专利名称：玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程和遗传育种领域。
背景技术：
玉米淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，其中直链淀粉约占24％，直链淀粉约占76％。玉米淀粉是重要工业原料，用途广泛，涉及到食品、医疗、纺织、造纸、包装、石油、环保、光纤、电子芯片等行业。
淀粉在不同领域中的应用取决于其分子结构。淀粉分子结构的重要参数包括直链淀粉和支链淀粉的比例；直链淀粉的聚合度；支链淀粉分支链长及分布等等，这些参数影响淀粉加工的理化和功能特性。其中，直/支比是淀粉分子结构最重要的分子结构参数，一般普通玉米淀粉直/支比为1∶3，直/支比大于1的是高直链淀粉。高直链淀粉具有更快的凝胶化作用，凝胶强度高，作为食品添加剂在改善食品的质地和结构方面具有独特的效果。许多类型的胶卷中使用高直链淀粉，是因为其具有独特的透明性、柔韧性、拉伸强度及防水性。目前人们对环保日益关注，高直链淀粉生产的可再生、可降解塑料膜可以减少工业废气及减弱温室效应气体的释放，是解决目前严重的“白色污染”的有效途径，正日益引起人们的兴趣。支链淀粉具有更好的黏性，可增加膨化食品的体积，作为食品添加剂具有不同于直链淀粉的效果，在粘合剂领域具有较多的应用。此外，那些介于直链淀粉和支链淀粉之间的中间成分，其淀粉分支链的长度和分支程度等物理参数有所不同，可能会有不同的理化性质，因而有着不同的用途。当天然淀粉满足不了某一功能需求时，就需要对淀粉实行化学改性，而这些加工过程会增加耗费、加重环境污染。另一产生具有不同理化特性淀粉的途径就是从遗传上改变淀粉的代谢途径。随着淀粉合成过程中相关酶基因的克隆以及各种植物遗传转化体系的相继建立，使利用基因工程调控淀粉合成过程，改良淀粉品质成为可能，为创造新型淀粉提供有效的手段。
玉米籽粒直链淀粉和支链淀粉的合成过程受到一系列酶的调控。淀粉分支酶(SBE)是淀粉生物合成过程中的一个关键酶，它催化葡萄糖以α-(1，6)键连接，形成分支结构。玉米SBE有三种同工酶SBE I、SBE IIb主要在胚乳中存在，SBE IIa主要在叶片中存在，也在胚乳中存在，它们共同参与支链淀粉的合成。虽然SBE IIa和SBE IIb分子量接近80KD，氨基酸组成及酶切图谱也相似，但因SBE IIa含有49个氨基酸的N端延伸和基本序列区的差异而与SBE IIb有所差异。正是结构的差异使它们在支链淀粉合成中起不同作用。SBE I作用的底物是直链淀粉，它能使较长的糖苷链转移到直链淀粉上，但转移到支链淀粉上的能力很弱。SBE I在直链上产生分支的效率是在支链上产生分支的十倍以上；与之相反，SBE II作用的底物是支链淀粉，能使较短的糖苷键转移到支链淀粉上，而且SBE IIa的活性大大高于SBE IIb，其编码基因的突变(玉米ae突变体)可使玉米胚乳中直链淀粉的含量达到50％。玉米sbe IIa基因在不同遗传背景下对直链淀粉的含量的效应明显不同，可以使直链淀粉的含量达到20％到70％。
玉米直链淀粉和支链淀粉的含量比例影响着淀粉粒的结构和特点，进而影响着淀粉的质量、功能和应用领域，改变淀粉结构有着很多潜在的应用价值。高支链、低直链或低支链、高直链的淀粉都有着广泛的工业用途。利用活体方法产生的新淀粉类型，收割后无需化学或酶法处理，如淀粉分支点的去除、糖链的水解及化学修饰。因此，在新品种选育时，这已成为育种工作者考虑的重要方面。
RNA干扰作用(RNA interference，RNAi)是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引起与其同源的mRNA特异性降解，因而抑制其相应基因表达的过程，是基因转录后沉默作用(posttranscriptional gene silencing，PTGS)的重要机制之一。
RNA干扰的主要过程可分为两个阶段第一阶段是起始阶段，由于RNA病毒感染，转座子转录和外源导入基因表达等原因，生物体细胞内出现双链dsRNA，dsRNA在一种具有RNaseIII活性的dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNAspecific endonuclease，Dicer)作用下，切割成21-25nt的小干涉RNA(smallinterfering RNA，或short interfering RNAs，siRNA)。近来研究发现，siRNA是RNAi赖以发生的重要中间效应分子。它具有特殊性结构即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基。此外，每条单链的3′端均有2-3个突出的非配对的碱基。
