改变了淀粉分支酶活性的大麦及增加了直链淀粉含量的淀粉和含淀粉产品的制作方法

专利名称：改变了淀粉分支酶活性的大麦及增加了直链淀粉含量的淀粉和含淀粉产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及胚乳中淀粉分支酶IIa(SBEIIa)活性减少的大麦植物，它将导致麦粒淀粉中相应的直链淀粉含量的增加。同时，本发明还涉及谷类、淀粉、食物以及由它们制成的非食物类产品。
背景技术：
淀粉约占谷类成熟颗粒重量的45-65％，其由直链淀粉和支链淀粉两类分子组成。直链淀粉从本质上而言是线形分子，由α-1，4链接的葡萄糖苷鍵组成，而支链淀粉是高度分支的键合线性链，由α-1，6链接的葡萄糖苷鍵组成。
高等植物胚乳中淀粉的合成是在一系列酶的作用下分四个关键步骤进行的。首先，通过利用G-1-P和ATP合成ADP-葡萄糖，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶激活淀粉的单体前体。其次，淀粉合成酶将激活的葡糖基供体ADP-葡萄糖转移到已存在的α-1，4键的未还原端。再次，淀粉分支酶通过分裂葡聚糖的α-1，4键区域引入分支点，然后将该断裂链转移到受体链，形成新的α-1，6键。淀粉分支酶是唯一能给α-多葡聚糖引入α-1，6键的酶，因而在支链淀粉的生成过程中，它起到了关键性作用。最后，淀粉去分支酶消除部分分支键，该作用机制目前仍不明了(Myers等人著，2000)。
人们已经明了高等植物中一般淀粉颗粒的合成至少需要以上四种酶的作用，在高等植物的胚乳中发现了每种酶的多种异构形式，人们基于突变分析(Wang等人著，1998，Buleon等人著，1998)或通过使用基因转移方法(Abel等人著，1996，Jobling等人著，1999，Scwall等人著，2000)修正基因表现水平提出了单个异构的特殊作用。然而，每种酶的各异构形式对于淀粉生物合成的准确贡献目前仍不清楚，而且这些贡献对不同物种是否有明显不同也不清楚。在谷类胚乳中，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶有两种异构形式，一种在淀粉质体中，另一种在细胞质中(Denyer等人著，1996，Thorbjornsen等人著，1996)。每种异构形式由两类子组(subunit)组成。玉米的收缩(sh2)和脆性(bt2)突变体分别代表大小两个子组的损害(Girouz和Hannah合著，1994)。在谷类胚乳中，发现了四种类型的淀粉合成酶。其中一种异构形式完全存在于淀粉颗粒和颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)，另两种异构形式分散在颗粒部分和可溶解部分之间(SSI，Li等人著，1999a，SSII，Li等人著，1999b)，第四种异构形式完全存在于可溶解部分，SSIII(Cao等人著，2000，Li等人著，1999b，Li等人著，2000)。GBSS对于直链淀粉合成是必要的(详见Shure等人著，1983)，SSII和SSIII的突变可改变支链淀粉的结构(详见Gao等人著，1998，Craig等人著，1998)。没有关于SSI突变作用的描述。
在谷类胚乳中，发现了三种形式的淀粉分支酶，淀粉分支酶I(SBEI)，淀粉分支酶IIa(SBEIIa)和淀粉分支酶IIb(SBEIIb)(Hedman和Boyer合著，1982，Boyer和Preiss合著，1978，Mizuno等人著，1992，Sun等人著，1997)。在玉米和稻谷中，高直链淀粉表型源于SBEIIb基因的损害，也被称为直链淀粉增量(ae)基因(Boyer和Preiss合著，1981，Mizuno等人著，1993；Nishi等人著，2001)。在SBEIIb突变型中，胚乳淀粉颗粒呈现不正常形态，直链淀粉含量显著提高，残留的支链淀粉分支频率减少，短链(＜DP17，特别是DP8-12)比例降低。而且淀粉的胶凝温度升高。另外，还有一种介于直链淀粉和支链淀粉的重要聚合物，一般称之为“中间体”(Boyer等人著，1980，Takeda等人著，1993b)。与此相反，SBEIIa基因中玉米植物突变型由于增变基因(Mu)插入体引起的SBEIIa不足，尽管叶淀粉的蛋白质表达式改变了，胚乳淀粉分支的蛋白质表达式与野生型植物仍没有区别(Blauth等人著，2001)。同样地，缺乏SBEIIa活性的稻谷植物胚乳中的支链淀粉链接轮廓也没有显著的改变(Nakamura著，2002)。
钝1(dull1)突变引起玉米胚乳中淀粉含量的减少和直链淀粉水平的增加，变化的幅度取决于基因背景和剩余的支链淀粉分支的增加程度(Shannon和Garwood合著，1984)。对应于该突变的基因已通过使用转位子增变基因进行转位子标记得以识别与隔离，并将这种酶编码为淀粉合成酶II(SSII)(Gao等人著，1998)。现在人们认识到这种酶在谷类中应属于SSIII家族的一员。突变型胚乳中与钝1突变有关的SBEIIa活性水平降低了。在其它谷类中未见有相应突变的报导。这些发现是否与其它谷类如大麦有关目前尚不明了。
WO94/09144专利建议使用致敏和抗致敏基因改变玉米中淀粉合成酶(SS)和淀粉分支酶的天然比例。但是，没有现存资料能够证实该建议的分子策略的有效性，也没有特别降低SBEIIa活性的建议。
单独调低土豆中SBEI数量对于淀粉结构仅会产生极小的影响(Filpse等人著，1996)，进一步的研究确认了一些定性变化(Safford等人著，1998)。然而，同时调低土豆中SBEII和SBEI而增加的相应直链淀粉含量将大大高于仅单独调低土豆中SBEII的结果(Schwall等人著，2000)。
高等植物中有两类去分支酶，根据基质特征的不同，它们被分别命名为异淀粉酶型去分支酶和支链淀粉酶(pullulanase)型去分支酶(Myers等人著，2000)。虽然各同一位置突变原因图与异淀粉酶型去分支酶基因相同，玉米和稻谷的糖-1突变与这两类去分支酶缺乏均有关联(James等人著，1995，Kubo等人著，1999)。在衣藻(Chlamydomonas)第七阶段突变中(Mouille等人著，1996)，模拟了玉米糖-1突变，单独调低了异淀粉酶活性。表1列出了从谷类克隆的淀粉生物合成基因。
淀粉广泛应用于食品、造纸和化学工业。对于食品或非食品或工业产品，淀粉的物理结构对淀粉的营养和处理性质有着重要的影响。淀粉在某方面的特性可作为其结构的指示物，包括支链淀粉链长度分布，结晶度和结晶的表现形式如淀粉结晶的V-复合体形态。支链淀粉链长度可作为结晶性和胶凝性改变的指示物，同时，人们还认为它与支链淀粉降解性降低有关联。另外，对于含有大量淀粉的食品，支链淀粉链长度的变化会反映食品的味觉属性。淀粉的结晶性降低可能代表淀粉胶凝温度降低，人们认为它与味觉属性加强有关。
大多数直链淀粉含量高的淀粉有相对较高的胶凝温度，这对一些食品应用而言是不利的。胶凝温度反映了加工这些食品需要的粉碎能量。用这些麦粒或淀粉加工的颗粒或面粉制作食品一般需要较高的温度。因此，含直链淀粉的产品一般较贵。另外，消费者烹饪直链淀粉含量高的面粉制成品或制作食品时，需要更长的时间和更高的温度。在许多食品应用方面，降低或正常化直链淀粉含量高的淀粉胶凝温度是很有利的。
淀粉成分，特别是抗性淀粉(resistant starch)，对肠特别是大肠的健康有重要的影响。因此，在诸如玉米的一些谷物中，开发了直链淀粉含量高的淀粉，用在食物中促进肠的健康。抗性淀粉的有益影响来自于为大肠提供营养物，使其中的肠内微生物群落获得发酵生成特殊短链脂肪酸的能量来源。而这些短链脂肪酸为肠道粘膜提供营养物，增强对经过大肠的特定营养物的吸收，促进结肠的生理性蠕动。一般而言，如果抗性淀粉或其它食物纤维得不到供给，结肠新陈代谢会相对不活跃。
在谷物特别是大麦中的另一营养成分是β-葡萄糖。β-葡萄糖由葡萄糖单元通过β-(1-4)和/或β-(1-3)糖苷键链接而成，人体消化酶不能将它分解，可作为食物纤维的合适来源。β-葡萄糖可被结肠内的细菌部分消化，消化过程产生的短链脂肪酸(主要是醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐)有利于肠和结肠内的粘膜细胞(Sakata和Engelhard合著，1983)。β-葡萄糖的摄取还可促进胆汁酸分泌，减少总血清胆固醇和低密度脂肪蛋白(LDL)，降低患冠状动脉硬化性心脏病的风险。同样地，β-葡萄糖还可减少餐后血液中葡萄糖浓度的变化。人们认为这些作用是基于胃和肠内物质粘度的增加。
虽然改良淀粉或葡萄糖能用于食物提供未改良原料不能提供的功能，但由于改良程序的影响，加工过程会或者改变其它有价值组分，或者产生不想要的东西。因此，提供不需改良即可直接用于食物的原料成分更可取。
大麦是世界第四大粮食作物，在制作酒精饮料用于人类消费方面相对利用不足。平均而言，大麦颗粒含有约64％淀粉，11％蛋白质和5％β-葡萄糖(一般3-6％)。其余20％是水分，纤维和其它微量组分。
相对于玉米淀粉结构变化而言，已知的大麦淀粉结构变化是非常有限的。对应于玉米或稻谷中直链淀粉增量剂表型，大麦的SBEIIb突变型仍未特征化。与大麦SBEIIa和SBEIIb突变对应的表型目前仍不清楚。特征化程度最高的突变是定义为AC38的光滑和高直链淀粉含量突变。高直链淀粉Glacier品种(AC38)可将直链淀粉含量相对适度地最大增加到总淀粉的45％。用光滑表型再次突变也已构建好并进行了分析(Schondelmaier等人著，1992；Fujita等人著，1999)。
高直链淀粉含量大麦的其它突变已经识别。对SSIIa基因进行化学诱导突变会使麦粒淀粉中高水平的直链淀粉含量达到约65-70％(WO 02/37955 A1)。M292和M342突变也充分展示了淀粉合成量减少引起的平均颗粒重量的减少，从喜马拉雅(Himalaya)系的约51毫克的平均重量分别减少到M292和M342的32和35毫克。尽管该突变型保持了野生型谷类的长度和宽度，其厚度从Himalaya的2.8毫米平均厚度降低到1.6-1.8毫米厚度，并且其中部区域基本上没有填充，这导致了较差的研磨性。人们发现谷类长度(L)对厚度(T)的比例是突变型等位基因的有用诊断参数，突变型和野生型种子的L∶T比例分别是大于3.5和小于3.5。突变系的淀粉含量从Himalaya的49.0％分别减少到M292和M342的17.7和21.9％。当M292和M342麦粒中直链淀粉含量从6.2毫克每个颖果分别降低到4.0和4.8毫克，支链淀粉的含量从Himalaya的18.7毫克戏剧性的降低到突变型的1.6和2.9毫克。这表明相对高的直链淀粉水平是由于支链淀粉产量的降低。突变型中谷物β-葡萄糖水平增加到了10％以上。淀粉的胶凝温度降低。SSIIa突变型改变了胚乳中淀粉颗粒和可溶解部分的SBEIIa和SBEIIb活性的分布，但它们在胚乳中作为一个整体没有变化(WO 02/37955；Morell等人著，2003)。
虽然这些类型提高直链淀粉含量有效，但具有更高的直链淀粉含量的大麦淀粉更为可取，特别是当它们可同时改进淀粉的合成和其它特性时，例如，减少收获后的改良需求。那些淀粉产品相对不易消化，更利于健康。
一般事项本技术领域人员可以明白的是，此处描述的发明除了那些特别提到的以外，还会有变化和修改。需要理解的是此处描述的发明已包括了所有变化与修改。本发明也包括了所有步骤，特征，本说明参考或标明的组分和化合物，单个地或共同地，任意两个或更多的上述步骤或特征的任意和所有组合。
本说明中，除非上下文要求，否则“包括”一词及其变形应理解为包括声明的整体或步骤、或者整体或步骤的组合，但不得排除其它任何整体或步骤、或者整体或步骤的组合。此处描述的具体范围仅用于例证目的，本发明并不局限于此。如同此处描述的一样，功能等效产品、组分和方法清楚的列在本发明的范围内。
本说明书作者引用的详细文献目录见本说明书的最后部分。此处提及的参考文献此后作为整体引用。此处引用的现有技术，包括任一份或更多的现有技术文档，如果提及的现有技术在澳大利亚已成为一般通用知识或成为一般通用知识的一部分，将不再采取承认或建议。
此处的术语“来源于”用于指代起源于列举物种的特殊整体或整体组，它们不需要直接来源于该列举源。
此处核苷酸残余物的命名参照国际理论和应用化学联合会-国际生物化学联合会(IUPAC-IUB)生物化学命名委员会的推荐做法，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，T代表胸腺嘧啶。

发明内容
本发明的第一方面可说是专注于大麦作物的麦粒，所述大麦作物胚乳中SBEIIa酶活性水平已降低，上述麦粒淀粉中相应的直链淀粉含量不少于40％(w/w)。相应的直链淀粉含量高于50％或75％的更合适，麦粒不收缩的更合适。
本发明的第二方面可说是专注于直链淀粉含量不低于75％(w/w)的大麦麦粒。
本发明的第三方面可说是专注于本发明前两方面麦粒制作的面粉或粗面粉，或这些面粉制作的食品。
本发明的第四方面可说是专注于大麦作物麦粒的淀粉，所述大麦作物胚乳中SBEIIa酶活性水平已降低，上述淀粉不经改良且相应的直链淀粉含量不少于40％(w/w)。在第四方面的特殊形式里，大麦作物胚乳中SBEIIb酶活性水平也已降低。
本发明的第五方面可说是专注于一种包括根据本发明第四方面的淀粉、其它食物成分或水的合成物。
本发明的第六方面可说是专注于包括大麦胚乳的淀粉颗粒、其它食物成分或水的合成物，其中淀粉颗粒至少包含有75％(w/w)直链淀粉。
