其它这种机构和i殳施澄清溶液或双 西林瓶，将要求保护的产品间接提供给患者，所述双西林瓶含有一 瓶冻干的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，其可 用含水性稀释液的第二个西林瓶重构。该情况下澄清溶液的大小可 达一升乃至更大，提供了一种大储液器，可一次或多次从该储液器 取回更小部分的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体 溶液，转移到更小的西林瓶中，由药房或诊所提供给它们的顾客和/ 或患者。
含这些单瓶体系的公知装置包括用于送递溶液的笔式注射器装 置，例如Humaject⑧、NovaPen 、 B-D Pen、 AutoPen⑧和OptiPen 。 含双瓶体系的公知装置包括可用于将冻干药物在药筒中重构并送递 该重构溶液的笔式注射器系统，例如HumatroPen 。本发明要求保护的产品包括包装材料。除管理机构所要求的信 息外，该包装材料还提供应用该产品的条件。本发明的包装材料向 患者提供说明书，指示将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部
分或变体在水性稀释液剂中重构，以形成溶液和在2-24小时或更长 的时间段内使用该双瓶、湿/干产品的溶液。对单瓶溶液产品而言， 标签标示了该溶液可在2-96小时或更长的时间段使用。本发明要求 保护的产品可用于人类药品用途。
可通过一种方法制备本发明制剂，所述方法包括将至少 一种 GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体与选定緩沖剂混合，所述 緩冲剂优选为含盐水或选定盐的磷酸緩冲剂。在水性稀释液中混合 至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体和緩沖剂使用常 规溶解和混合方法进行。为制备合适的制剂，例如，将测定量的至 少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的水溶液或緩冲液 与所需緩冲剂的水溶液以一定量配伍，该量足以提供所需浓度的蛋 白质和緩沖剂。本领域一般技术人员应知晓该方法的变化。例如， 加入组分的顺序、是否采用其它添加剂、制备该制剂的温度和pH都 是针对所用浓度和给予途径可优化的因素。
要求保护的稳定或防腐制剂可作为澄清溶液或双西林瓶提供给 患者，双西林瓶含有一瓶冻干的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或 特定部分或变体，其用含有防腐剂或緩冲剂或赋形剂的水性稀释液 的第二个西林瓶重构。单溶液瓶或需重构的双瓶均可重复使用多次， 并可满足患者治疗的一个或多个周期，因而提供比现时可用治疗方 案更为便利的治疗方案。
本文描述的稳定或防腐制剂或溶液中的至少一种GLP-1激动剂 或模拟体或特定部分或变体可根据本发明通过多种送递方法给予患
者，包括皮下(SC)或肌内(IM)注射；透皮、肺、经粘膜、植入、渗透 泵、药筒、微量泵或技术人员了解、本领域周知的其它途径。
治疗应用。本发明提供一种增加胰腺功能的方法，所述方法包括将有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体组合物给予需要其的 细胞、组织、器官或个体。GLP-1激动剂或模拟体可促进胰岛分化、
增加P-细胞量和/或增加胰岛素分泌。GLP-1激动剂或模拟体可在试
管内、体外或体内给予。
例如，GLP-1激动剂或模拟体治疗可用于胰腺或胰岛移植患者 或包含产胰岛素细胞的其它细胞治疗。在有或没有设计用于增强细 胞存活或防止免疫排斥的装置支持的情况下，可将细胞治疗静脉内、 皮下、肌内或腹膜内传送给患者。其还可用于手术去除部分胰腺后 的患者。GLP-1激动剂或模拟体可在所述方法前或后给予活体胰腺 或胰岛供体，以增加(3-细胞量和胰腺功能。其还可用于在移植前在体 外刺激P-细胞增殖，由此增加P-细胞量和防止移植后的胰岛凋亡。其 还可用于培养产胰岛素细胞的干细胞、祖细胞或前体细胞，以刺激 分化和增殖以及防止凋亡。
本发明提供一种在变成糖尿病的高风险个体中延迟糖尿病发作 或防止糖尿病的方法，所述方法包括对需要其的个体给予有效量的 至少一种GLP-1激动剂或模拟体组合物。
本发明提供一种调节或治疗至少 一种胰腺功能失调引起的疾病 或障碍的方法，所述方法包括对需要其的个体给予有效量的至少一 种GLP-1激动剂或模拟体组合物。适合用本发明方法治疗的病症和 疾病包括但不限于糖尿病，例如l型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期 糖尿病或青少年发病的成年型糖尿病(MODY),包括相关征兆和症 状，例如但不限于胰岛素抗性、高血糖、低血糖、Cushing综合症、 黑色棘皮症、脂肪萎缩型糖尿病、视网膜病、肾病、多神经病、单 神经病、自主神经病变、溃疡、脚溃疡、关节问题、感染(例如真菌 或细菌)等。参见例如the Merck Manual,第12-17版，Merck & Company:
Rahway， NJ (1972, 1977， 1982， 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells等编辑,笫2版,Appleton and Lange, Stamford, Conn.