第二阶段是效应阶段，目前认为该阶段存在两种假说模式。一种假说模式认为siRNA作为向导序列，与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencingcomplex，RISC)的无活性前体结合，在ATP参与下siRNA双链结构解旋诱导形成有活性的RISC，活性RISC随即与同源性靶向mRNA结合，在与siRNA反义链配对区域的中部切断同源性靶向mRNA，使其降解，从而达到干扰基因表达作用；另一种假说模式认为随机降解性多聚酶链式反应(random degradativePCR)，即siRNA作为针对靶向mRNA特殊引物，在RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)的作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA，然后在Dicer酶的作用下被降解形成新的siRNA，新的siRNA又进入上述过程，反复循环，从而使靶mRNA渐进性减少，呈现基因沉默现象。RdRp一般只对所表达的靶mRNA发挥作用，这种在RNAi过程中对靶mRNA的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能，每个细胞只需要少量dsRNA即能完成关闭相应基因表达；可见RNAi过程具有生物催化反应的基本动力学特征。
随着多国科学家参与的人类全基因组计划进入尾声，一个以揭示蛋白质结构与功能为重点的后基因组时代业已拉开序幕。由于RNAi可以使特异基因mRNA发生降解，从而获得特定蛋白功能丧失或降低的突变株。因此，RNAi作为一种新的、强有力的研究工具，在功能基因组学领域呈现出巨大的应用前景，使得RNAi成为当今研究领域最引人注意的话题之一。相对于基因敲除技术(knockout)，RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点，被称为基因抑制(knock down)技术，是研究特定基因功能的有效方法，在某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基因敲除技术。总之，RNAi是一种有效、快捷和成本相对低廉的基因功能研究手段，与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合，在基因组学功能研究中将起重要作用，其应用前景不亚于PCR技术。
淀粉合成途径的改造是创造新特性、新应用淀粉的重要手段。由于RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术提供了直接有效的人为控制基因表达的方法，所以，应用RNA干扰技术来抑制淀粉合成的关键酶基因的表达，进而控制淀粉的合成途径，实现应用基因工程手段改良淀粉品质，以满足工业生产和人民生活的各种不同需求，这是常规育种所无法达到的，显示出在植物品种改良中具有广阔的应用前景。中科院上海植物生理生态研究所已利用基因工程技术将反义Wx基因导入3个高直链淀粉含量的籼型杂交稻重点亲本，部分转基因水稻T1和T2代种子中的直链淀粉含量已有不同程度的下降，最低的已下降至7％左右，与未转化对照相比下降了18.39％。
我国没有高直链淀粉玉米品种，也没有高直链淀粉玉米的种植和淀粉生产。运用基因工程技术抑制某一特定SBE同工酶的表达，能够提高玉米直链淀粉的含量，生产出消费者喜爱的品种，可获得巨大的经济价值和社会效益。
发明内容
本发明提供一种玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体，通过利用转基因技术封闭玉米淀粉分支酶基因sbe IIa的表达，降低玉米淀粉分支酶的活性，提高玉米直链淀粉含量，培育高直链淀粉玉米。本发明采取的技术方案是包括下列步骤一、克隆玉米淀粉分支酶基因sbe IIa片段(1)淀粉分支酶基因片段的PCR扩增RNA的提取使用TRIzoL试剂盒(普利莱基因技术有限公司)从玉米叶片及子粒提取总RNA，然后进行反转录成cDNA。
反转录反应体系在20μL的反应体系中，总RNA9.5μL，5×缓冲液4.0μL，d NTP(10mM)2.0μL，RNA酶抑制剂0.5μL，引物(100pmol/μL)2.0μL，反转录酶2.0μL。(上述试剂均购于TaKaRa公司)引物设计根据GenBank发表的序列(U65948)，采用DNAMAN软件设计两对引物，利用PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)片段(562bp)。引物序列如下5′CGTGT AAAGA TACGG ATGGA C3′5′ATAGG CGAGA ATCCC ACAT 3′PCR反应体系在50μL的反应体系中，10×缓冲液5.0μL(TaKaRa公司)，dNTP4.0μL(TaKaRa公司)，引物各50pmol/L(赛百盛生物有限公司)，模板0.1μg，Taq酶0.3μL(TaKaRa公司)，以ddH2O补足50μL。