本发明的第七方面可说是专注于SBEIIa酶活性水平已降低的大麦作物，其中大麦作物麦粒中淀粉含有的直链淀粉不低于40％(w/w)，或者最好是不低于50％或不低于75％。
本发明的第八方面可说是专注于生产胚乳中SBEIIa酶活性水平已降低的，且麦粒中直链淀粉含量不低于40％(w/w)的大麦作物的方法。该方法包括以下步骤1)在父本大麦作物中引入遗传变异；和2)识别SBEIIa活性减少了的后代作物或父本大麦作物种子。
本发明的第九方面可说是专注于生产胚乳中SBEIIa和SBEIIb酶活性水平均已降低的大麦作物的方法，它包括1)诱变SBEIIa酶活性水平已降低的作物种子；或2)诱变SBEIIb酶活性水平已降低的作物种子；或3)将SBEIIa酶活性水平降低的作物与SBEIIb酶活性水平降低的作物杂交；识别SBEIIa和SBEIIb酶活性水平均已降低的大麦作物。


图1是大麦SBEIIa互补脱氧核糖核酸(cDNA)核苷酸序列(序列识别编号1)。
图2是大麦SBEIIb互补脱氧核糖核酸核苷酸序列(序列识别编号2)。
图3是A.tauschii提出的SBEIIa遗传序列(序列识别编号3)(wSBEII-D1)，其对应于T.aestivum提出的六倍体小麦D基因组淀粉分支酶IIa基因。
图4是部分小麦SBEIIb遗传序列(序列识别编号4)(wbe2b染色体组)。
图5是双纽形核糖核酸结构示意图，其中(A)使用的基因元素顺序是启动子，在致敏方向的SBEIIa或SBEIIb遗传序列(外显子1，2和3)，基因内区(基因内区3)，在抗致敏方向的SBEIIa或SBEIIb遗传序列(外显子1，2，3和4)，转录终止基因/多聚腺嘌呤序列。(B)ds-SBEIIa和ds-SBEIIb基因转录形成“发夹式”核糖核酸结构，该结构带通过致敏和抗致敏序列杂交形成的双纽线区域。与G和AG核苷酸接界的基因内区序列已剪去。
图6是大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb输异基因系聚合酶链反应分析。淀粉分支酶IIb引物对BX17F/AR2bkpnR和SBEIIa引物对BX17F/AR2akpnR增强了各自结构的第一和第二部分，包括外显子1，2，3和基因内区3(致敏方向)，用于识别积极的输异基因系。GP代表未变形的Golden Promise品种。中央的小巷表示分子大小的标记。
图7是大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb输异基因系南部斑点(Southernblot)分析。(A)示出了使用南部斑点杂交的大麦ds-SBEIIa积极输异基因。预期的染色体带尺寸为1836bp。(B)示出了使用南部斑点杂交的大麦ds-SBEIIb积极输异基因。预期的染色体带尺寸为1907bp。GP代表GoldenPromise品种(负对比)。
图8是大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb输异基因系西部斑点(Western blot)分析。使用非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳和SBEIIb特殊抗体对IIb4.3和IIb4.4系列的10颗T1种子(来自于T0作物的种子)进行西部斑点分析，以得到淀粉分支酶IIb的表达式。小巷1(+)用于Glacier品种正对比。
图9是大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb输异基因系西部斑点分析。使用非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳，SBEIIa或SBEIIb特殊抗体对IIa4.1系列的T1种子(来自于T0作物的种子)进行西部斑点分析，以得到SBEIIa或SBEIIb的表达式。凝胶上的小巷均代表同样的种子。每个板的小巷1(+)用于Glacier品种正对比。
图10是大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb输异基因系西部斑点分析。使用非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳，SBEIIa或SBEIIb特殊抗体对IIb4.1系列的T1种子(来自于T0作物的种子)进行西部斑点分析，以得到SBEIIa或SBEIIb的表达式。凝胶上的小巷均代表同样的种子。每个板的小巷1(+)用于Glacier品种正对比。
图11是大麦ds-SBEIIa输异基因的淀粉颗粒形态。对于ds-SBEIIa和ds-SBEIIb输异基因种子，单颗种子的淀粉颗粒均可通过光学显微镜目测。图11A，具有野生型淀粉分支酶IIa的种子表达式(IIa4.2.3系列)。图11B，缺乏淀粉分支酶IIa的种子表达式(IIa4.2.5系列)。在缺乏淀粉分支酶IIa而不是SBEI Ib的种子淀粉中，观察到了重要的形态变化。
图12是淀粉颗粒的扫描电子显微镜检查法(SEM)。(A)为野生型淀粉颗粒(IIa 4.2.3系列)，(B)和(C)来自于ds-SBEIIa输异基因、胚乳的淀粉颗粒(IIa4.2.5系列)。相对于野生型，来自于ds-SBEIIb(钝化的淀粉分支酶IIb)种子的淀粉颗粒看起来没有形态变化。
具体实施例方式
大麦中SBEIIa的改变本发明是基于大麦胚乳中SBEIIa活性降低导致改良淀粉生产的发现，特别是大麦麦粒中直链淀粉高度累积。这个非预期的结果与玉米和稻谷试验结果相反，玉米和稻谷试验中SBEIIa没有改变支链淀粉的轮廓(Blauth等人著，20001，Nakamura著，2000)。可取的是单个或许多另外的淀粉生物合成酶活性发生了改变，更可取的是SBEIIb和SBEIIa的活性降低了。可取的还有大麦作物颗粒不收缩。
大麦作物的生产方法一方面，本发明提出了降低大麦胚乳中淀粉分支酶IIa(SBEIIa)活性的方法。活性的降低与未改良(控制)大麦胚乳相比，活性水平不低于40％，或最好不低于50％、75％，甚至是不低于90％或95％。本方法包含大麦SBEIIa基因表达式的改变，或可能包含大麦SBEIIa基因突变，从而胚乳中SBEIIa活性降低。
本方法可能包含决定大麦胚乳SBEIIa活性的步骤，较好的是测量蛋白质的水平，例如通过免疫检验，或通过本技术领域众所周知的方法如北部斑点杂交(Northern blot hybridization)分析或反向录制聚合酶链接反应(RT-PCR)测定相应的信使核糖核酸(mRNA)水平。本方法还可以包含选择和筛选大麦作物或谷类胚乳中SBEIIa活性减少者的步骤。选择步骤可能基于SBEIIa活性或蛋白质的降低水平，或者可以基于大麦作物麦粒的表型，如增加的直链淀粉含量、或降低的支链淀粉含量、或视觉表型，例如收缩的麦粒。
SBE活性可通过酶活性簇测定，例如通过磷酸化酶刺激试验(Boyer和Preiss合著，1978)。该试验利用磷酸化酶a将葡萄糖1-磷酸盐转化成甲醇-不溶解的聚合物(α-D-葡萄糖)，测定其SBE的刺激。SBE活性可通过碘斑试验测定，该试验测量葡萄糖聚合物分支产生的葡萄糖-多碘化复合物降低的吸光度。SBE活性还可通过支链试验测定，该试验测量作为基质的已还原直链淀粉产生的还原端数量，接着用异淀粉酶消化(Takeda等人著，1993a)。活性的测定最好是在缺乏SBEI或SBEIIb活性的情况下测量。SBE的异构形式表现不同的基质特性，例如SBEI显示分支的直链淀粉有更高的活性，而SBEIIa和SBEIIb表示支链淀粉基质有更高的分支比例。异构形式也可根据转移的葡萄糖链长度区分。
又一方面，本发明提供了降低大麦胚乳中多重淀粉生物合成酶活性的方法，其中一种活性是SBEIIa活性。最好是SBEIIa和SBEIIb的活性均被降低，甚至是SBEI的活性也被降低。与SBEIIa化合时其它可能降低活性的淀粉生物合成酶有SSI，SSII，SSIII。淀粉分支酶也可能发生变化，例如异淀粉酶或支链淀粉酶活性。在另一实施例中，淀粉生物合成酶活性变化除了发生在胚乳外，还可能发生在作物的组织，例如SBEI或SBEII的活性在叶子部位可能增加，以弥补输异基因对SBEIIa进行编码的活性损失-阻止胚乳中分子的基本表达倾向。或者，通过一种或多种淀粉生物合成酶与SBEIIa发生还原反应，淀粉合成可能被进一步加速。对酶的基因编码可能来自于任一变化源，例如来自于细菌或大麦外的其它来源，它也可能被修改而改变催化性质，例如酶温度依赖性的变化(WO94/09144)。
又一方面，本发明提出了增加大麦麦粒中直链淀粉水平(淀粉的百分率)的方法，包括减少大麦胚乳中SBEIIa活性的步骤。直链淀粉含量应不低于50％，最好是不低于60％，65％，70％或75％。在本发明更加优选的实施例中，作为此处例证，该方法提供了不低于80％或90％的直链淀粉含量。
高直链淀粉表型可以通过部分或完全断裂SBEIIa基因表达式，或SBEIIa和SBEIIb基因表达式而取得。基因受抑制的幅度会在某种程度上决定大麦麦粒中淀粉的特性。对从改良的大麦胚乳萃取的蛋白质进行胶体电泳技术的任一部位均能揭示SBEIIa和/或SBEIIb活性改良的状况和范围。改良可通过降低SBEIIa和/或SBEIIb活性，完全废除酶活性，或改变胚乳中SBEIIb或其它酶的分布进行。为进行这些测试，大麦胚乳中的淀粉可以被萃取出来，分析胚乳中的蛋白质，如同Rahman et al，1995中略述的一样。对可溶和淀粉颗粒部分施行本技术领域众所周知的工艺如SDS-PAGE和斑点免疫，识别出发生了SBEIIa和/或SBE改变的作物或麦粒。
大麦作物又一方面，本发明提供了在麦粒的数个发育阶段降低了胚乳中SBEIIa活性水平的大麦作物，能够结果的大麦作物中的淀粉有相对较高的直链淀粉含量。相对于野生型，较好地，胚乳中的淀粉分支酶IIa水平的减少量应不低于50％，若不低于75％更好，最好是不低于90％或95％。术语“野生型”具有在遗传学领域的通常意义，包括大麦栽培品种或此处讲授的未经改良的基因型。
本发明还提供具有期望的父本特征的子代作物和麦粒。
除了降低SBEIIa活性外，本发明还包含具有变形SBEIIb或其它淀粉生物合成酶活性的大麦作物。降低了SBEIIa和SBEIIb活性的作物可通过降低了SBEIIa活性的作物与降低了SEBIIb活性的作物杂交而成，或通过引入输异基因(transgene)对抑制SBEIIa和SBEIIb基因表达的分子进行编码。本发明还包括其它遗传背景的突变。原始的突变异种作物可能与含有合意遗传背景的作物杂交。经过初始杂交，适当数量的回交杂种可用于去除不太合意的背景。合意的遗传背景可能包括提供商业产量和其它特性如农艺学表现、非生物应力阻抗性或壳更少麦粒的合适基因组合。遗传背景还可能包括其它变形淀粉生物合成或改良基因，例如直链淀粉增量剂表型或大麦高直链淀粉冰川(High Amylose Glacier)的amol突变(未知基因)，光滑突变(如在Waxiro品种中发现的)，高直链淀粉含量变化MK6827的突变基因(可从美国农业部ARS国家小谷物胚质研究所获得，地址美国爱达荷州阿伯丁市，831290(the USDA ARS National Small Grain Germplasm Research FacilityAberdeen，Idaho 831290 USA))或高直链淀粉品种M292和M342(SSIIa基因突变)或修饰基因。另外，将其它二次和三次突变与上述系列的结合物组合起来与其它有缩小胚乳(原因基因未知)的大麦系列杂交可能会得到理想的结果。
麦粒本发明还提供含有与野生型相比属于变形淀粉的大麦麦粒。该变形淀粉至少是在大麦麦粒的胚乳发育过程中降低SBEIIa活性的部分后果。与野生型相比，从总淀粉百分率来看，麦粒含有增加的直链淀粉水平和降低的支链淀粉含量，野生型含有约25％的直链淀粉和75％的支链淀粉。最好是在胚乳的发育过程中，同时降低SBEIIa和SBEIIb的活性。更可取的是同时还降低SBEI的活性。利用本技术领域众所周知的测量方法测定的直链淀粉水平，应最少占总淀粉的50％，若不低于60％更可取，最好不低于65％，70％，75％，80％或90％。淀粉颗粒的不正常形态或在光学显微镜下观察到的颗粒双折射的消失或其它方法均能证明直链淀粉水平的增加。直链淀粉水平的测定用碘量法更好，它可用分光光度计(例如，Morrison和Laignelet合著，1983)或高性能液相色谱测定(HPLC，例如，Batey和Curtin合著，1996)。
大麦作物的麦粒中可能有升高的β-葡萄糖水平，这与更多的碳汇入聚合物而非支链淀粉的合成有关。或者，麦粒中有正常水平的β-葡萄糖，例如在成熟麦粒重量的3.0-6.0％范围内。麦粒中最好是含有升高的直链淀粉水平和正常水平的β-葡萄糖。根据SSIIa突变异种大麦(WO 02/37955)麦粒中淀粉成分，象这样的组合不是所期望的。麦粒可能含有改变了胶凝温度的淀粉和/或在后续的胶凝过程中改变了膨胀特性。麦粒还最好具有不收缩的表型。
本发明还提供麦粒制成的面粉和食物。它们可以是未经处理的或处理过的，例如经过分级或漂白。本发明还提供有益于食品生产的来自于特殊大麦作物的麦粒，其胚乳中SBEIIa活性水平已改变，上述麦粒的淀粉有较高的直链淀粉含量和降低的支链淀粉含量。另外，本发明包括用其它方法加工的麦粒，因而它们可能是粉碎的、研磨了的、珍珠状的、粗辗的或裂化的。
