在利用运动发酵单胞菌的发酵中使用啤酒花酸进行细菌污染控制的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物学和发酵的领域。更具体地，开发了在发酵单胞菌（Zymomonas) 被用作生物催化剂时用于控制发酵中的污染的方法。
【背景技术】
[0002] 从可再生资源中生产燃料乙醇是针对全球化石燃料短缺、能源成本增加、以及与 大气二氧化碳含量提高相关的全球变暖效应的其中一种长期解决方案。来自可再生资源的 燃料乙醇通过利用生物催化剂的糖发酵进行生产。当前，酵母是最广泛地用于乙醇生产的 生物催化剂。可发酵的糖类最典型地是得自经处理的生物材料，包括玉米粒、甜菜、和甘蔗。 替代性的丰富的生物材料糖源是纤维素类或木质纤维素类生物质。利用物理的、化学的、和 /或酶学的处理，用于加工纤维素类和木质纤维素类生物质，以生产可发酵的糖类的方法正 在被开发。
[0003] 在大规模发酵过程中维持无菌是困难的，尤其是当生物材料被用作碳水化合物源 时。大规模发酵过程通常被可能来自经处理的生物材料、设备、工艺用水或其它来源的细菌 污染。通常，污染性细菌是乳酸菌（LAB)，如乳杆菌类。污染性细菌通过利用糖类和降低主 要产物生物催化剂的效果而使发酵产物的收率降低。污染性细菌产生非期望的产物如乙酸 和乳酸，它们增强了培养物中的胁迫条件，导致较差的生长和/或较差的生物催化剂产物 生产。
[0004] 污染性细菌主要为乳酸菌，它们已经成为通常为糊料或糖浆的酵母发酵用于 燃料或酿酒的乙醇生产中的一个问题。由于酵母和污染性细菌对一些抗微生物剂的 不同敏感度，一些抗微生物剂能够被用于在酵母发酵中控制细菌。成功地在酵母发 酵中被用于控制LAB污染的抗微生物剂包括青霉素（Day等人（1954) Agricultural and Food Chemistry，2:252_258)、维吉霉素 （Hynes 等人（1997)J. of Industrial Microbiology&Biotechnologyl8:284-291 ;Bischoff 等人（2009)Biotechnology and Bioengineering，103 :117-122 ;W02007145857)、啤酒花酸（US20040044087 ;Ruckle 和 Senn，（2〇〇6) International Sugar Journal l〇8:l39_147)、FermaSureTM、以及红霉素、泰 乐菌素、和四环素。
[0005] 通过工程化菌株的改进，包括除葡萄糖之外还利用木糖和阿拉伯糖、以及使竞争 性代谢途径失活，开发了发酵单胞菌，作为有效的生物催化剂用于生产乙醇。此外，通过提 高对纤维素类生物质水解产物中存在的抑制剂的耐受性，已使发酵单胞菌适合用于水解产 物发酵培养基中。然而，使用发酵单胞菌作为用于乙醇发酵的生物催化剂显示了在污染控 制方面另外的挑战，因为这种生物催化剂与主要的污染物一样是细菌。
[0006] 对于与酵母一起使用安全的许多抗生素的浓度对于运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis)菌株ZM4的生长是抑制性的，包括四环素、卡那霉素、多粘菌素和链霉素 （Agrawan and Basappa，Biotechnology Letters (1996)，18 :673-678)。仅有青霉素 G 显不在与发酵单 胞菌一起使用时是安全的。苄基青霉素成功地用于控制用于乙醇生产的分批运动发酵单胞 菌（Zymomonas mobilis)发酵中的细菌污染（Grote 和 Rogers，Journal of Fermentation Technology(1985)63 :287-290)。在另一篇综述中，发酵单胞菌被报道为苹果酒和啤酒的 污染物，并且发现了对包括卡那霉素、多粘菌素、和链霉素在内的一些抗生素通常使用的 水平具有抗性的发酵单胞菌菌株（Swings和De Ley，Bacteriological Reviews (1977)， 41 :1-46)。不同菌株之间的差异可能与抗性在质粒上的编码相关，如在运动发酵单胞菌 (Z. mobilis)菌株CP4中针对链霉素、卡那霉素、和庆大霉素所发现的（Walia等人（1984) Applied and Environmental Microbiology，47 :198-200))〇
[0007] 仍然存在对在使用针对乙醇生产开发的发酵单胞菌细菌生物催化剂的发酵中控 制细菌污染的方法的需求。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了发酵液组合物和在发酵单胞菌在其中是生物催化剂的培养基中控 制细菌污染的方法。
[0009] 因此，本发明提供了发酵液组合物，其包含：
[0010] a)发酵培养基；
[0011] b)啤酒花酸；和
[0012] d)发酵单胞菌细胞的生长群体。
[0013] 在另一个实施例中，本发明提供了用于在利用发酵单胞菌生物催化剂的发酵中控 制细菌污染的方法，所述方法包括：
[0014] a)提供发酵培养基；
[0015] b)向发酵培养基添加啤酒花酸；
[0016] c)向所述发酵培养基添加发酵单胞菌细胞的种菌，从而产生发酵液；以及
[0017] d)将所述发酵液维持在适合发酵单胞菌细胞的生长的条件下。
[0018] 在另一个实施例中本发明提供生产乙醇的方法，该方法包括：
[0019] a)提供发酵培养基；
[0020] b)向所述发酵培养基添加在啤酒花酸的存在下生长的发酵单胞菌细胞的种菌，从 而产生发酵液；以及
[0021] c)将所述发酵液维持在适合发酵单胞菌细胞的生长和通过所述发酵单胞菌细胞 生产乙醇的条件下；
[0022] 其中没有啤酒花酸独立于（b)的种菌被添加到所述发酵培养基，并且其中产生乙 醇。
【附图说明】
[0023] 图1显示了在针对木糖的利用工程化的发酵单胞菌中的乙醇发酵途径的图表。