PCR扩增条件94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，73℃延伸90s，35个循环，最后72℃延伸10min。
(2)淀粉分支酶基因片段的克隆、筛选及鉴定扩增产物的电泳鉴定PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳。得到约560bp大小，特异性强，单一的扩增带。
目的DNA片段的回收按DNA片段凝胶回收试剂盒(V-Gene公司)经改良的方法进行。回收的DNA片段，置-20℃冰箱保存。
目的DNA片段与克隆载体的连接回收的PCR产物，其中含有反义或正义的目的片段，与pMD18-T-vector以3∶1的浓度比例，加缓冲液4.0μL混匀，16℃反应过夜，得到重组载体含有反义目的基因片段的pW1、和含有正义目的基因片段的pW2。(pMD18-T-vector购于TaKaRa公司)。
重组载体的转化按Maniatis的方法制备感受态细胞，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，冰浴30min，同时做对照管。以42℃热激90s，冰上放置2min。每管加入800μL LB液体培养基，37℃温育45min，140rpm/min。涂在含氨苄青霉素(100μg/mL)、×-gal(北京鼎国生物技术有限责任公司)、IPTG(北京鼎国生物技术有限责任公司)的LB培养基平板上选择培养过夜(37℃)。挑取白斑用碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶酶切鉴定，得到重组克隆。
(3)淀粉分支酶基因片段的序列分析由大连宝生物公司完成，核酸序列分析用DNASIS软件，562bp的序列如SEQ ID NO.1所述二、克隆淀粉分支酶基因的种子特异启动子种子特异启动子TSPsbe(934bp)序列如SEQ ID NO.2所述引物序列如下Primer15′TCT CTC CAA CCC CTT CAA TC 3′；Primer25′GAC CGC AAG AGC GAA ATC 3′；由赛百盛生物有限公司合成，该启动子由本实验室克隆保存。
三、克隆绿色荧光蛋白基因从改造的p1300质粒(p1300-GFP)上直接扩增，并得到克隆载体(pW3)。质粒p1300-GFP由本实验室保存。
绿色荧光蛋白序列如SEQ ID NO.3所述引物序列如下
Primer15′ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC3Primer25′TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA3′由赛百盛生物有限公司合成。
四、构建siRNA表达载体(1)目的片段与表达载体的反向连接将含有反义目的基因片段的克隆质粒(pW1)和表达质粒pCAMBIA1301分别用Sal I、Sac I进行双酶切，电泳分离酶切片段，分别回收目的基因片段和载体大片段，然后以3∶1的浓度比例，加连接液4.0μL混匀，16℃反应过夜，得到重组质粒(pAsbe IIa)；(2)重组质粒pAsbe IIa与正向目的片段的连接将上述重组质粒经Sac I、Xho I酶切，分离载体大片段；克隆质粒(pW2)经Sac I和Xho I酶切，分离目的基因片段，用T4DNA连接酶连接到重组质粒(pAsbe IIa)上，得反义+正义片段的表达质粒pA-Ssbe IIa。
(3)种子特异启动子与表达载体pA-Ssbe IIa的连接将pCAMBIA1301质粒用Sph I、Sal I酶切，插入种子特异启动子，得到pTSPsbe IIa。
(4)绿色荧光蛋白GFP与GUS基因的替换将克隆的绿色荧光蛋白基因的重组质粒(pW3)用Bgl II和BstE II进行双酶切，与同样双酶切的pTSPsbe IIa载体进行连接，得到最终的表达质粒pTSPsbe IIa-GFP。该表达载体就是构建的玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表达载体。
(5)表达载体的转化将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选出3个重组克隆。通过限制性内切酶Sac I和Sal I酶切鉴定，得到一条约560bp的特异带，电泳图谱表明目的片段确实插入到植物表达载体pCAMBIA1301的种子特异启动子下游，成功地构建了siRNA的表达载体pTSPsbe IIa-GFP。
本发明玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体在培育高直链淀粉玉米自交系中的应用。