淀粉另一方面，本发明提供来源于上述大麦作物的麦粒的淀粉，该作物胚乳中SBEIIa活性水平已降低，淀粉中有高的直链淀粉含量和降低的支链淀粉含量。最好同时降低SBEIIa和SBEIIb的活性，更可取的是同时还降低SBEI的活性。另一方面，本发明提供来自于大麦作物麦粒的淀粉，它至少含有50％的直链淀粉，直链淀粉含量若不低于60％更可取，最好直链淀粉含量不低于65％，70％，75％，80％或90％。用研磨加工法提纯麦粒中的淀粉，例如湿磨加工包括淀粉与蛋白质、油和纤维的分离。研磨加工的初始产品是淀粉颗粒的混合物，因此本发明包括该颗粒物。这些淀粉颗粒物至少含有50％，最好是含有70％，75％或80％的直链淀粉。
该淀粉含有升高水平的抗性淀粉，其具有改变了的结构，该改变可通过包括单个或多个由物理上难于接近消化酶的小组的特殊的物理特征证实，所述消化酶可能是以下结果的原因高β-葡萄糖含量，变形淀粉颗粒形态，明显的与淀粉有关的脂质，结晶性的改变和变化了的支链淀粉链长度分布。直链淀粉含量高也有助于提高抗性淀粉的级别。
本发明还提供来自于例示的大麦作物麦粒的淀粉，它含有数量增加的食物纤维，更优的还具有提高的抗性淀粉水平。该增加还是相对高水平的直链淀粉的部分影响的结果。
降低基因活性的方法输异基因SBEIIa和其它任意淀粉生物合成或改良基因的活性可通过诱使作物发生遗传变异而改变，该过程通过向大麦作物引入输异基因完成。“遗传变异”意味着基因组的改变，在上下文中，它影响SBEIIa的活性，包括点突变、取代、反转、易位和删除等突变形式，也包括引入输异基因。此处涉及的“输异基因”具有生物工艺学技术领域的通常意义，同时它还包括由脱氧核糖核酸或核糖核酸重组技术产生或改变的遗传序列，该遗传序列已引入有机体或有关细胞。输异基因可能包括来源于有机体或细胞的遗传序列，例如抗致敏序列。输异基因通常包括外来的核酸，该核酸并不来源于上述的有机体或细胞。“含输异基因”指的是含输异基因的有机体或细胞。“不含输异基因”指的是基因组中没有任何输异基因。输异基因被整合到有机体或细胞的基因组中，进行稳定的遗传。
降低SBEIIa活性的方法包括将输异基因引入大麦的可再生细胞和从变形细胞再生成含输异基因的大麦作物的步骤。支链淀粉合成涉及的淀粉分支酶包括SBEI、SBEIIa和SBEIIb，本发明包含单独减少的SBEIIa表达或与变形SBEIIb或SBEI结合的表达。因此，输异基因可能比这些基因的任一种更不活跃。此外，由于输异基因(例如如下所示的为双纽形核糖核酸编码，抗致敏，或核糖核酸构成酶)直接将SBEIIb或SBEI基因表达作为目标，或它可能间接地导致SBEIIb或SBEI表达的改变，SBEIIb和/或SBEI的钝化可能是直接的。例如，输异基因的核糖核酸不仅按照序列的同一性或碱基对把SBEIIa基因/核糖核酸作为目标，而且通过改变蛋白质的稳定性或分布，导致SBEIIb或SBEI的减少。另外，本发明专注于联合已改变活性的SBEIIa和单个或多个其它支链淀粉合成酶的变体，它们包括SSI，SSII，SSIII和异淀粉酶或支链淀粉酶等去分支酶。任一或所有这些酶的表达可通过引入输异基因而改变。
在大麦支链淀粉合成基因中有一些知名的脱氧核糖核酸序列，其中任意一种均可作为大麦基因钝化设计输异基因的基础。它们包括SBEIIa(基因银行(GenBank)入藏登记号为AF064562和AF064560)，SBEIIb(基因银行入藏登记号为AF064563和AF064561)。大麦SBEI基因的同系物可使用基于脱氧核糖核酸序列的序列将它与其它谷类区分，例如对于小麦使用那些在发给Li等人著的专利说明书WO 99/14314中陈述的技术。SBEI的小麦tauschii序列与小麦D基因组中SBEI基因极其同源，与大麦基因高度相似，它可在已出版的专利说明书WO 99/14314或其引用文件中查到，该文件已合并到此处供参考。小麦SBEI序列可通过入藏登记号AF076679在基因银行数据库中检索。来自小麦和其它密切关联物种的其它支链淀粉合成基因同系物也可用于修改大麦的基因表达水平。这些基因或其片段可通过本技术领域众所周知的方法获得，包括PCR放大或使用示踪探针杂交。
此处使用的“严格的杂交条件”意思是如果在探针序列和目标序列间同一性不低于90％，最好是不低于95％，杂交将会发生。严格的杂交条件例子是在以下条件下整晚培育含50％甲酰胺溶液，5×SSC(1×SSC＝150mM氯化钠，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯，和20μg/ml变形修剪的脱氧核糖核酸载体，如鲑精脱氧核糖核酸，随后在约65℃，用0.1×SSC清洗杂交载体。其它杂交和清洗条件是众所周知的，并且例示在Sambrook等人著，分子克隆实验室指南(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，冷泉港，纽约(1989)，特别是第11章。
用于构造输异基因的同系物域与相应的大麦基因同一性应不低于85％，不低于90％更好，最好是在适当区域的同一性达到95-100％。最好是输异基因明确地将大麦胚乳中支链淀粉合成基因的表达作为目标，并且对作物中任意位置的支链淀粉合成产生较少或最少影响。这可通过使用合适的控制序列达到目的，如胚乳-输异基因中确定的启动子。
抗致敏已知的改变，特别是明确减少作物中基因活性，基因工程或输异基因方法在本技术领域内是众所周知的。大麦作物引入遗传变异的方法包括合适的抗致敏分子表达，它可弥补目标基因核糖核酸的不足并能与之杂交。一般认为抗致敏分子干扰目标基因信使核糖核酸的翻译、处理或稳定性，从而钝化其表达。设计抗致敏序列的方法在本技术领域内是众所周知的，其范例可从以下位置查找美国专利第5190131号，欧洲专利说明书0467349-A1，0223399-A1和0240208，上述专利文件合并到此以供参考。在作物中使用抗致敏技术已由Bourque(1995)和Senior(1998)评论。Bourque列出了大量的范例说明了抗致敏序列在作物系统作为钝化基因使用方法的使用过程。她还同时指出完全抑制酶的活性没有必要，因为部分抑制更可能导致系统出现可测量的变化。Senior(1998)指出抗致敏方法目前已成为控制基因表达的非常成熟的技术。
大麦SBEIIa，SBEIIb，SBEI或其它支链淀粉生物合成基因的抗致敏分子能够以大麦信使核糖核酸序列为基准或以源于其它物种的脱氧核糖核酸或信使核糖核酸序列的同系现象为基准，例如小麦。抗致敏序列应对应于结构基因或形成影响控制整个基因表达或剪切事件的次序。例如抗致敏序列能对应于大麦SBEIIa或其它基因的标的编码区域，或5’-未转换区域(untranslatedregion，UTR)或3’-未转换区域或它们的结合。它可作为基因内区序列的部分补偿，该序列在转录中或转录后都可能被剪切掉，特别是目标基因的外显子序列。考虑到未转换区域更大的扩散性，瞄准这些区域可提供更专一的基因抑制。抗致敏序列的长度最少应有19个连续的核苷酸，有50个核苷酸更好，最好是有不低于100，200，500或1000个核苷酸。可使用补充整个基因转录的全长序列。其长度最好有100-2000个核苷酸。抗致敏序列与转录目标的同源程度应不低于85％，不低于90％更好，最好是95-100％。抗致敏核糖核酸分子可包含不相干的序列，这些序列有稳定分子的功能。
协同抑制另一可使用的分子生物方法是协同抑制。协同抑制的机理目前仍不完全明了，但人们认为它包含了转录后基因压制(post-transcriptional genesilencing，PTGS)，从这方面看，它与抗致敏抑制的许多范例非常相似。它通过将基因或其片段的额外拷贝沿启动子表达的致敏方向引入作物。就上述抗致敏序列而论，致敏片段的尺寸、与目标基因区域的对应性和与目标基因的相同程度是很重要的。在一些实例中，遗传序列的附加拷贝会干扰目标作物基因的表达。具体实施协同抑制的方法可参考专利说明书WO 97/20936和欧洲专利说明书0465572。
双纽形核糖核酸-间接基因抑制另一可用来向大麦作物引入遗传变异的方法是双纽形核糖核酸间接基因抑制。本方法也包括转录后基因压制(PTGS)。本方法中，引入了脱氧核糖核酸指导部分双纽形核糖核酸产品的合成。因此，脱氧核糖核酸中有致敏和抗致敏序列，当转录成核糖核酸时，能杂交形成双纽形核糖核酸区域。在较优的实施例中，致敏和抗致敏序列用含有基因内区的隔离区域分开，当转录成核糖核酸时，该基因内区被切割掉。该排列可导致更高的基因抑制效率。双纽区域可能含有一个或两个核糖核酸分子，从任意一个或两个脱氧核糖核酸区域转录。双纽分子的存在从作物系统内部触发，破坏双纽形核糖核酸和从目标作物基因转录相应的核糖核酸，有效的减少或消除目标基因的活性。实施本技术的方法可参照澳大利亚专利说明书99/292514-A和专利说明书WO99/53050。杂交的致敏和抗致敏序列长度应都不少于19个连续的核苷酸，50个核苷酸更好，最好是有不低于100，200，500或1000个核苷酸。可使用对应于整个基因转录的全长序列。其长度最好有100-2000个核苷酸。抗致敏序列与转录目标的同源程度应不低于85％，不低于90％更好，最好是95-100％。抗致敏核糖核酸分子可包含不相干的序列，这些序列有稳定分子的功能。
核糖酶核糖酶可用于引入遗传变异，该遗传变异负责钝化大麦中期望的基因表达。核糖酶是带有酶或催化功能的核糖核酸分子，能在特定场所分裂由一个或两个杂交序列定义的其它核糖核酸分子。核糖核酸的分裂钝化了目标基因的表达。核糖酶还可用作抗致敏分子，有助于基因钝化。核糖酶有一个或更多个催化域，特别是存在于杂交序列之间的头锤型和发夹型核糖酶。其它可用的核糖酶主题包括核糖核酸分离，I或II组基因内区，肝炎三角病毒类型。本文已参考欧洲专利说明书0321201和专利号为6,221,661的美国专利。在输异基因作物中使用核糖酶钝化基因已有实证，例如Wegener等人著(1994)提出的。
遗传结构/载体本发明提供了独立的包括核糖核酸和较好为脱氧核糖核酸的核酸分子，所述核糖核酸和脱氧核糖核酸为基因抑制分子编码。特别地，核酸为抗致敏、致敏(协同抑制)、双纽形核糖核酸或核糖酶分子编码。核糖酶分子瞄准大麦SBEIIa遗传序列，有效地钝化了它在大麦麦粒胚乳中的表达。本发明还提供了包括独立的核酸分子，单个或多个控制元素如启动子、增强剂、转录中止子或多聚腺苷酰作用序列在内的遗传结构。这些元素在本技术领域是众所周知的。遗传结构还包括基因内区序列，它帮助作物中输异基因的表达，特别是如同大麦一样的单子叶作物。术语“基因内区”使用其通常意思，表示经过了转录但不对蛋白质进行编码的基因片段，它在开始翻译前被从核糖核酸剪去。基因内区可合并成5’-未转换区域，或在输异基因对已翻译产品进行编码时合并成编码区域，或放在转录区域的任意位置。
本发明还提供包括遗传结构载体，例如质粒载体。术语“载体”含有能在体内或体外表达的表达载体，和能从一个细胞或组织转移到另一个细胞或组织的转换载体。载体含有提供细胞复制的序列，例如大肠杆菌或土壤杆菌等原核生物。载体是含有T-脱氧核糖核酸序列的二元载体，规定在序列边缘至少有一个T-脱氧核糖核酸边缘序列，它能够引入大麦细胞中。本发明还提供含载体的细胞，例如土壤杆菌或可再生的大麦细胞，如未成熟的胚胎角质细胞。或者，该细胞能转换成含有输异基因的大麦细胞。
启动子/中止基因本发明的输异基因或其它遗传结构可包括转录起始区域(启动子)，它能够控制或构成大麦胚乳的表达。启动子可以是特定的组织，具有选择表达的性能或只存在于胚乳。启动子或者从确定的胚乳(如高分子量的麦谷蛋白启动子，小麦SSI启动子，小麦SBEII启动子，小麦GBSS启动子)选出，或者从不确定的胚乳(如泛激素启动子，或CaMV35S，或增强型35S启动子)选出。启动子受许多因素的影响，如光、热或压力。通常，启动子可用待表达的遗传序列5’提供，其结构可能含有其它增强转录的元素，如nos 3’或ocs 3’多聚腺苷酰作用区域或转录中止基因。脱氧核糖核酸图示区域可合并到含有适当的选择性标记基因序列和其它元素的载体中，或合并到载体中与含有这些序列的载体协同变换。
大麦转化方法在本技术领域，通过引入外源性核酸向作物引入遗传变异，为作物原生质体或未成熟作物胚胎的再生服务的单子叶作物如大麦的转化方法是众所周知的，见范例，Wan和Lemaux(1994)；Tingay等人著(1997)；Nehra在加拿大的专利申请号为2092588专利申请；加拿大国家研究理事会(NationalResearch Council of Canada)在澳大利亚的专利申请，编号为61781/94；日本烟草公司(Japan Tobacoo Inc.)在澳大利亚的专利申请，编号为667939；Monsanto公司国际专利申请PCT/US97/10621；美国专利5589617。其它方法在专利说明书WO99/14314种有陈述。载有期望的核苷酸序列或遗传结构和选择性记号的载体可引入可再生大麦细胞，该细胞来自于培养作物的组织，或外置体，或何时的作物系统如原生质体。选择性的标记基因可为大麦细胞提供抗生素或除草剂保护，或允许使用甘露糖等基质。选择性的标记更可为大麦细胞提供潮酶素保护。可再生的大麦细胞优先来自于未成熟的胚胎角质，成熟的胚胎，源于上述组织的愈合组织，或分生组织。
变化的作物可能含有选择性的标记基因，或那些在再生过程中或再生后能去除的基因，例如通过删除去除基因组中的选择性标记基因，或将选择性的标记基因与SBEIIa-抑制性输异基因分开。