(1998,2001),每个文献均通过引用整体结合到本文中。其它非限制性胰腺病症包括胰腺炎、胰腺肿瘤或胰腺癌。
本发明提供一种用于调节或治疗导致高血糖的至少 一种代谢障 碍的方法。这种障碍的非限制性实例包括与高血压相关的硬化和葡 萄糖耐受受损。GLP-1激动剂或模拟体治疗还可与已知诱发高血糖 和/或糖尿病的其它药物联用。这种药物的非限制性实例包括免疫抑
制药物，例如在器官移植中给予的环孢素或FK-506,指定用于AIDS 患者的蛋白酶抑制剂和用于治疗精神分裂症的非典型抗精神病药。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的 至少 一种心血管病的方法，该心血管病包括但不限于以下的至少一 种心脏晕厥综合征、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、缺血性 中风、出血、动脉硬化、动脉粥样石更化、糖尿病性动脉石更化病、高 血压、动脉高压、肾血管性高血压、晕厥、休克、心血管系统梅毒、 心力衰竭、肺源性心脏病、原发性肺动脉高压、心律失常、心房异 位搏动、心房朴动、心房颤动(持续或阵发的)、紊乱性或多源性房性 心动过速、规律性狹窄QRS心动过速、特殊心律失常、心室纤颤、 His束心律失常、房室传导阻滞、束支传导阻滞、心肌局部缺血失调、 冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张充血性心肌病、限制性 心肌病、辫膜心脏病、心内膜炎、心包病、心脏肿瘤、主动脉和周 围动脉瘤、主动脉夹层、主动脉炎症、腹主动脉及其分支阻塞、外 周血管失调、闭塞性动脉失调、外周动脉粥样硬化病、血栓闭塞性 脉管炎、功能性外周动脉失调、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红 斑性肢痛症、静脉病、血栓静脉炎、曲张静脉、动静乐;K瘘、、淋巴水 肺、脂肪水肿、不稳定心绞痛、再灌注损伤、体外冠状动脉搭桥术 后综合征、局部缺血-再灌注损伤等。这种方法任选地可包括对需要 这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者给予有效 量的含至少一种GLP-激动剂或模拟体或特定部分或变体的组合物或 药物组合物。
本发明的任何方法都可包括对需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者给予有效量的含至少一种GLP-激动剂
或模拟体或特定部分或变体的组合物或药物组合物。这种方法任选
地还可包括共同给予或联合疗法，其中所述至少一种GLP-激动剂或 模拟体、其特定部分或变体的给予还包括在其之前、同时和/或之后 给予选自以下的至少一种糖尿病或胰岛素代谢相关药物、TNF拮 抗剂(例如但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、其 融合蛋白，或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药、肌肉松弛剂、麻醉药、 非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、 神经肌肉阻断剂、抗菌剂(例如氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生虫药、 抗病毒药物、氨基曱酰、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、 磺胺、四环素、其它抗菌剂)、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合 成类固醇、糖尿病相关药物、矿物质、营养物质、曱状腺药物、维 生素、钙相关激素、止泻药、镇咳药、止吐剂、抗溃疡药、緩泻剂、 抗凝血剂、促红细胞生成素(例如GLP-letin a)、非拉司汀(例如G-CSF、 Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、 Leukine)、免疫、免疫球蛋白、 免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环孢素、达克珠单抗)、生长激素、激 素替代药物、雌激素受体调节物、扩瞳剂、睫状肌麻痹药、烷基化 药物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁 狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、 多奈哌齐、塔克林、哮喘药、(3激动剂、吸入型类固醇、白细胞三烯 抑制剂、曱基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、链球菌DNA酶 a (Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。