本发明构建的玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表达载体充分利用了表达载体pCAMBIA1301上的多克隆位点，将玉米淀粉分支酶种子特异启动子基因插入Sph I、Sal I两个酶切位点之间，玉米淀粉分支酶基因反义片段插入上述启动子下游Sal I、Sac I之间，在切除潮霉素抗生素抗性基因后，SBE IIa基因的正义片段被插入到Sac I、Xho I之间，最后对pTSPsbe IIa进行Bgl II和BstE II双酶切，用绿色荧光蛋白基因(GFP)替换GUS基因。本载体在分子生物学领域有较高的可操作性、实用性其中可利用的酶切位点有Sph I、Sal I、Sac I、Xho I、Bgl II和BstE II，可以插入四个目的基因片段，可供一般的载体构建使用。去除潮霉素抗性基因，使用绿色荧光蛋白基因进行筛选，解决食品安全性问题。
本发明创造的优点和有益的效果是，构建了玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表达载体。利用该表达载体，可以对玉米淀粉分支酶基因功能进行有效的鉴定，也可以通过转基因技术高效封闭玉米淀粉分支酶基因sbe IIa的表达，降低玉米淀粉分支酶的活性，提高玉米直链淀粉含量，培育高直链淀粉玉米或创造新的高直链玉米淀粉种质资源。
附图是构建后的pTSPsbe IIa-GFP质粒简图。
具体实施例方式
一种玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体，利用表达载体pCAMBIA1301上的多克隆位点，将玉米淀粉分支酶种子特异启动子基因插入Sph I、Sal I两个酶切位点之间，玉米淀粉分支酶基因SBE IIa反义片段插入上述启动子下游Sal I、Sac I之间，在切除潮霉素抗生素抗性基因后，玉米淀粉分支酶基因SBE IIa的正义片段被插入到Sac I、Xho I之间，在Bgl II和BstE II两个酶切位点之间插入绿色荧光蛋白基因GFP。
玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体的构建方法一、克隆玉米淀粉分支酶基因sbe IIa片段(1)淀粉分支酶基因片段的PCR扩增RNA的提取使用TRIzoL试剂盒(普利莱基因技术有限公司)从玉米叶片及子粒提取总RNA，然后进行反转录成cDNA。
反转录反应体系在20μL的反应体系中，总RNA9.5μL，5×缓冲液4.0μL，d NTP(10mM)2.0μL，RNA酶抑制剂0.5μL，引物(100pmol/μL)2.0μL，反转录酶2.0μL。(上述试剂均购于TaKaRa公司)引物设计根据GenBank发表的序列(U65948)，采用DNAMAN软件设计两对引物，利用PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)片段(562bp)。引物序列如下5′CGTGT AAAGA TACGG ATGGA C3′5′ATAGG CGAGA ATCCC ACAT 3′PCR反应体系在50μL的反应体系中，10×缓冲液5.0μL(TaKaRa公司)，dNTP4.0μL(TaKaRa公司)，引物各50pmol/L(赛百盛生物有限公司)，模板0.1μg，Taq酶0.3μL(TaKaRa公司)，以ddH2O补足50μL。
PCR扩增条件94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，73℃延伸90s，35个循环，最后72℃延伸10min。
(2)淀粉分支酶基因片段的克隆、筛选及鉴定扩增产物的电泳鉴定PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳。得到约560bp大小，特异性强，单一的扩增带。
目的DNA片段的回收按DNA片段凝胶回收试剂盒(V-Gene公司)经改良的方法进行。回收的DNA片段，置-20℃冰箱保存。
目的DNA片段与克隆载体的连接回收的PCR产物，其中含有反义或正义的目的片段，与pMD18-T-vector以3∶1的浓度比例，加缓冲液4.0μL混匀，16℃反应过夜，得到重组载体含有反义目的基因片段的pW1、和含有正义目的基因片段的pW2。(pMD18-T-vector购于TaKaRa公司)。
重组载体的转化按Maniatis的方法制备感受态细胞，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，冰浴30min，同时做对照管。以42℃热激90s，冰上放置2min。每管加入800μL LB液体培养基，37℃温育45min，140rpm/min。涂在含氨苄青霉素(100μg/mL)、×-gal(北京鼎国生物技术有限责任公司)、IPTG(北京鼎国生物技术有限责任公司)的LB培养基平板上选择培养过夜(37℃)。挑取白斑用碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶酶切鉴定，得到重组克隆。