输异基因或突变组合成染色体的作物可进行筛选，例如通过使用合适的特别适用于输异基因的核酸探头，或通过表型观察。多种方法可用于确认转化作物的存在。例如，聚合酶链接反应(PCR)可用于放大转化作物的独特序列，用胶体电泳技术或其它方法探测放大了的产品。可用传统方法从作物中萃取脱氧核糖核酸，用引子引发聚合酶链接反应(PCR)可区分变化的作物与未发生变化的作物。例如，可设计用引子放大来自于变化载体的脱氧核糖核酸区域，将载体读入结构中，和用利害基因设计反转引子。如果作物已顺利变化，引子将仅放大其片段。确认正变化的另一方法是南部斑点杂交，它在本技术领域非常著名。转化或突变的作物可以识别，也就是说，通过表型可将它与未转化的或野生型作物区分开，例如与选择性标记基因的现状进行对比，或用免疫学方法分析现有的特殊蛋白质，或通过缺少某种蛋白质，如用ELISA试验检测胚乳中SBEIIa蛋白质。筛选作物时使用可通过观测麦粒表型特点区分的示踪物，例如通过视觉检查或测量收缩的麦粒，或测定升高的直链淀粉含量，或用显微镜检查双反射的存在。
突变引入遗传变异可导致大麦胚乳中SBEIIa和其它酶活性减少，遗传变异可通过在相应基因或基因的控制序列内经合适的突变获得。基因受抑制的程度会在某种程度上决定淀粉制成品的特性。突变可能切断或无效，这些对淀粉的性质有重大的影响，但是，渗漏突变体可充分减少支链淀粉生物合成酶活性，使大麦淀粉或麦粒产生感兴趣的特性，并导致支链淀粉结构变化。其它染色体的重排也是有效的，它们包括删除，反转，复制或点突变。
可通过化学或辐射方法产生突变，例如对种子用EMS或叠氮化钠(Zwar和Chandler，1995)处理，或γ放射。突变的隔离可通过筛选出已发生诱变的作物或种子完成。例如，已发生诱变的大麦群体可筛选出以获得麦粒中高的直链淀粉含量和/或长过普通支链淀粉链长度的分布，或通过ELISA损耗SBEIIa蛋白质，或改变麦粒的形态(Green等人著，1997)。对缺乏一种SBE活性的大麦基因型优先进行筛选，例如在SBEIIb-负面背景。突变随后与有期望的基因背景的突变作物杂交，引入期望的基因背景；同时进行适当数量的回交，除去原来的不受欢迎的父系背景。
为SBEIIa或其它有关支链淀粉合成的酶编码的基因发生突变一般会导致相应的直链淀粉含量的增加。由于碳从支链淀粉向直链淀粉转移，单个麦粒中直链淀粉量可能增加。或者如果麦粒中淀粉产量发生了重大下降，单个麦粒中直链淀粉量可能减少。任意一种情况下，相应的直链淀粉水平在淀粉中所占的百分率都是上升的。
适于食品生产另一方面，本发明提供了适于食品生产的大麦，大麦作物麦粒的胚乳在麦粒发育阶段就降低了SBEIIa的活性，上述麦粒中的淀粉有相对较高的直链淀粉含量和和低的支链淀粉含量。本发明的大麦作物产出的麦粒更适合于食品生产，特别是商业食品生产。该食品生产包括面粉或其它可用于商业食品生产制品成分的生产。
期望的大麦基因背景包括考虑农作物产量和其它特性。该特性可能包括想要冬季大麦还是春季大麦，农艺学性能，抗病性和非生物压力抵抗性。在澳大利亚，人们希望的大麦栽培品种有Sloop，Schooner，Chebec，Franklin，Arapiles，Tantangara，Galleon，Gairdner或Picola。该例子仅适用于澳大利亚特定生产区，其它品种适合于其它生长区。推荐的本发明的大麦品种产量应在多个生长区的产量不低于相应野生型品种产量的80％，若不低于90％更可取，更可取的是不低于95％。在受控的现场试验中，产量可轻易测量。若大麦作物外壳更少或是“裸露的”，它会更受欢迎，因为大麦麦粒外皮的存在为麦粒的加工带来了更大的困难。
麦粒的淀粉含量不应低于约12％(w/w)或15％，不低于25％更理想，不低于35％更好，最好是能接近野生型的45-50％(w/w)含量。淀粉含量低于野生型品种的可能原因是降低了支链淀粉水平。对于商业食品生产，由于可生产相对价值较高的直链淀粉含量高的产品，该麦粒仍然有用。其它期望的特性包括研磨麦粒的产量。虽然大多数麦粒形式均可生产珍珠麦，某种结构的麦粒特别抗研磨。对商业应用可能产生影响的另一特性是麦粒生产产品的着色。麦粒的削皮处或其它部分显示出比一般部分更有效的着色性，可能会局限其商业应用于较小范围，如作为有色面包(总体有色或片段有色)的成分。大麦通常的颜色是紫色，会很亮且着色能力强，在大多数食品中是不受欢迎的。另一可能促使大麦具有更高价值的方面是从麦粒中提取淀粉的程度，提取比例越高用处越大。麦粒的外形是影响其商业用途的另一特征，它可影响到麦粒研磨的难易程度。例如，直链淀粉含量高的MK6827作物大麦颗粒非常细长，难于研磨和加工。方便测量细长型的颗粒和相应的有用性的是颗粒长度与厚度的比率(L/T比率)。该比率反映了淀粉的性质。平均而言，该比率应低于5.5，变化范围在4-5之间更好，最好是低于3.5。
为取得更高的产量和达到本发明需实现的益处，如含高水平直链淀粉的淀粉的生产，或选择性的改变淀粉中链长度的分布，期望麦粒能完全填充。因此，最好是有不收缩的表型。然而，在麦粒较少填充时，发明的其它方面更易满足。麦粒较少填充时，淀粉中糊粉层或微生物的比例会更高，从而大麦面粉或其它产品会含有更多的糊粉层有益成分。产品中糊粉层含量高会导致产品中含有更高的某种维生素含量，如叶酸，或更高的矿物质，如钙，与较高的抗性淀粉水平和/或β-葡萄糖水平结合可产生协同影响，如增强大肠对矿物质的吸收。
为使直链淀粉含量最大化，大麦作物除了降低SBEIIa活性外，还应有其它表型特征。因此遗传背景可能包括另外的在AC38发生的amol突变(原因基因不清楚)或光滑突变(例如在Waxiro品种的发现)。另外，在其它可得到的胚乳缩小的大麦突变异种中，可能发生双重突变。胚乳缩小的原因基因目前尚不清楚。
使用标准方法，淀粉很容易与大麦麦粒分离开，例如Schulman等人著(1991)提出的方法。在工业规模，可使用干磨法和湿磨法。来源于本发明的大麦作物的淀粉有相对较高的直链淀粉含量。大麦作物中淀粉含有不低于35-45％直链淀粉的可认为直链淀粉含量较高。本发明提供来自于大麦作物麦粒的淀粉，它至少含有50％(w/w)的直链淀粉，直链淀粉含量若不低于60％更可取，最好直链淀粉含量不低于65％，70％，75％，80％或90％。
需要理解的是论及的相应直链淀粉水平与总淀粉含量有关，因而淀粉的剩余物主要是淀粉的中间类型或者是支链淀粉或者是两者的混合物。
β-葡萄糖众所周知，大麦中β-葡萄糖的水平变化范围较广，占大麦重量从约4％到约18％，但通常而言，主要变化范围是4％到约8％(例如，Izydorcyk等人著，2000)。已开发了增强型大麦品种，例如，β-葡萄糖占大麦重量约从15％到18％，但具有光滑表型。
本发明预期的β-葡萄糖水平依赖于遗传背景，其中支链淀粉合成酶的活性，包括SBEIIa，均被减少。具体的例子表明相应的普通β-葡萄糖合成，然而，本发明的变体拟得到升高的相应β-葡萄糖水平。因而大麦作物麦粒的β-葡萄糖含量约为总未去壳麦粒重量的3-6％(w/w)。本发明的另一种变体表示β-葡萄糖含量高于6％，或更高，例如6-8％。测得的光滑突变异种的β-葡萄糖水平高到15-18％，例如，品种Prowashonupana，商业销售名为SustagrainTM，(ConAgraTM特殊谷物产品公司，奥马哈，内布拉斯加州(ConAgraTMSpeciallyGrain Products Company，Omaha，Neb.)，美国)，目前本发明的目标是β-葡萄糖水平同它一样高，或更高。
胶凝温度胶凝是淀粉微粒的分子次序受到破坏，伴随着性质方面不可逆变化，如微粒膨胀，微晶熔解，双折射丧失，粘度增加和淀粉溶液化。玉米的ae(直链淀粉增加)突变导致淀粉中高的直链淀粉含量表明其胶凝温度比普通玉米的更高(Fuwa等人著，1999，Krueger等人著，1987)。另一方面，大麦sex6突变缺乏淀粉合成酶IIa活性，产生的淀粉具有较低的胶凝温度，胶凝峰值点的热焓与对照植物产生的淀粉相比有所减少(Morell等人著，2003)。
另一方面，如同差示扫描量热法测定结果所示，淀粉的胶凝温度有了变化。与野生型作物相比，该变化或者是升高，或者是降低。淀粉在胶凝温度变化的同时，有相对较高的直链淀粉含量。胶凝温度降低时，与其它大麦品种生产的淀粉直链淀粉含量升高相比，直链淀粉含量有所减少，或者与大麦淀粉中含有正常直链淀粉水平相比，直链淀粉含量有所减少。本发明另一可选择变体是企图使胶凝温度不变或相对于野生型大麦淀粉的胶凝温度略有升高。野生型大麦淀粉的典型胶凝温度用差示扫描量热法测定的第一个峰值温度约为56℃。
膨胀体积与野生型淀粉相比，本淀粉在过量热水中膨胀率很有特色。膨胀体积的通常测定方法是将淀粉或面粉与过量水混合，加热提高温度，到温度高于90℃。用离心法收集样品，膨胀体积用样品中沉淀物质的干重质量表示。当想增加食品制备中的淀粉含量时，低膨胀特性是有用的，特别是在制作含水食物时。
结晶性与普通的从大麦中分离出的淀粉相比，本发明挑选的大麦变体的淀粉结构在结晶性方面存在差别，其结晶度有所降低。淀粉结晶性降低被认为同增强味觉性能有关，并有助于更光滑的口感。淀粉结晶性的降低是由于单种或多种支链淀粉合成酶的活性水平降低，结晶性测定的典型方法是X-射线结晶学法。
支链淀粉链长度的分布支链淀粉结构变化的测定是通过测定链长度的分布，或淀粉的聚合度。链长度分布可在用异淀粉酶去分支后，使用荧光辅助碳水化合物电泳法(FACE)测定。本发明淀粉中的支链淀粉链长度分布范围是5-60，高于野生性作物淀粉去分支后测定的分布情况。链长度更长的淀粉的相应分支频率更低。因而存在支链淀粉时，淀粉可能有更长的支链淀粉链长度分布。
食物特性淀粉是人类饮食中碳水化合物的主要来源，本发明的麦粒及其制品可用于准备食物。食物可被人或动物消耗，例如，家畜生产或宠物食品。源于变形大麦作物的麦粒容易在食品处理程序使用，因此本发明包括磨碎的、研磨的、碎块的、圆形的或碾压的谷物或产品，它们源于谷类加工或上述大麦作物的整个麦粒，包括面粉。这些产品可用于各种各样的食品，例如粉状制品如面包、蛋糕、饼干和其相似物，或者食品添加剂如增稠剂或粘合剂，或制作麦芽或其它大麦饮料，面条和即食汤。源于本发明麦粒的颗粒或产品特别适用于早餐谷类。本发明的淀粉含直链淀粉量大，可生产用于糖果工业的高强度凝胶，或允许较少的成型时间和固化时间。它们还可用作涂层，例如，减少油炸马铃薯或其它食物的油类吸附量。
食物纤维在本说明书中，食物纤维指碳水化合物和碳水化合物的消化产物，它们在健康人体的小肠中不被吸收，进入大肠。包括抗性淀粉，β-葡萄糖和其他可溶和不可溶的碳水化合物的的聚合物。它还至少包括在大肠中由驻留的微生物群落发酵的部分碳水化合物的一部分。
本发明的淀粉含有相对较高的食物纤维水平，更独特的直链淀粉和随意提高的β-葡萄糖水平。本发明的麦粒中食物纤维含量可能或非单独来自于增加的相应胚乳中直链淀粉含量。β-葡萄糖处于提高的水平，有助于提高食物纤维水平。
本发明的某些方面可能起因于糊粉层和微生物的联合作用以及与高水平饮食纤维的联合。特别地，在麦粒中有相对较高水平的糊粉或微生物时，它也可能出现。首先，大麦有一个重要的比其它经济谷类均要厚的糊粉层，它有三个细胞糊粉层。其次，当大麦颗粒轻轻收缩时，胚乳的总量会减少，而糊粉层和微生物总量会相对上升。因而大麦有相对高水平的某种有益元素或与升高的抵抗力结合的维生素，该元素包括二价阳离子如有生物作用的Ca++和维生素如叶酸或抗氧化剂如生育酚和生育三烯酚。钙对于生长、骨骼的沉积和其它钙化组织是必需的，可降低在以后的生命中患骨质疏松症的风险。摄取叶酸可保护神经管免受损害并降低患心血管疾病的风险，从而增强抗性淀粉与β-葡萄糖联合作用的影响。叶酸还被认为可降低患某些癌症的风险。生育酚和生育三烯酚带来抗氧化剂的益处，一般认为它们可降低癌症和心脏病的风险，还有减少食品组分氧化带来的不受欢迎的影响的作用，如脂肪酸可导致恶臭。研磨产品的一种特别形式是其中含有糊粉层。为增加糊粉层的数量，需采用特殊的研磨程序。该方法参见Fenech等人著(1999)。因而，源于麦粒研磨或加工含有糊粉层和微生物的产品会有额外的营养好处，不需要从单独从其它来源添加这些元素。
抗性淀粉抗性淀粉被定义为淀粉和不被健康人体小肠吸收但进入大肠的淀粉消化产物的总称。因而，抗性淀粉不包括能被小肠消化和吸收的产物。抗性淀粉包括物理上难于接近的淀粉(RS1型)，抗性颗粒(RS2)，逆行淀粉(RS3)和化学改良淀粉(RS4)。
改变的淀粉结构和特别是本发明具有高直链淀粉水平的淀粉作为食物消耗时可引起抗性淀粉的增加。如果β-葡萄糖处于升高的水平，抗性淀粉还可能增加，它倾向于将β-葡萄糖与淀粉微粒结合到一起，发挥保护作用。淀粉可能处于RS1型，就某种程度上而言，难于消化。用V-复合结晶性测量的淀粉脂类结合体也有助于抗性淀粉水平的升高。在这种情况下，由于脂类的存在引起淀粉物理上难于接近，导致抗性上升。相应地，它可能被认为是RS1淀粉。例子中的大麦作物淀粉由于淀粉颗粒的结构可能会难于消化，相应地，它可能被认为是RS2淀粉。每一种这些特性可能单独出现或作为一个整体出现。
可以理解本发明的一个好处是它可提供具有特别营养价值的产品，而且，它达到该目的不需要改良淀粉或改变大麦麦粒的其它成分。但是，有人可能希望对淀粉，β-葡萄糖或麦粒的其它成分进行改良，本发明包括那些改变了的组分。改良的方法是非常著名的，包括用传统方法抽出淀粉或β-葡萄糖或其它组分，改良淀粉增加抗型。淀粉或β-葡萄糖可通过用热和/或水分处理改良，或进行以下处理物理处理(例如球磨研磨)，酶处理(例如使用α-或β-淀粉酶，pullalanase或类似物)，化学水解(使用液体或气体试剂进行干法或湿法水解)，氧化处理，用双官能团试剂交叉结合(例如偏磷酸三钠，氯氧化磷)，或羧甲基化作用。