[0024] 图2是显示在水解产物培养基中生长的ZW705细胞的葡萄糖利用率的图，该培养 基在不同商业制剂中包含不同量的啤酒花酸，如标示所示，其完全制剂名在实例1中给出。 HS'*: Hopsteineru,BT ：BetaTec
[0025] 图3示出在种子培养基中的乳酸浓度（A)和乙醇浓度（B)，该培养基无啤酒花酸 或具有25ppm Hopsteinefli Iso-Extract-30%，其以I : 100的比率接种有植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum):运动发酵单胞菌（Z.mobilis)菌株 ZW705。
[0026] 图4示出在水解产物培养基中的乳酸浓度（A)和乙醇浓度（B)，该培养基用种子 培养物接种，初始以1 : 100的比率接种有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum):运 动发酵单胞菌（Z.mobilis)菌株ZW705并在无啤酒花酸的情况下生长；或者种子培养物 初始以1 : 100的比率接种有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum):运动发酵单胞菌 (Z.mobilis)菌株 ZW705 并在具有 25ppmH〇psteilierK Iso-Extract-30%的情况下生长。
[0027] 图5示出在水解产物培养基中的葡萄糖利用率（A)和木糖利用率（B)，该培养基用 种子培养物接种，初始以1 : 100的比率接种有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum): 运动发酵单胞菌（Z.mobilis)菌株ZW705并在无啤酒花酸的情况下生长，或者种子培养物 初始以1 : 100的比率接种有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum):运动发酵单胞菌 (Z.mobilis)菌株 ZW705 并在具有 25ppm Hopsteinerli Iso-Extract-30% 的情况下生长。
[0028] 图6示出在水解产物培养基中的乳酸浓度（A)和乙醇浓度（B)，该培养基用种 子培养物接种，初始以1 : 100的比率接种有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum): 运动发酵单胞菌（Z.mobilis)菌株ZW705并在无啤酒花酸的情况下生长，并且在不同量 Hopsteiiiersi Is〇-Extract-30%的存在下发酵。
【具体实施方式】
[0029] 本发明涉及在利用发酵单胞菌作为生物催化剂（例如用于生产乙醇的）的发酵 中，用于控制污染性细菌的抗微生物剂的使用。啤酒花酸在有效控制污染性细菌的同时对 于发酵单胞菌细胞是安全的这一发现，使得其能够在发酵单胞菌在其中是生物催化剂的发 酵中被使用。具体地，比对于通过酵母生产乙醇的发酵中通常使用的水平更高的高水平的 啤酒花酸，被发现是在包含纤维素类生物质水解产物的发酵培养基中有效地控制污染性细 菌所需要的。所述高水平可以被用于发酵单胞菌发酵中而不减少乙醇的生产。就用作燃料 添加剂而言，乙醇从可再生的资源如纤维素类生物质水解产物的高效生产，将解决化石添 加剂的短缺、降低能源成本和影响全球变暖。
[0030] 下列定义和缩写用于解释权利要求和说明书。
[0031] 如本文所用，术语"包含"、"包括"、"具有"或"含有"，或者其任何其它变型旨在包 括非排他的包括。例如，包含要素列表的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限 于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品 或设备的固有元素。此外，除非相反地明确说明，"或"是指包含性的"或"，而不是指排他性 的"或"。例如，以下中任一者均满足条件A或B :A是真的（或存在的）且B是假的（或不 存在的）、A是假的（或不存在的）且B是真的（或存在的）、以及A和B都是真的（或存 在的）。
[0032] 此外，涉及元素或组分实例（即出现）的数目在本发明元素或组分前的不定冠词 "一个"或"一种"旨在为非限制性的。因此，应将"一个"或"一种"理解为包括一个/ 一种 或至少一个/ 一种，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表 示单数。
[0033] 如本文所用，术语"发明"或"本发明"是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的 任何单独实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施例。
[0034] 如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语"约"是指可以通过例如 以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一 般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过在生产组合物或进行所述方 法所使用的成分的制造、来源、或纯度方面的差异等。术语"约"还包括由于产生自特定起 始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语"约"来修饰，权利要求 包括量的等同量。在一个实施例中，术语"约"指在报告数值的10%范围内，优选在报告数 值的5%范围内。
[0035] 术语"产乙醇生物"指通过代谢碳水化合物原料而产生乙醇的生物。
[0036] 术语"可发酵糖"指在发酵过程中能被微生物用作碳源的