(3)淀粉分支酶基因片段的序列分析由大连宝生物公司完成，核酸序列分析用DNASIS软件，562bp的序列如SEQ ID NO.1所述二、克隆淀粉分支酶基因的种子特异启动子种子特异启动子TSPsbe(934bp)序列如SEQ ID NO.2所述引物序列如下Primer15′TCT CTC CAA CCC CTT CAA TC 3′；Primer25′GAC CGC AAG AGC GAA ATC 3′；由赛百盛生物有限公司合成，该启动子由本实验室克隆保存。
三、克隆绿色荧光蛋白基因从改造的p1300质粒(p1300-GFP)上直接扩增，并得到克隆载体(pW3)。质粒p1300-GFP由本实验室保存。
绿色荧光蛋白序列如SEQ ID NO.3所述引物序列如下Primer15′ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC3′Primer25′TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA3′由赛百盛生物有限公司合成。
四、构建siRNA表达载体(1)目的片段与表达载体的反向连接将含有反义目的基因片段的克隆质粒(pW1)和表达质粒pCAMBIA1301分别用Sac I、Xho I进行双酶切，电泳分离酶切片段，分别回收目的基因片段和载体大片段，然后以3∶1的浓度比例，加连接液4.0μL混匀，16℃反应过夜，得到重组质粒(pAsbeIIa)。该pCAMBIA1301质粒由本实验室保存。
(2)重组质粒pAsbe IIa与正向目的片段的连接将上述重组质粒经Sal I、Sac I酶切，分离载体大片段；克隆质粒(pW2)经Sal I和Sac I酶切，分离目的基因片段，用T4DNA连接酶连接到重组质粒(pAsbe IIa)上，得反义+正义片段的表达质粒pA-Ssbe IIa。
(3)种子特异启动子与表达载体pA-Ssbe IIa的连接将pCAMBIA1301质粒用Sph I、Sal I酶切，插入种子特异启动子，得到pTSPsbe IIa。
(4)绿色荧光蛋白GFP与GUS基因的替换将克隆的绿色荧光蛋白基因的重组质粒(pW3)用Bgl II和BstE II进行双酶切，与同样双酶切的pTSPsbe IIa载体进行连接，得到最终的表达质粒pTSPsbe IIa-GFP。该表达载体就是构建的玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表达载体。
(5)表达载体的转化将重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，筛选出3个重组克隆。通过限制性内切酶Sac I和Sal I酶切鉴定，得到一条约560bp的特异带，电泳图谱表明目的片段确实插入到植物表达载体pCAMBIA1301的种子特异启动子下游，成功地构建了siRNA的表达载体pTSPsbe IIa-GFP。
应用实施例应用玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表达载体培育高直链淀粉玉米自交系。利用花粉管通道技术玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表达载体。转入玉米自交系7922，培育高直链淀粉玉米自交系。
1、表达质粒(pTSPsbe IIa-GFP)的提取和纯化采用改良的“碱裂解法”(大量)提取表达质粒(pTSPsbe IIa-GFP)。提取后的质粒DNA采用PEG分级沉淀法纯化。用紫外吸收法检测质粒DNA的浓度和纯度。浓度为1mg/ml；纯度为OD260/280＝1.82；OD260/230＝2.1。置于冰箱中待用。
2、受体自交系Mo17的种植将受体自交系7922的种子播种于试验田内，按照一般方法管理，培育成株。
3、受体植株的选择和套袋自交当受体植物自花授粉8h后，切去花柱，将DNA导入液滴于切口，迅速套袋，1h后复滴1次。同时以不含DNA的等量SSC溶液按同样处理作对照。记载授粉的日期和时间。
4、导入后的管理和收获定期检查导入果穗纸袋的完好情况，如发现早期破损，立即淘汰。待玉米果穗成熟时，按导入果穗分别收获、晒干、脱粒。
5、转化后代的筛选和鉴定(1)转基因植株的Southern杂交检测对PCR-Southern杂交阳性植株进行Southern杂交检测。取基因组DNA经Sph I和Sal I酶消化，以质粒TSPsbe启动子的PCR扩增片段(934bp)经DIG标记后作为探针进行Southern杂交。