血糖生成指数血糖生成指数(GI)是试验食物的影响和白面包或葡萄糖对血糖浓度变化的影响的对比。血糖生成指数是度量餐后食物对血清中葡萄糖浓度的可能影响和为保持血糖动态平衡对胰岛素的需求。由于高直链淀粉含量和β-葡萄糖含量高的影响，本发明提供的重要产品属于具较低血糖生成指数的低热产品。低热产品可能以源于研磨大麦麦粒的面粉夹杂物为基础。然而，它可能希望初次处理麦粒时去除麦粒重量的10％或20％，从而移去糊粉层并尽可能移去微生物。圆化步骤的作用是减少脂质含量，从而降低食物的热值。该食物可作填充物，增强大肠健康，在提供低热食物产品的同时，减少餐后血清中葡萄糖和脂质的浓度的作用。使用该圆化产品将导致糊粉层和微生物提供的营养益处会减少。用圆化产品生产的面粉有更好的外观，因为用该方法制成的产品会更白。
非食品应用本发明提供改良淀粉，它具有提高了的直链淀粉水平或降低了支链淀粉水平，其性质可满足任何工业需求。淀粉广泛应用于非食品行业，包括造纸、纺织、瓦楞纸板加工和粘合剂工业(Young，1984)。未改良淀粉的物理性质限制了它在某些方面的应用，常需要进行化学改良。而化学改良往往非常昂贵或有其它缺点。本发明提供了收获后需要较少改良的淀粉，特别是与其它物理性质结合降低了支链淀粉含量。例如，用本发明的麦粒制成的淀粉和产品的糊化温度、抗剪切压力、膜强度和/或抗水性可能被改变。该淀粉也可用于制备可生物降解的、蓬松的包装材料替代聚苯乙烯。
可理解的是，虽然本发明的不同方面均已给出了各种各样的指标，此后该发明将专注于两个或多个方面的联合作用。
例子例1.材料与方法愈合组织诱导介质来自于大麦胚胎的含麦草畏(Dicamba)(2.5mg/l)的BCI-DM介质用作愈合组织诱导物。每升介质的组成如下MS salt Macro(10x stock) 100mlMS micro(100x stock) 10ml铁(200x stock)5ml乙二胺四乙酸(EDTA)(200x stock)5ml麦芽糖15.0g硫胺-氯化氢(1mg/ml) 1ml肌醇 250mg酪蛋白水解物 1g麦草畏(1mg/ml)2.5ml脯氨酸345mg将pH值调节到5.8，然后加入3.5g/l的植物凝胶。对介质进行高压蒸气灭菌之后，加入150mg/l的提门叮(Timentin)和50mg/l的潮霉素(Hygromycin)。
大麦再生介质大麦卡丽(calli)在含有BAP(1mg/l)的FHG介质中再生FHG-I Macro(10x stock) 100mlFHG-II Micro(100x stock)10ml硫胺-氯化氢(1mg/ml) 1ml铁(200x stock) 5ml乙二胺四乙酸(200x stock)5mlBAP(1mg/ml) 1ml肌醇100mg谷氨酰胺730mg麦芽糖 62g将pH值调节到5.8，然后加入3.5g/l的植物凝胶。对介质进行高压蒸气灭菌之后，加入150mg/l的提门叮(Timentin)和20mg/l的潮霉素。
碳水化合物测定与分析应用Schulman等人著(1991)方法将淀粉与大麦麦粒分开。
利用Megazyme公司(Bray，Co Wicklow，爱尔兰共和国)提供的总淀粉分析成套工具测定淀粉含量。淀粉含量与对照植物含量相对比。从总麦粒重量中减去淀粉重量得到麦粒中总的非淀粉含量以确定是否总重量的减少是由于淀粉含量的减少。
用HPLC方法测定分隔开去分支淀粉后直链淀粉含量或直链淀粉/支链淀粉比率，或利用Batey和Curtin(1996)中列出的碘结合法进行测定。简言之，淀粉溶解在二甲基亚砜(DMSO)中去脂并在乙醇中再沉淀。将淀粉重新溶解在二甲基亚砜并加入水，进一步稀释，再加入碘/碘化钾溶液，在605nm测定溶液的吸光度。直链淀粉含量通过标准曲线法测定，标准曲线用含0-100％直链淀粉的直链淀粉和支链淀粉的混合物绘制。未去分支淀粉的直链淀粉/支链淀粉比率的分析应按照Case等人著(1998)中的顺序进行。
利用Megazyme公司(Bray，Co Wicklow，爱尔兰共和国)提供的成套工具测定β-葡萄糖水平。
采用荧光辅助碳水化合物电泳法(FACE)对淀粉去分支情况和链长度分布进行分析，使用毛细管电泳单元按照Morell et al(1998)中的规定进行分析。
差示扫描量热法(DSC)用差示扫描量热法测定淀粉中由于直链淀粉和支链淀粉比率的改变引起的胶凝温度的变化。用Pyris 1差示扫描量热法(Perkin Elmer，Norwalk CT，美国)测定胶凝温度。淀粉与水按照2份水1份淀粉的比率混合，将混合物(40-50mg，准确称量)放入不锈钢平底锅中并密封。在从20℃到140℃范围内扫描样品，温升速度为10℃每分钟，用空的不锈钢平底锅作为参比。使用Pyris软件测定胶凝温度和焓。
RVA分析应用快速粘度分析仪(Rapid-Visco-Analyser)(RVA，Newport ScientificPty Ltd，Warriewood，悉尼)测定面粉粘度，使用条件见Batey等人著，1997的报道。为了抑制α-淀粉酶，在所有试验中使用浓度为12mM硝酸银。测定参数包括峰值粘度(最大热糊化粘度)，保持强度，最后粘度和糊化温度。
面粉膨胀面粉膨胀体积根据Konik-Rose等人著(2001)提出的方法测定。在规定的温度下，收集胶凝物质，然后测定样品与水混合前后样品的重量，得出水的吸收量。
例2将SBE基因与大麦隔离建立大麦互补脱氧核糖核酸(cDNA)和染色体组库利用噬菌体载体，用标准方法制作大麦互补脱氧核糖核酸和染色体组库(Sambrook等人著，1989)。用ZipLox载体(生命技术)按照试剂的供应协议制作互补核糖核酸库。用Y1090(ZL)大肠杆菌应力测定的库的滴定度是2×106pfu。从E.Lagudah(CSIRO)得到的大麦脱氧核糖核酸染色体组库是根据Morex.多样性制作。脱氧核糖核酸用MboI消化并绑定到EcoRI/BamHI消化EMBL3cos载体。克隆片段可在SalI消化过程中释放出来。
将淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb遗传序列与H.vulgare染色体组库隔离库筛选条件是在25％甲酰胺，5×SSC，0.1％SDS，10x Denhardts溶液，100μg/ml鲑精脱氧核糖核酸等的混合溶液中杂化16小时，杂化温度为42℃，接着用2×SSC，0.1％SDS在65℃清洗3×1小时(介质紧缩)。克隆含SBEIIa和SBEIIb基因或其中实质部分单独且按次序进行。脱氧核糖核酸序列与表1中列出的入藏登记号的序列被确定两种关注的基因均已与大麦隔离。SBEIIa和SBEIIb互补脱氧核糖核酸序列可通过特别的启动子应用反转录-聚合酶链接反应(RT-PCR)获得，这在本技术领域是众所周知的。大麦SBEIIa和SBEIIb互补脱氧核糖核酸序列见图1和2，小麦SBEIIa和SBEIIb染色体组序列见图3和4。
表1.谷类作物中淀粉分支酶基因特性


例3构造转化试验改变大麦SBEIIA和SBEIIB表达双纽形核糖核酸(dsRNA)构造用于减少大麦SBEIIa或SBEIIb基因的表达。在该构造中，对应于部分SBEIIa或SBEIIb基因的期望核酸序列出现在启动子的致敏和抗致敏方向以便于表达的含互补区域核糖核酸能组成碱基对并形成双纽形核糖核酸。致敏和抗致敏序列间的间隔区含有基因内区序列，它在转化的作物中作为核糖核酸的一部分被转录时，会被剪切掉以形成紧密的“发夹”式双纽形结构。有人发现由于双纽形核糖核酸结构的影响，基因内区的夹杂物可增进基因压制的效率(Smith等人著，2000)。期望的核酸与高分子量麦谷蛋白(HMWG)启动子序列(DX5亚组基因启动子，入藏登记号X12928，Anderson等人著，1989)和来自于土壤杆菌(nos3’)中胭脂碱合酶基因的中止子序列相连接。
含有SBEIIa或SBEIIb致敏/抗致敏片段的双纽形核糖核酸结构，由于在大麦和小麦基因之间高度的序列等同性，源于小麦SBEIIa和SBEIIb基因，最初在载体pDV03000上产生然后被切掉并绑定到大麦转化载体pWBVec8。该结构的示意图参见图5。pWBVec8载体含有许多限制性内切酶活动场所，期望的脱氧核糖核酸序列在该处形成。
SBEIIa双纽形核糖核酸结构含有小麦SBEIIa基因经聚合酶链接反应放大的1536bp核苷酸序列(基因银行入藏登记号AF338431，见图3)。它包括由所有外显子1、2和部分外显子3组成的468bp序列(核苷酸位置见图3中1058到1336，1664到1761和2038到2219)，该序列两面均有EcoRI和KpnI限制性场所(片段1)；由部分外显子3和4、SBEIIa的整个基因内区3组成的512bp序列(核苷酸位置见图3中2220到2731)，该序列两面均有KpnI和SacI场所(片段2)；和由SBEIIa的外显子1，2和3组成的528bp片段(核苷酸位置见图3中1058到1336，1664到1761和2038到2279)，其两面均有BamHI和SacI场所(片段3)。然后绑定片段1，2和3以便于片段3序列沿片段1的抗致敏方向绑定到片段2。将pDV03000载体的遗传结构命名为pDV03-IIa，将双纽形核糖核酸基因命名为ds-SBEIIa。
SBEIIb双纽形核糖核酸结构的策略是类似的。SBEIIb结构含有小麦SBEIIb基因经聚合酶链接反应放大的1607bp片段(序列轮廓见图4)。它包括由所有外显子1、2和部分外显子3组成的471bp序列(核苷酸位置见图4中489到640，789到934和1598到1769)，该序列两面均有EcoRI和KpnI限制性场所(片段1)；由部分外显子3和4、淀粉分支酶IIb的整个基因内区3组成的589bp序列(核苷酸位置见图4中1770到2364)，该序列两面均有KpnI和SacI场所(片段2)；和由SBEIIb的外显子1，2和3组成的528bp片段(核苷酸位置见图4中489到640，789到934和1598到1827)，其两面均有BamHI和SacI场所(片段3)。然后绑定片段1，2和3以便于片段3序列沿片段1的抗致敏方向绑定到片段2。将pDV03000载体的SBEIIb双纽形核糖核酸遗传结构命名为pDV03-IIb，将双纽形核糖核酸基因命名为ds-SBEIIb。
使用限制性内切酶sApaI和NotI将启动子-致敏/抗致敏-中止子盒子插入二位载体pWBVec8中。将pWBVec8中的SBEIIa结构命名为pVec8-IIa，将pWBVec8中的淀粉分支酶IIb结构命名为pVec8-IIb。结构示意图见图5。
使用的小麦SBEIIa序列和相应的大麦SBEIIa序列间的同一性经间隙程序比较结果为93％。类似地，使用的小麦SBEIIb序列和相应的大麦SBEIIb序列间的同一性为92％。双纽形核糖核酸技术对于压制双纽形区域中序列同一性高于85％的基因表示是有效的，因此期望用小麦序列构造的双纽形结构能对大麦序列有效。
例4大麦转化用根癌土壤杆菌或生物弹作为媒介的大麦转化方法已有叙述(Tingay等人著，1997；Wan等人著，1994)，可用于转移含输异基因的作物产生的脱氧核糖核酸。本例中，如上所述二元载体中的基因结构通过三系结合方法引入到剧毒的土壤杆菌菌株，然后用它将含抑制基因的T-脱氧核糖核酸(ds-SBEIIa或ds-SBEIIb)和选择性的标记基因(为抗潮霉素和CaMV35S启动子表示编码)引入未成熟大麦胚胎胚鳞的可再生细胞中，过程如下。
在开花12-15天之后，将正在发育的Golden Promise品种大麦种子从温室中的成年作物的穗状花序移开，在20％(v/v)漂白液中消毒10分钟，然后用95％乙醇漂洗一次，再用无菌水漂洗七次。胚胎(大约尺寸为1.5到2.5mm)在无菌条件下从种子中移出，并且切断与胚胎相连的轴。胚胎切边并放置到放有愈伤组织诱导介质的陪替氏培养皿中。土壤杆菌转化结合子(菌株AGL1)在MG/L液体培养基中生长(1升溶液中含5g甘露醇，1g L-谷氨酸，0.2gKH2P04，0.1g NaCl，0.1g MgSO4.7H2O，5g胰化(蛋白)胨，2.5g酵母抽提物，和1μg生物素，pH7.0)，培养基还含壮观霉素(50mg/l)、利福平(20mg/l)和培养时通风温度为28℃，培养到浓度约为2-3×108细胞/ml，然后取约300μl细胞悬浮液加入到放有胚胎的陪替氏培养皿中。2分钟后，多余的液体上浮，胚胎发生翻转造成切边(胚鳞的叶腋侧)朝上。将胚胎转移到放有愈伤组织诱导介质的新培养皿，在24℃下放在黑暗处2-3天。将胚胎转移到有选择性的愈伤组织诱导介质(50μg/ml潮霉素和150μg/ml提门叮)。在24℃下将胚胎放在该介质上置于黑暗处2周。将健康的愈伤组织分开并放在新的选择介质中继续培养，在24℃的黑暗环境中再培养2周。紧接着，胚胎放到含细胞分裂素的再生介质中在24℃的光亮环境中培养2周，然后将胚胎转移到含细胞分裂素和生长素的根形成介质中培养三个2周。再将幼体植物转移到土壤混合物中放到潮湿的工作台上培养2周，最后将幼体植物转移到温室。总共有400个使用pVec8-IIb的胚胎和300个使用pVec8-IIa的胚胎用本方法处理，来自于7calli用于IIb变化的18颗植物和来自于14calli用于IIa变化的18颗植物在选择性的介质中存活，表明它们顺利地变化到了该基因结构。不是所有发生了变化具有选择性标记基因的植物都有望综合了淀粉分支酶IIa或淀粉分支酶IIb的抑制基因；用接下来的例子中的方法会很容易地将它们区分。