合适剂量是本领域熟 夕、口的。参见侈寸^口 Wells等编4專，Pharmacotherapy Handbook,笫2版， Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tamscon Publishing, Loma Linda, CA (2000),上述参考文献每个均通过引用
整体结合到本文中。
适用于本发明组合物、联合治疗、共同给予、装置和/或方法的TNF拮抗剂(还包括本发明的至少一种抗体、其特定部分和变体)包括 但不限于抗TNF抗体、其配体结合片段和特异性结合TNF的受体 分子；阻止和/或抑制TNF合成、TNF释放或其对把细胞的作用的化 合物，例如沙利度胺、替尼达普、磷酸二酯酶抑制剂(例如己酮可可 碱和咯利普兰)、A2b腺苷受体激动剂和A2b腺苷受体增强剂；阻止 和/或抑制TNF受体信号传导的化合物，例如促分裂原活化蛋白(MAP) 激酶抑制剂；阻断和/或抑制膜TNF裂解的化合物，例如金属蛋白酶 抑制剂；阻断和/或抑制TNF活性的化合物，例如血管紧张肽转化酶 (ACE)抑制剂(例如卡托普利)；和阻断和/或抑制TNF生成和/或合成 的化合物，例如MAP激酶抑制剂。
本文所用的"肿瘤坏死因子抗体"、"TNF抗体"、"TNFa抗 体"或片段等降低、阻断、抑制、消除或干扰体外、原位和/或优选 体内的TNFa活性。例如，合适的本发明TNF人抗体可结合TNFa， 并包括抗TNF抗体、其抗原结合片段和特异性结合TNFa的特定突 变体或其结构域。合适的TNF抗体或片段也可降低、阻断、消除、 干扰、阻止和/或抑制TNF RNA、 DNA或蛋白质合成、TNF释放、TNF 受体信号传导、膜TNF裂解、TNF活性、TNF生产和/或合成。
嵌合抗体cA2由高亲和性中和性小鼠抗人TNFa IgGl抗体(称A2) 的抗原结合可变区和人IgGl恒定区(K免疫球蛋白)组成。人IgGl Fc 区改善同种异型抗体效应子功能，增加抗体的循环血清半衰期，并 降低抗体的免疫原性。嵌合抗体cA2的亲和力和表位特异性来源于 鼠抗体A2的可变区。在一个具体实施方案中，编码鼠抗体A2可变 区的核酸的优选来源是A2杂交瘤细胞系。
嵌合A2 (cA2)以剂量依赖方式中和天然和重组人TNFa这二者 的细胞毒效应。由嵌合抗体cA2与重组人TNFa的结合测定计算出嵌 合抗体cA2的亲和常数为1.04xl01Q M-、通过竟争抑制测定单克隆 抗体特异性和亲和力的优选方法可见于Harlow等，^""6o^es爿 丄aZ)orato j Mawwa/, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York, 1988; Colligan等编辑，C鮮eW尸ratoco/s & /m膽wo/ogy, Greene Publishing Assoc and Wiley Interscience, New York, (1992-2005), Kozbor等，/mm朋o/ To^y, 4 72-79 (1983), Ausubel等编 辑，Cw/re/^尸ratocoAs z力Mo/ecw/ar Wiley Interscience, New
York (1987-2005);和Muller, MeA.五wz少mo/., 92.589-601 (1983),这 些参考文献通过引用整体结合到本文中。
在一个具体实施方案中，鼠单克隆抗体A2由称为cl34A的细 胞系生产。嵌合抗体cA2由称为cl68A的细胞系生产。本领域已描 述了可用于本发明的其它单克隆抗TNF抗体的实例(参见例如美国专 利笫5，231,024号，Moller, A等，qytoh'"e 2(3) 162-169 (1990),美国申 请笫07/943,852号(1992年9月11日提交)，Rathjen等，国际
发明者G·徐, J·奥奈尔, K·T·奥奈尔, K·皮查, M·拉克 申请人:森托科尔公司