(2)转基因植株的Northern杂交检测对Southern杂交阳性植株进行Northern杂交检测。利用异硫氰酸胍法提取转基因植株和对照的总RNA，RNA经1％甲醛-MOPS琼脂糖凝胶电泳后转至硝酸纤维素膜，以DIG标记的探针进行杂交，Northern杂交及检测按Roche公司的试剂盒说明进行。
(3)转基因植株的淀粉分支酶活性的检测对Northern杂交阳性植株进行淀粉分支酶活性的检测。步骤如下首先，提取粗酶液。取授粉后20天的玉米籽粒5粒，称重，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液(pH7.0)，在冰浴中研磨匀浆，然后在18000rpm/min下离心20min，上清液即为粗酶液。
然后，测定淀粉分支酶活性。取1mL粗酶液+1mL 0.2mol/L柠檬酸缓冲液(pH7.0)+0.5mL 0.1mol/L EDTA(振荡，使α-淀粉酶失活)+0.5mL 0.75％可溶性淀粉，摇匀，在37℃水浴中保温40min(加入10％TCA 4mL终止反应，3000rpm离心8min)，加0.3mL碘液显色，10min后在660nm处测光密度值(O.D)，以零时为对照，淀粉分支酶活性以O.D660％下降的百分率表示ΔO.D660＝(O.D660零时-O.D660t时)/O.D660零时×100％结果显示转基因玉米的分支酶活性与对照相比有明显的下降，分别降低了88％、79％、86％、72％和69％。说明构建的siRNA表达体系有效地表达了siRNA，从而抑制了内源性淀粉分支酶mRNA的翻译，使淀粉分支酶活性明显降低。
(4)转基因植株淀粉含量的检测直链淀粉和支链淀粉含量测定采用何照范(1985)的双波长法。以直链、支链淀粉含量之和为总淀粉含量。方法如下取转基因玉米成熟籽粒粉碎过60目筛，用乙醚脱脂，称取脱脂样品0.1g左右(精确至1mg)加0.5mol/L KOH 10mL，在35℃水浴中振荡15min或在沸水浴中10min，取出，以蒸馏水定容至50mL(如有泡沫采用乙醇消除)，静置。吸取样品液2.5mL两份，即样品测定液和样品空白液，均加入20-30mL蒸馏水，以0.1mol/L HCl调pH至3.5左右，在样品测定液中加碘试剂0.5mL，将样品测定液和样品空白液定容至50mL，混匀(如有泡沫采用乙醇消除)，静置20min，以样品空白液为对照，用1cm或2cm比色杯，分别测定λ2、λ1、λ4、λ3的光密度Eλ2、Eλ1、Eλ4、Eλ3，得到ΔE直＝Eλ2-Eλ1，ΔE支＝Eλ4-Eλ3。分别查两种淀粉的双波长标准曲线，计算出脱脂样品中直链淀粉和支链淀粉的含量。
转基因植株的淀粉含量测定结果显示，总淀粉含量与对照基本没有变化，但直链淀粉的含量均有提高，最高达55％。
6、转化后代的培育对表现高直链淀粉含量的转化单株进行自交纯化和农艺性状鉴定，培育成高直链淀粉含量的玉米自交系。
<110>吉林农业大学<120>绿色荧光蛋白基因<130>gsy200703<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>562<212>DNA<213>淀粉分支酶基因<400>1cgtgtaaaga tacggatgga cacaccatct ggtgttaagg attccattcc tgcctggatc60aagttttctg tgcaggctcc aggtgaaata ccatacaacg gtatatatta tgacccacct120gaagaggaga aatatgtatt caaacaccct caacctaagc ggcccaagtc actgcggata180tatgaatcac atgttggaat gagtagcccg gaaccaaaga taaatacata tgctaacttc240agagatgagg tgcttccaag aattaaaaag cttggataca atgcagtaca gataatggca300atccaggaac actcttatta tgcaagcttt gggtaccatg ttacgaattt ttttgcccca360agtagccgtt ttgggactcc agaggaccta aaatctctta ttgataaagc gcatgagctt420ggcttgctag tgcttatgga tattgttcat agtcattcat caaataatac cttggatggt480ttgaatggtt tcgatggcac cgatacacat tacttccatg gtggtccacg aggccatcat540tggatgtggg attctcgcct at 562