例5.大麦作物和麦粒转化成带双纽形核糖核酸结构的分析大麦作物或其子代的种子和作物中是否存在输异基因可通过聚合酶链接反应(PCR)技术或南部斑点(Southern blot)杂交分析方法确定。用标准方法从假定发生了转化的作物采取叶子样品用于脱氧核糖核酸的制备。
已转化大麦作物PCR分析-输异基因的测定用于筛分存在的ds-SBEIIa输异基因的正向和反向引子分别是BX17 3’(5’-CAA CCA TGT CCT GAA CCT TCA CC-3’)序列识别编号为5和AR2akpnR(5’-GGT ACC CCA TCT CCT GGT TTT GGG ACA AC-3’)序列识别编号为6。这个引子对从含有ds-淀粉分支酶IIa输异基因的作物中，将对应于输异基因HMWG启动子序列位置的569bp产品，放大到图3中核苷酸2219位置。用于筛分存在的ds-淀粉分支酶IIb输异基因的正向和反向引子分别是BX17 3’(同上)和AR2bkpnR(5’-GGT ACC GTC CAT TTC CCG GTG GTG GCA G-3’)序列识别编号7。这个引子对从含有ds-淀粉分支酶IIb输异基因的系列中，将对应于输异基因HMWG启动子序列位置的571bp产品，放大到图4中核苷酸1768位置。PCR放大在20μl的反应器中进行，反应器中有2.5单位Hotstar Taq，1×缓冲提供的酶含有1.5mM MgCl2，0.125mM每个脱氧核苷酸三磷酸盐(dNTPs)，1μM每个正向和反向引子和100ng脱氧核糖核酸。PCR程序包括开始在95℃下变形5分钟，然后循环36次，在95℃下30秒，在59℃下1分钟和在72℃下2分钟，最后在72℃下5分钟内结束。
对于大麦SBEIIa和SBEIIb结构，均确认为正向转换体(图6)。表2示数据概要。
表2.大麦SBEIIa和SBEIIb输异基因系PCR和南部杂交结果概要

a转化事件编号。具相同编号者为从同一愈伤组织分离得来，可能相同也可能独立。不同编号独立转换体。
(f)弱；(vf)很弱；nr无结果已转化大麦南部斑点杂交分析南部斑点杂交分析是对来自于含输异基因作物和其子代ds-SBEIIa和ds-淀粉分支酶IIb的脱氧核糖核酸进行分析以确认PCR结果。用标准方法从作物制备的脱氧核糖核酸，经EcoR1消化，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，在Hybond N+尼龙膜上留下斑点(Amersham)。从SBEIIa(见图3位置2220到2731)和SBEIIb(见图4位置2019到2391)基因的基因内区3区域产生无线电标记的探针。这些片断是相对的ds-SBEIIa和ds-SBEIIb结构(例3)的一部分，使用Megaprime脱氧核糖核酸标记体系(Amersham PharmaciaBiotech UK Ltd)进行放射性标记并用于杂交。杂交在含25％(v/v)甲酰胺、5×SSC、0.1％SDS、10x Denhardt’s溶液和100μg/ml鲑精脱氧核糖核酸的混合溶液中进行，在42℃反应16小时，然后用2×SSC，0.1％SDS在65℃漂洗3×1小时。该尼龙膜经放射自显影术处理显示正杂交带在对应于作物结构显阳性的小巷中(图7)。杂交中没有检出内成的大麦淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb基因片段，这是因为使用的小麦基因内区3探针导致了序列发散。
PCR和南部杂交分析结果概要见表2。一般而言，PCR和南部杂交结果的相关性很好。由于假阴性的影响，可能会出现差异性，但它可很容易地通过重复试验来解决。所有两种方法包括4ds-SBEIIa南部独立转化事件(IIa4.1，IIa4.2，IIa5和IIa6)和5 ds-SBEIIb独立转化事件(事件编号为IIb2，IIb3，IIb4，IIb5和IIb9)均证实作物输异基因结果为阳性。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法分析大麦胚乳蛋白质在转化作物中，为确定ds-SBEIIa和ds-SBEIIb输异基因对大麦SBEIIa和SBEIIb基因表示的影响，使用非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳和西部斑点分析方法测定发育麦粒中胚乳组织的特定蛋白质表示。因为T1种子(种子来源于T0作物)需分离输异基因，在开花20天后，从每个T0作物选取10颗正在发育的T1麦粒，分析其中每个麦粒胚乳的淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb蛋白质表示。为保存T1作物，从正在发育的麦粒中取出胚胎进行培养，以重新生成T1作物。从母性组织取出的胚乳(0.2g)均匀分散到600μl的50mM Kpi缓冲液中(42mM K2HPO4和8mM KH2PO4)，pH7.5，含有5mM乙二胺四乙酸，20％甘油，5mM二硫苏糖醇和1mM Pefabloc。样品研磨后在13,000g速度下离心分离10分钟，上清液等分后在-80℃冷冻保存，直到使用。蛋白质水平用牛血清白蛋白制成的标准Coomassie试剂测定。从胚乳中萃取的总可溶蛋白质放在那些小巷中，每个里面约放20μg，在8％非变形聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，该凝胶含0.34M Tris-HCl(pH8.8)、丙烯酰胺(8.0％)、过硫酸铵(0.06％)和本甲基乙二胺(0.1％)。电泳之后，按照Morell等人著(1997)规定的步骤，将蛋白质转移到硝化纤维膜，与淀粉分支酶IIa或淀粉分支酶IIb中的特殊抗体发生免疫反应。用于检测SBEIIa的抗体是来源于野兔的3KLH，该抗体可干扰序列识别编号为8的肽AASPGKVLVPDESDDLGC(次序为从SBEIIa的N-端开始)合成，使用时需先稀释到1∶5000。用于检测淀粉分支酶IIb的抗体是R6，该抗体可干扰序列识别编号为9的肽AGGPSGEVMIGC(推测其次序为从淀粉分支酶IIb的N-端开始)合成，使用时需先稀释到1∶6000。使用的第二级抗体是GAR-HRP共轭(1∶3000稀释)，对应的免疫反应带可用AmershamECL-检测系统检定。
来自于含ds-SBEIIa或ds-SBEIIb基因转化作物的正在发育的T1种子中蛋白质表示被分割成1∶2∶1比例，即强带中-弱带无带对应于一些转化系列(例如，见图8和9)。该比例符合期望的均质结合体划分比例(野生型＝无输异基因)均质结合体输异基因纯合子。源于拯救胚胎的T1作物成熟后产生T2种子，它通过多聚酶链接反应筛选后，蛋白质表示分析确认了T1种子输异基因的遗传状况。
这些数据表明双纽形核糖核酸结构在减少大麦胚乳中SBEIIa和SBEIIb的基因表示方面有效。
含ds-SBEIIa输异基因种子中SBEIIb基因的表达和含ds-SBEIIb种子中SBEIIa基因的表达也可通过西部斑点(Western blot)方法分析。出乎意料地，含输异基因种子中的ds-SBEIIa，例如转化事件IIa 4.1，相对于SBEIIb大大降低。图9表明来自于IIa 4.1.8系列的种子中SBEIIb仅有低水平的表达(注意7条小巷中有4条属于很弱的带)。该系列含ds-SBEIIa输异基因，其SBEIIa表达可忽略。然而，含输异基因种子中的ds-SBEIIb没有发现相反的影响。种子中SBEIIa的表达没有变化，而SBEIIb完全被ds-SBEIIb压制(图10)，例如含输异基因系列转化事件IIb4和IIb2。该包含外显子1-3区域被用于ds-SBEIIa和ds-SBEIIb两者的双纽形结构。该区域SBEIIa和SBEIIb序列对齐结果表明仅有约70％同一性。具有100％同一性的最长伸展是在外显子2的21bp区域。尽管由于序列的同源性，SBEIIb的表示仍有可能被ds-SBEIIa结构压制，同时，通过其它机理，SBEIIb活性也可能由于ds-SBEIIa输异基因影响而降低。
SBEIIa和SBEIIb基因表示水平也可通过在信使核糖核酸高水平使用标准技术如北部杂交或RT-PCR方法准确测定，例如，使用来自于非保存区域的探针或能在特定场所与单个基因杂交而不与其它基因反应的引子对，例如在3’未翻译区域。通过比较两个基因序列，这样的区域或场所很容易识别。
例6.麦粒组成与含量分析，包括淀粉麦粒的组成与含量，特别是淀粉，可使用诸如例1描述的标准技术测定。
采用如上所述方法萃取完可溶性蛋白质之后，在光学显微镜下可见到来自个体胚乳样品的淀粉颗粒，该样品来自于含ds-SBEIIa输异基因的正在发育的种子。在检查的五种转换事件中，有三种事件，即IIa 4.1，IIa 4.2和IIa 13，其胚乳中SBEIIa的表达已减少，在这些正在发育的胚乳中，可看到淀粉颗粒形态的重要变化(例如见图11)，但对于存在更低程度的基因钝化的事件IIa 5或IIa 6中，却看不到这种变化。例如，来自于IIa 4.2.5种子的淀粉，由于在蛋白质免疫斑中没有SBEIIa带，与IIa 4.2.3中在蛋白质免疫斑中有SBEIIa强带(表3)的种子正常颗粒相比，发生了严重变形。光学显微照片的观测结果被扫描电子显微照片结果证实，扫描电子显微照片也可用于直接观察淀粉颗粒。为进行该项工作，使净化的淀粉飞溅开来呈金黄色，并在室温下实用15Kv电压进行扫描。已降低SBEIIa表达的种子在扫描电子显微照片下可看到扭曲的不规则形状，例如，IIa 4.2.5种子与IIa 4.2.3种子颗粒变形的比较(图12)。
用显微照片检查时，与含有ds-SBEIIa的作物相比，转化后具有ds-SBEIIb的作物呈现了胚乳淀粉颗粒的正常形态，例如IIb 4.1系列(见表3)。这说明，SBEIIb表达的单独降低不会实质性地改变淀粉颗粒的形态。
表3.含输异基因的大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb系列中T1胚乳组织的淀粉颗粒形态

双折射是指物质沿两个方向折射光的能力，当用光学显微镜观察时，它会在每个淀粉颗粒上产生被称为“马尔他十字”黑色的交叉。双折射是在颗粒内部聚合物组织结构有序程度的指示器(Thomas和Atwell合著，1999)。在偏振光照射下，与来自于IIa 4.2.3的种子(野生型)相比，IIa 4.2.5种子胚乳中的淀粉颗粒(SBEIIa活性已降低)的双折射发生了重大损失。平均而言，IIa 4.2.5种子颗粒中有44.8％没有双折射，和IIa 4.2.3种子的2.2％形成对比(表4)。淀粉颗粒中双折射的丧失与其中直链淀粉含量的增加有较大的相关性。
表4.含有输异基因的大麦ds-SBEIIa系列的T1胚乳中淀粉颗粒双折射

含有输异基因种子的麦粒重量分析，来自于温室中成熟的作物，来自于含ds-SBEIIa的IIa 4.2系列，表明麦粒重量没有发生重大减少，因此，淀粉的生产，甚至是种子中淀粉颗粒高度扭曲(表5)。这与大麦中观测到的麦粒重量减少相反其中所述大麦是SSIIa基因的突变异种，其淀粉产量发生了重大减少(Morell等人著，2003)。这里表明了平均麦粒重量，也表明了野外成熟大麦胚乳中SBEIIa活性降低了的品种产量基本正常。
表5.含输异基因大麦的SBEIIa中IIa4.2系列中T1种子麦粒重量

含输异基因大麦麦粒中直链淀粉和支链淀粉水平种子中淀粉颗粒发生形变在大麦中直链淀粉含量高的情况下曾有报道(Morell等人著，2003)，在低支链淀粉(LAPS)含量玉米中，淀粉中约含90％直链淀粉也曾有发生形变的报道(Sidebottom等人著，1998)。直链淀粉含量可通过粒度排除后，用高性能液相色谱(HPLC)测定，其中液相为90％(w/v)二甲基亚砜(DMSO)；或者如例1所述的使用碘蓝值(碘量法)测定。可根据麦粒重量和直链淀粉含量，计算麦粒中直链淀粉沉积总量，并将含输异基因系列与对照系列中直链淀粉总量进行对比。
淀粉被从T1代、来自含有ds-SBEIIa基因的输异基因作物的T2代(可能是ds-SBEIIa的纯合子)或来自于IIa 4.2.5系列和IIb 4.3.8系列的杂交(含有ds-SBEIIa和ds-SBEIIb)的大麦麦粒中分离出来，隔离ds-SBEIIa，直链淀粉含量可通过应用Morrison和Laignelet(1983)提出的比色法测定。测定来自于如下五个池中的麦粒样品的淀粉中直链淀粉含量。在650nm吸光度下的读数用从标准样品(由土豆直链淀粉和支链淀粉组成，直链淀粉含量范围为0到100％)导出的回归方程换算成直链淀粉含量的百分率，Y＝137.38x-30.361，此处x代表在650nm测得的吸光度，Y代表直链淀粉含量的百分率。
样品池1从含输异基因的IIa 4.1系列中选出的7颗T1种子，其中的淀粉颗粒严重变形。
池2从含输异基因的IIa 4.1系列中选出的6颗T1种子，其中的一些颗粒有变形。
池3从含输异基因的IIa 4.1系列中选出的7颗T1种子，其颗粒具有正常外观。
池4从含输异基因的IIa 4.2.5系列中选出的6颗T2种子，其中的颗粒严重变形。
池5来自于IIa 4.2.5和IIb 4.3.8(ds-SBEIIb含输异基因系列)杂交的5颗F1种子，其中的淀粉颗粒严重变形。
对照大麦SSIIa突变异种M292(Morel等人著，2003)，大麦cv Himalaya和SSIIa小麦突变异种(Yamamori等人著，2000)。