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<210>3<211>701<212>DNA<213>绿色荧光蛋白基因<400>3atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac60ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac120ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc180ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag240cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc300ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg360gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac420aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac480ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc540gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc taccagtccg600ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg660ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta a70权利要求
1.一种玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体，其特征在于利用表达载体pCAMBIA1301上的多克隆位点，将玉米淀粉分支酶种子特异启动子基因插入Sph I、Sal I两个酶切位点之间，玉米淀粉分支酶基因SBE IIa反义片段插入上述启动子下游Sal I、Sac I之间，在切除潮霉素抗生素抗性基因后，玉米淀粉分支酶基因SBE IIa的正义片段被插入到Sac I、Xho I之间，在Bgl II和BstE II两个酶切位点之间插入绿色荧光蛋白基因GFP。
2.根据权利要求1所述的玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体，其特征在于玉米淀粉分支酶基因的片段序列如SEQ ID NO.1所述。
3.根据权利要求1所述的玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体，其特征在于玉米淀粉分支酶种子特异启动子基因序列如SEQ ID NO.2所述。
4.根据权利要求1所述的玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体，其特征在于绿色荧光蛋白基因GFP序列如SEQ ID NO.3所述。
5.如权利要求1所述的玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体的构建方法，包括下列步骤一、克隆玉米淀粉分支酶基因sbe IIa片段(1)淀粉分支酶基因片段的PCR扩增RNA的提取使用TRIzoL试剂盒从玉米叶片及子粒提取总RNA，然后进行反转录成cDNA；反转录反应体系在20μL的反应体系中，总RNA9.5μL，5×缓冲液4.0μL，d NTP(10mM)2.0μL，RNA酶抑制剂0.5μL，引物(100pmol/μL)2.0μL，反转录酶2.0μL，引物设计根据GenBank发表的序列(U65948)，采用DNAMAN软件设计两对引物，利用PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)片段(562bp)；引物序列如下5′CGTGT AAAGA TACGG ATGGA C3′5′ATAGG CGAGA ATCCC ACAT 3′PCR反应体系在50μL的反应体系中，10×缓冲液5.0μL，dNTP 4.0μL，引物各50pmol/L，模板0.1μg，Taq酶0.3μL，以ddH2O补足50μL；PCR扩增条件94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，73℃延伸90s，35个循环，最后72℃延伸10min；(2)淀粉分支酶基因片段的克隆、筛选及鉴定扩增产物的电泳鉴定PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳；得到约560bp大小，特异性强，单一的扩增带；目的DNA片段的回收按DNA片段凝胶回收试剂盒经改良的方法进行；回收的DNA片段，置-20℃冰箱保存；目的DNA片段与克隆载体的连接回收的PCR产物，其中含有反义或正义的目的片段，与pMD18-T-vector以3∶1的浓度比例，加缓冲液4.0μL混匀，16℃反应过夜，得到重组载体含有反义目的基因片段的pW1、和含有正义目的基因片段的pW2；重组载体的转化按Maniatis的方法制备感受态细胞，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，冰浴30min，同时做对照管；以42℃热激90s，冰上放置2min；每管加入800μL LB液体培养基，37℃温育45min，140rpm/min。涂在含氨苄青霉素(100μg/mL)、×-gal、IPTG的LB培养基平板上选择培养过夜(37℃)；挑取白斑用碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶酶切鉴定，得到重组克隆；(3)淀粉分支酶基因片段的序列分析核酸序列分析用DNASIS软件，562bp的序列如SEQ ID NO.1所述二、克隆淀粉分支酶基因的种子特异启动子种子特异启动子TSPsbe(959bp)序列如SEQ ID NO.2所述引物序列如下Primer15′TCT CTC CAA CCC CTT CAA TC 3′；Primer25′GAC CGC AAG AGC GAA ATC 3′；三、克隆绿色荧光蛋白基因从改造的p1300质粒(p1300-GFP)上直接扩增，并得到克隆载体(pW3)，绿色荧光蛋白序列如SEQ ID NO.3所述引物序列如下Primer15′ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC3′Primer25′TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA3′；四、构建siRNA表达载体(1)目的片段与表达载体的反向连接将含有反义目的基因片段的克隆质粒(pW1)和表达质粒pCAMBIA1301分别用Sal I、Sac I进行双酶切，电泳分离酶切片段，分别回收目的基因片段和载体大片段，然后以3∶1的浓度比例，加连接液4.0μL混匀，16℃反应过夜，得到重组质粒(pAsbe IIa)；(2)重组质粒pAsbe IIa与正向目的片段的连接将上述重组质粒经Sac I、Xho I酶切，分离载体大片段；克隆质粒(pW2)经Sac I和Xho I酶切，分离目的基因片段，用T4DNA连接酶连接到重组质粒(pAsbeIIa)上，得反义+正义片段的表达质粒pA-Ssbe IIa；(3)种子特异启动子与表达载体pA-Ssbe IIa的连接将pCAMBIA1301质粒用Sph I、Sal I酶切，插入种子特异启动子，得到pTSPsbe IIa；(4)绿色荧光蛋白GFP与GUS基因的替换将克隆的绿色荧光蛋白基因的重组质粒(pW3)用Bgl II和BstE II进行双酶切，与同样双酶切的pTSPsbe IIa载体进行连接，得到最终的表达质粒pTSPsbeIIa-GFP。该表达载体就是构建的玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表达载体；(5)表达载体的转化将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选出3个重组克隆；通过限制性内切酶Sac I和Sal I酶切鉴定，得到一条约560bp的特异带，成功地构建了siRNA的表达载体pTSPsbe IIa-GFP。
6.如权利要求1所述的玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体在培育高直链淀粉玉米自交系中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种玉米淀粉分支酶基因siRNA表达载体，属于植物基因工程和遗传育种领域。用表达载体pCAMBIA1301上的多克隆位点，将玉米淀粉分支酶种子特异启动子基因插入SphI、SalI两个酶切位点之间，玉米淀粉分支酶基因SBEIIa反义片段插入上述启动子下游SalI、SacI之间，在切除潮霉素抗生素抗性基因后，玉米淀粉分支酶基因SBEIIa的正义片段被插入到SacI、XhoI之间，在BglII和BstEII两个酶切位点之间插入绿色荧光蛋白基因GFP。本发明创造的优点是通过转基因技术高效封闭玉米淀粉分支酶基因sbeIIa的表达，降低玉米淀粉分支酶的活性，提高玉米直链淀粉含量，培育高直链淀粉玉米或创造新的高直链玉米淀粉种质资源。
文档编号C12N15/65GK101029314SQ20071005529
公开日2007年9月5日 申请日期2007年2月2日 优先权日2007年2月2日
发明者王丕武, 关淑艳, 刘慧静, 刘广娜, 姚丹, 曲同宝, 曲静 申请人:吉林农业大学