具有降低了的SBEIIa活性的大麦麦粒淀粉，根据变形淀粉颗粒，显示有超过80％直链淀粉。直链淀粉含量与淀粉颗粒变形程度同步增加，对比池1，2和3(表6)。池1，2中的直链淀粉含量高于来自于SSIIa突变异种大麦系列M292的淀粉(表6)。池5中是来自于ds-SBEIIa和ds-SBEIIb含输异基因系列杂交得到的F1麦粒，其直链淀粉含量更高(＞90％)。需要注意的是，用本方法测得的吸光度值可能会受到支链淀粉结构的轻微影响。
表6.降低了SBEIIa活性的含有输异基因大麦系麦粒中直链淀粉含量


这意味着这些麦粒淀粉中支链淀粉含量有相当程度的减少，从野生型中的约75％到低于20％，或甚至低于10％，因为谷类淀粉几乎完全由直链淀粉和支链淀粉组成。
例7.大麦SBEIIA基因突变导致没有SBEIIa表达的大麦淀粉SBEIIA基因突变可通过γ射线辐射或化学诱变实现，例如乙基甲基磺酸盐(ethyl methane sulfonate，EMS)。对于γ射线诱导的突变，种子的照射剂量为由60Co源产生的20-50kR，(Zikiryaeva和Kasimov合著，1972)。EMS诱变通过用EMS(0.03％，v/v)处理种子实现(Mullins等人著，1999)。突变异种的麦粒基于增加的直链淀粉含量和变化的淀粉麦粒形态进行识别，并用上述方法证实。SBEIIa的突变异种能够重新诱变，子代除了SBEIIa外，还筛选有损失的SBEIIb，或者SBEIIa突变异种可用SBEIIb突变异种杂交，以合并突变产生不含输异基因的大麦品种，该品种的胚乳中实质性缺乏SBEII活性。
例8.SBEI基因克隆，构造抑制SBEI在大麦中的表达SBEI基因的隔离可通过将探针杂交到大麦互补脱氧核糖核酸或染色体组库实现，或通过多聚酶链接反应(PCR)方法实现。PCR引子设计可基于小麦基因的同源性，例如基于基因银行AF076679阐述的脱氧核糖核酸序列。使用的引子可以是序列识别编号为10的5’ACGAAGATGCTCTGCCTCAC 3’和序列识别编号为11的5’GTCCAACATCATAGCCATTT 3’，它应能产生约1015bp的PCR产品。
SBEI基因序列用于构造抑制基因结构，通过与上述用于SBEIIa和SBEIIb的相似形式引入大麦中。
例9.将SBEIIA突变异种与其它淀粉合成突变异种结合到一起含输异基因作物的ds-SBEIIa与减少了活性的SBEIIa与大麦系列M292(SSIIa突变异种)和高直链淀粉Glacier品种(HAG)杂交。确立了以下杂交1)IIa 4.1.10系列x HAG2)IIa 4.1.16系列x HAG3)IIa 4.1.20系列x M2924)IIa 4.1.19系列x HAGF1作物可自我繁殖，突变的系列纯合可通过遗传和分子分析识别。将ds-SBEIIa输异基因与SSIIa突变结合可生产非常高的直链淀粉含量的淀粉，它还含有高的β-葡萄糖含量。将ds-SBEIIa输异基因与HAG突变结合可进一步改良淀粉组分，除了直链淀粉含量高，功能性也会增强。
例10.田间种植的大麦特性测定了多个田间种植的大麦品种的去壳麦粒重量和β-葡萄糖含量，包括M292和M342系列(ssIIa突变异种，大致含60-65％直链淀粉)。由结果(表7)可知M292和M342麦粒的去壳麦粒尺寸变小了，但β-葡萄糖含量相对于野生型品种(3.0-6.0％β-葡萄糖)有所增加。田间种植的在该条件下长成的野生型麦粒平均重量范围是35-45g/1000去壳麦粒，野生型品种麦粒β-葡萄糖含量的变化范围是3-6％。
表7.田间种植的大麦的去壳麦粒重量和β-葡萄糖水平


a给出了重复值，用于在现场分别出图。
熟知本技术领域的熟练人员会很清楚，在不违反本发明范围的情况下，这些方法可能会进行修改和变化。
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序列表<110>联邦科技产业研究组织<120>改变了淀粉分支酶活性的大麦及增加了直链淀粉含量的淀粉和含淀粉产品<160>11<210>1<211>2554<212>DNA<213>大麦<220>
<223>SSBEIIa cDNA<400>1ggcgagatgg cggaagtaaa catgacaggg ggggctgcag aaaaacttga atcttcagaa 60ccgactcagg gtattgcgga aacaatcact gatggtgtaa ccaaaggagt taaagaacta 120gtcgttgggg agaaaccgca agttgtccca aaaccaggag atgggcaaaa aatatacgag 180attgacccaa cgctgaaaga ttttcggagc catcttgact accgatacag cgaatacaag 240agaattcgtg ctgctattga ccaacatgaa ggtggattgg aagttttttc tcgtggttat 300gaaaagcttg gatttacccg cagtgctaaa ggtatcactt accgagaatg ggctcctgga 360gcgcattctg cagcattagt aggtgacttc aacaattgga acccaaatgc agatactatg 420accagagatg attatggtgt ttgggagatt ttcctcccta acaatgctga tggatcccct 480gctattcctc atggctcacg tgtaaagata cggatggata ctccatctgg tgtgaaggat 540tcaatttctg cttggatcaa gttctctgtg caggctccag gtgaaatacc attcaatggc 600atatattatg atccacctga agaggagaag tatgtcttcc aacatcctca acctaaacga 660ccagagtcac taaggatata tgaatcacac attggaatga gcagcccgga accgaagata 720aattcatatg ctaattttag ggatgaggtg ctgccaagaa ttaaaaggct tggatacaat 780gcagtgcaga taatggcaat ccaggagcat tcatactatg cgagctttgg gtaccatgtt 840actaattttt ttgcaccaag tagccgtttt ggaactccag aggacttaaa atccttgatc 900gatagagcac atgagcttgg tttgcttgtt cttatggata ttgttcatag tcattcgtca 960aataataccc ttgacggttt gaatggtttc gatggcactg atacacatta cttccacggt 1020ggtccacgtg gccatcattg gatgtgggat tctcgtctgt tcaactatgg gagttgggaa 1080gtattaagat tcttactgtc aaacgcgaga tggtggcttg aagaatataa gtttgatgga 1140tttcgatttg atggggtgac ttccatgatg tatactcacc atggattaca aatgacattt 1200actgggaact atggcgagta ttttggattc gccactgatg ttgatgcggt ggtttactta 1260atgctggtca acgatctaat tcatggactt tatccggatg ctgtatccat tggtgaagat 1320gtcagcggaa tgcctacatt ttgcatccct gtcccagatg gtggtgttgg ttttgactat 1380cgcctgcata tggctgtagc agataaatgg attgaactcc tcaagcaaag tgacgaatct 1440tggaaaatgg gcgatattgt gcacacccta acaaatagaa ggtggcttga gaagtgtgtc 1500acttatgcag aaagtcatga tcaagcacta gttggtgaca agactattgc attctggttg 1560atggataagg atatgtatga tttcatggct ctggatagac cttcaacccc tcgcattgat 1620cgtggcatag cattacataa aatgatcagg cttgtcacca tgggtttagg tggcgaaggc 1680tatcttaatt tcatgggaaa tgagtttggg catcctgaat ggatagattt tccaagaggt 1740ccgcaaactc ttccaaccgg caaagttctc cctggaaata acaatagtta tgataaatgc 1800cgccgtagat ttgatcttgg agatgcagat tttcttagat atcgtggtat gcaagagttc 1860gatcaggcaa tgcagcatct tgaggaaaaa tatgggttta tgacatctga gcaccagtat 1920
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<223>SSBEIIb cDNA<400>2ggcgagatgg cggcgccggc gttcgcagtt tccgcggcgg ggatcgcccg gccatcggct 60cgtcgatcca gcggggcaga gccgagatcg ctgctcttcg gccgcaacaa gggcacccgt 120ttcccccgtg ccgtcggcgt cggaggttct gggtggcgcg tggtcatgcg cgcgggcggc 180ccgtccgggg aggtgatgat ccctgacggc ggtagtggcg gaagcggaac accgccttcc 240atcgagggtt ccgttcagtt cgagtctgat gatctggagg ttccattcat cgacgatgaa 300ccaagcctgc acgatggagg tgaagatact attcggtctt cagagacata tcaggttact 360gaagaaattg atgctgaagg cgtgagcaga atggacaaag aatcatccac ggtgaagaaa 420atacgcattg tgccacaacc cggaaatgga cagcaaatat acgacattga cccaatgctc 480cgagacttta agtaccatct tgagtatcga tacagcctat ataggagaat acgttcagac 540attgatgaat acgatggagg catggatgta ttttcccgcg gctacgagaa gtttggattt 600gttcgcagcg ctgaaggtat cacttaccga gaatgggctc ctggagcaga ttctgcagca 660ttagttggcg acttcaacaa ttgggatcca actgcagacc atatgagcaa aaatgacttg 720ggtatttggg agatttttct gccaaacaat gcagatggtt cgccgccaat tcctcatggc 780tcacgggtga aggtgcggat ggatactcca tctgggacaa aggattcaat tcctgcttgg 840atcaagtact ccgtgcagac tccaggagat ataccataca atggaatata ttatgaccct 900cctgaagagg agaagtatgt attcaagcat cctcaaccta aacgaccaaa atcattgcgg 960atatatgaaa cacatgttgg catgagtagc ccggaaccaa agatcaacac atatgcaaac 1020ttcagagatg aggtgcttcc aagaattaaa agacttggat acaatgcagt tcaaataatg 1080gcaatccaag agcattcata ctatggaagc tttgggtacc atgttaccaa tttctttgca 1140ccaagtagcc gttttgggtc cccagaagat ttaaaatcct tgattgatag agctcacgag 1200cttggtttgc ttgtcctgat ggatgttgtt cacagtcacg catcaagtaa taccttggac 1260ggtttgaatg gttttgatgg cacggataca cattactttc atggcggctc acggggccat 1320cactggatgt gggattctcg tgtgttcaac tacgggaata aggaagttat aaggtttcta 1380ctttccaatg caagatggtg gctagaggaa tataagttcg atggtttccg attcgacggc 1440gcgacctcca tgatgtatac ccaccatgga ttacaagtaa cctttacagg gagctaccat 1500
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<211>6550<212>DNA<213>节节麦<220>
<223>局部SSBEIIb基因<400>4aagctttgta gccttgcacg ggctccccaa caaactgcct cactcgattg tcaaaaaagt 60aaaaatgatt gtagaaaaaa aaactgactc actcgtcact accctaccgt cctacatgac 120acctggccgc aagacgacgc cgtcctcctg ccgcgcgcgt ccgcgatcac accaccgcaa 180aaaccaaaac ctcttcgccg gtgcgtccca cgctaccatc catgcagccg tccgcccgcg 240cgcgcgttgc ccgcaccacc cgctggcggc caccacgccg ccactctcgc gtgaaggctc 300cgtccgcttc ctcctagttc cactctctct ccgtgctagc agtatatagc atccgccctc 360cgccccctcc caatcttaga acacccctcc ctttgcctcc tcatttcgct cgcgtgggtt 420taagcaggag acgaggcggg gtcagttggg cagttaggtt ggatccgatc cggctgcggc 480ggcggcgacg ggatggctgc gccggcattc gcagtttccg cggcggggct ggcccggccg 540tcggctcctc gatccggcgg ggcagagcgg agggggcgcg gggtggagct gcagtcgcca 600tcgctgctct tcggccgcaa caagggcacc cgttcacccc gtaattattt gcgccacctt 660tctcactcac attctctcgt gtattctgtc gtgctcgccc ttcgccgacg acgcgtgccg 720attccgtatc gggctgcggt gttcagcgat cttacgtcgg ttccctcctg gtgtggtgat 780gtctgtaggt gccgtcggcg tcggaggttc tggatggcgc gtggtcatgc gcgcgggggg 840gccgtccggg gaggtgatga tccctgacgg cggtagtggc ggaacaccgc cttccatcga 900cggtcccgtt cagttcgatt ctgatgatct gaaggtagtt ttttttttgc atcgatctga 960aggtacttga catatactac tgtattaccc tgagtaaata ctgccaccat atttttatgg 1020ttcgcttgaa atacctgttt acttgctacg gttttcactt tcattgagac gtcggacgaa 1080attcactgaa ttcctataat ttggtagaca ccgaaatata tactactcct tccgtcccat 1140aatataagag cgtttttggc accttatatt atagggcgga gggagtacct tttaggtcaa 1200aatattgtgg tagtttcaat tgtatacaag aattcaaata ttttttttaa aaaaaaatca 1260actaattggt tgagtttcaa gtgaagcgtt ttggtccttt ggctgagatg taaaccgaaa 1320tcactgaaat tcatagtagc cgaaacttta atagaactga aactcaaaat ctgctatccg 1380gcgaaattct aaagatttgc ttatttcaca cgtaggttgc agtacaccct ctttctaatt 1440tattggggaa ggggtattat tatcttgtta gtacctgcct gcatgacaat tgaaatctaa 1500gacaaaacac catatgcgag gcctacacac ggtaggttgg tttacaacta tgtgtgccac 1560agttcgtctg aactttttgt ccttcacatc gtgttaggtt ccattcattg atgatgaaac 1620aagcctacag gatggaggtg aagatagtat ttggtcttca gagacaaatc aggttagtga 1680agaaattgat gctgaagaca cgagcagaat ggacaaagaa tcatctacga gggagaaatt 1740acgcattctg ccaccaccgg gaaatggaca gcaaatatac gagattgacc caacgctccg 1800agactttaag taccatcttg agtatcggta tgcttcgctt ctattgtgtg cactttaaaa 1860acaatttaca gtctttgata agatgtgaat ggctgcttgc tgtgacacga aactcttgaa 1920gttcgtagtc actcttgtgt gttcatggtt ctgaggtaac atggtaaccg aacaaaaata 1980ggaaagtggc aagcactgca atgtgagcta ctgataacca cccattgtaa ttgggtacac 2040tgattaatat atatgtcttc atgggctcta ttttttttca atatctatgc caattgaaca 2100acaatgcttt gtggacgggt gttcttttac cctcttcttc tatcaataga tgatatgcat 2160actcatgcgt atcctacaaa aaattgaaca acaatgccac tttcccccgt gttgcttttg 2220taaggatgaa acacatatgt ccagatcaaa ctatactagc agtctaactg tgccttaatg 2280
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<400>11gtccaacatc atagccattt 20
权利要求
1.一种来源于大麦作物的麦粒，其特征在于所述大麦作物胚乳中具有已降低的淀粉分支酶IIa活性，所述麦粒淀粉中直链淀粉相对含量不低于40％(w/w)。
2.根据权利要求1所述的麦粒，其特征在于所述的大麦作物胚乳中还具有已降低的淀粉分支酶IIb活性。
3.根据权利要求1所述的麦粒，其特征在于所述的大麦作物中包含表现为淀粉分支酶Iia的抑制剂的外源性核酸。
4.根据权利要求3所述的麦粒，其特征在于所述抑制剂引起淀粉分支酶IIa酶表达水平降低。
5.根据权利要求1所述的麦粒，其特征在于所述麦粒不收缩。
6.根据权利要求5所述的麦粒，其特征在于所述麦粒的淀粉含量不低于25％(w/w)。
7.根据权利要求6所述的麦粒，其特征在于所述麦粒的淀粉含量不低于35％(w/w)。
8.根据权利要求7所述的麦粒，其特张在于所述麦粒的淀粉含量约为45-50％(w/w)。
9.根据权利要求5所述的麦粒，其特征在于所述麦粒的平均长度对厚度的比率低于约3.5。
10.根据权利要求5所述的麦粒，其特征在于所述麦粒的平均重量不低于约36mg。
11.根据权利要求1所述的麦粒，其特征在于淀粉的相对的直链淀粉含量不低于60％(w/w)。
12.根据权利要求11所述的麦粒，其特征在于淀粉的相对的直链淀粉含量不低于70％(w/w)。
13.根据权利要求12所述的麦粒，其特征在于淀粉的相对的直链淀粉含量不低于80％(w/w)。
14.根据权利要求1所述的麦粒，其特征在于所述麦粒被碾碎、研磨、圆化、碾轧、磨成粗谷粉、碾轧成粗碎谷物或保持整粒。
15.一种大麦麦粒，其特征在于包含具有相对直链淀粉含量不低于75％(w/w)的淀粉。
16.根据权利要求15所述的大麦麦粒，其特征在于所述直链淀粉含量用碘量法测定。
17.根据权利要求15所述的大麦麦粒，其特张在于所述麦粒中含有3-6％(w/w)β-葡萄糖。
18.根据权利要求15所述的大麦麦粒，其特征在于所述麦粒中含有6-8％(w/w)β-葡萄糖。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的麦粒的面粉或粗面粉。
20.一种来自于大麦作物麦粒的淀粉，其特征在于所述大麦作物胚乳中具有已降低的淀粉分支酶IIa的活性水平，所述淀粉未被改良，直链淀粉的相对含量不低于40％(w/w)。
21.根据权利要求20所述的淀粉，其特征在于所述大麦作物胚乳中还具有已降低的淀粉分支酶IIb活性水平。
22.根据权利要求20所述的淀粉，其特征在于所述的大麦作物中包含表现为淀粉分支酶Iia的抑制剂的外源性核酸。
23.根据权利要求22所述的淀粉，其特征在于所述抑制剂引起淀粉分支酶IIa酶表达水平降低。
24.根据权利要求20所述的淀粉，其特征在于所述淀粉中直链淀粉相对的含量不低于60％(w/w)。
25.根据权利要求24所述的淀粉，其特征在于所述淀粉中直链淀粉的相对含量不低于70％(w/w)。
26.根据权利要求25所述的淀粉，其特征在于所述淀粉中直链淀粉的相对含量不低于80％(w/w)。
27.一种合成物，其特征在于包括根据权利要求20到26中任一项所述的淀粉、以及另一种食物成分或水。
28.一种合成物，其特征在于包括大麦胚乳的淀粉颗粒、另一种食物成分或水，其中淀粉颗粒中的淀粉含有不低于75％(w/w)的直链淀粉。
29.一种具有降低的淀粉分支酶IIa酶活性水平的大麦作物，其特征在于所述大麦作物麦粒中的淀粉中直链淀粉的相对含量不低于40％(w/w)。
30.根据权利要求29所述的大麦作物，其特征在于所述大麦作物胚乳中具有降低的的淀粉分支酶IIb酶活性水平。
31.根据权利要求29所述的大麦作物，其特征在于包含表现为淀粉分支酶IIa的抑制剂的外源性核酸。
32.根据权利要求31所述的大麦作物，其特征在于所述抑制剂引起淀粉分支酶IIa酶表达水平降低。
33.根据权利要求29所述的大麦作物，其特征在于所述大麦作物的麦粒不收缩。
34.根据权利要求29所述的大麦作物，其特征在于所述大麦作物的麦粒淀粉含量不低于25％(w/w)。
35.根据权利要求34所述的大麦作物，其特征在于所述大麦作物的麦粒淀粉含量不低于35％(w/w)。
36.根据权利要求35所述的大麦作物，其特征在于所述大麦作物的麦粒淀粉含量约为45-50％(w/w)。
37.根据权利要求29所述的大麦作物，其特征在于所述大麦作物的麦粒平均长度对厚度的比率低于约3.5。
38.根据权利要求29所述的大麦作物，其特征在于所述大麦作物的麦粒平均重量不低于约36mg。
39.根据权利要求29所述的大麦作物，其特征在于所述大麦作物的淀粉中直链淀粉的相对含量不低于60％(w/w)。
40.根据权利要求39所述的大麦作物，其特征在于所述大麦作物的淀粉的直链淀粉相对含量不低于70％(w/w)。
41.根据权利要求40所述的大麦作物，其特征在于所述大麦作物的淀粉的直链淀粉的相对含量不低于80％(w/w)。
42.一种可生成淀粉至少含有40％直链淀粉的麦粒的大麦作物的生产方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)向父系大麦作物或种子中引入遗传变异；和(2)识别步骤(1)中父系大麦作物或种子产生的子代作物或种子，其中子代作物或种子的胚乳中具有降低的淀粉分支酶IIa活性。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于所述步骤(1)引入遗传变异包括引入表现为淀粉分支酶IIa的抑制剂的外源核酸。
44.根据权利要求42所述的方法，其特征在于所述步骤(1)的方法包括作为作物来源的父系大麦作物或种子的突变。
45.一种生产胚乳中具有降低的淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb酶活性水平的大麦作物的方法，其特征在于包括(1)诱变具有降低的淀粉分支酶IIa活性水平的作物的种子；或(2)诱变具有降低的淀粉分支酶IIb活性水平的作物的种子；或(3)将具有降低的淀粉分支酶IIa活性水平的作物与具有降低的淀粉分支酶IIb活性水平的作物杂交；以及识别具有降低的淀粉分支酶IIa和降低的淀粉分支酶IIb活性的大麦作物。
46.一种大麦淀粉颗粒，其特征在于，含有降低的淀粉分支酶IIa蛋白质水平，含有的淀粉中直链淀粉含量不低于40％(w/w)。
全文摘要
大麦中淀粉分支酶IIa活性水平降低，将导致其生产的麦粒中有相对较高的直链淀粉含量。另外，大麦中还可包含降低的淀粉分支酶IIb活性水平。本发明的大麦麦粒可能具有不收缩的表型，尽管其支链淀粉合成途径发生了损害。
文档编号C12N15/09GK1652681SQ03810456
公开日2005年8月10日 申请日期2003年5月9日 优先权日2002年5月9日
发明者阿麦德·里贾纳, 马太·肯尼迪·莫维尔, 萨德奎·拉曼 申请人:联邦科技产业研究组织