一种利用miR-146a为标志物的肝癌患者血清检测试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了属于分子生物医学【技术领域】的一种利用miR-146a为标志物的肝癌患者血清检测试剂盒及方法。本发明设计miR-146a特异性的引物，采用定量PCR的方法检测正常人血清、肝癌患者血清中miR-146a的含量变化，含量显著降低为肝癌患者血清。本发明的方法简单，迅速，灵敏，适用于检测患者是否患有肝癌。
【专利说明】-种利用miR-146a为标志物的肝癌患者血清检测试剂盒 及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物医学【技术领域】，具体涉及一种利用miRNA-146a为标志物的 肝癌血清检测试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 肝癌是一种常见的恶性肿瘤，据报道，世界范围内每年新增肝细胞癌患者达到 700,000以上。中国是全球肝癌发病率最高的国家，有统计显示，我国肝癌发病人数占 全球55%，死亡人数占全球45%，列癌症死亡的第二位，而且发病率不断上升。肝细胞 癌的早期发现、早期诊断、早期治疗对肝癌患者的预后和存活时间至关重要。甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein, AFP)是迄今人类发现的第一个具有诊断价值的肿瘤标志物，在原发 性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC)发生发展中扮演着重要的角色。但根据临 床资料，约有30 %?40 %肝癌患者血清AFP阴性，而中国又是原发性肝细胞癌的高发国家， 近年来报道的血清AFP阴性原发性肝细胞癌有增多趋势。这部分肝癌患者缺乏有效的肿瘤 标志物用于预后判断与疗效评价。因此，新的肝癌血清标志物，尤其是AFP阴性肝细胞癌的 血清标志物的检测具有重要的临床意义。
[0003] microRNA(miRNA)是一类长约22nt的非编码小RNA分子，它们通过与靶基因 3' UTR结合降解靶基因或者抑制翻译，在多种生理过程中发挥重要作用。肝癌的发生发展 过程由多种复杂的调控通路参与，其中miRNA参与了肝癌致病相关基因的转录后调控。肝 癌的致病原因有很多，如炎性反应、内皮细胞功能障碍等，近期越来越多的研究发现，miRNA 能够参与到上述病理过程的调控之中。
[0004] 本发明证实，miR-146a在AFP为阴性的肝癌患者血浆中含量明显低于正常，这种 特性能作为这种疾病的标志分子，用于临床诊断。进一步研究证实在肝癌细胞中miR-146a 能抑制人肝癌细胞的增殖、迁移作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供miR_146a作为肝癌血清分子标志物。
[0006] 本发明的目的在于提供一种检测miR_146a表达量的引物。
[0007] 本发明的目的还在于提供一种肝癌血清检测试剂盒。
[0008] 本发明的目的还在于提供一种非诊断目的的肝癌血清检测方法。
[0009] -种检测miR_146a表达量的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 所示。
[0010] 一种肝癌血清检测试剂盒，所述试剂盒包含序列表中SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 所示的引物，标准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs，buffer，RNA酶抑制剂和灭菌水。
[0011] 所述标准样品为未经过处理的人血清样品中的RNA反转录成的cDNA。
[0012] 一种非诊断目的的肝癌血清检测方法，按照如下步骤进行：
[0013] (1)提取待检样品的总RNA ;
[0014] (2)将步骤（1)得到的总RNA反转录为cDNA ;
[0015] (3)利用权利要求3或4所述的一种肝癌血清检测试剂盒，以步骤⑵得到的cDNA 为模板，做定量PCR，检测样品中miR-146a的表达量；
[0016] (4)若待检样品的表达量显著高于标准样品的表达量，则该待检样品取自肝癌患 者的生物样品。
[0017] 本发明的有益效果：
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是定量PCR检测正常人血清与AFP为阴性的肝癌患者血清中miR-146a含量 的结果。
[0019] 图2是定量PCR检测人肝癌细胞中miR-146a含量的结果。
[0020] 图 3 转染 NC、si_VASN、miR-146a mimics 与 miR_146a inhibitors 后，对人肝癌细 胞株IfepG2中VASN mRNA水平的影响。
[0021] 图 4 转染 NC、si_VASN、miR-146a mimics 与 miR_146a inhibitors 后，对人肝癌细 胞株H印G2中VASN蛋白水平的影响。
[0022] 图5是MTT实验检测转染miR-146amimics与miR_146a inhibitor后，对人肝癌 细胞株H印G2增殖的影响。 图6是划痕实验检测转染miR_146a mimics与miR_146a inhibitor后，对人肝癌细胞 株HepG2迁移的影响。 图 7 是 Transwell 实验检测转染 miR_146a mimics 与 miR_146a inhibitor 后，对人肝 癌细胞株H印G2迁移的影响。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0024] 以下实施例未说明的实验步骤参照《分子克隆实验指南》第三版，或参照相应试剂 盒的说明书。
[0025] 实施例1人血清样品中RNA的抽提
[0026] (1)样品（正常人血清、肝癌患者血清）室温放置5分钟，从-80°C冰箱取出的样 品室温放置15分钟至融化。
[0027] (2)每250 ill样品加750微升Trizol混匀，再加入250 ill三氯甲烷，剧烈晃动 15秒，室温静置3分钟。
[0028](3) 4°C、12000g 离心 15 分钟，上层为 RNA
[0029] (4)将上层水相约500 ill转移到新EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀10 秒，置于-20 °C冰箱沉淀两小时或过夜。
[0030] (5)取出样品，4°C 12000g离心15分钟，倒掉上清加入lml80%乙醇（DEPC水配 置）洗涤沉淀，上下翻转十次，使白色RNA沉淀浮起，4°C、7500g离心5分钟，共进行两次。
[0031] (6)弃上清，吸尽管中液体，使乙醇挥发干净（约2-5分钟）
[0032] (7)待RNA沉淀边缘开始变干透明时，立即加入DEPC水（20iU左右）。取liil 用于定量，其它RNA与-80°C保存备用。可加入1 yl RNAase inhibiter防止RNA降解。
[0033] 实施例2反转录
[0034] 米用 M-MLV Reverse Transcriptase [Promega#9PIM170]反转录试剂盒进行反转 录。
[0035] 每个样品取1 U gRNA分别和miRNA_146a及U6的特异反转引物混合，70度水浴 1〇分钟，冰上放置两分钟。然后每个样品分别加入^^作沾111，(1阶？4111，反转录酶1111， RNAase inhibitorO. 2 y 1。反转好的cDNA在-20度保存，避免反复冻融。
[0036] 实施例3定量-PCR
[0037] 按照实验分组，每个样品检测内参和miRNA_146a的含量。PCR正向引物和反向引 物如序列表中SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示，每个实验组三个复孔，体系为20 iil，仪器 为 Stratagene MxPro3000, SYBR Green mix 为 Promega
[0038] 公司产品。实验体系为：10iil2XSYBR Green mix，8iil 水，liil 引物，liil cDNA。 PCR反应条件是95度5分钟，95度20秒，60度20秒，72度20秒，50个循环，溶解曲线为 60度到95度，温度间隔为0. 4度。
[0039] PCR结果如图1-2所示，在AFP为阴性的肝癌患者中miRNA_146a的拷贝数明显低 于正常人血清中miRNA-146a的拷贝数（图1);在人肝癌细胞株H印G2中miRNA-146a的拷 贝数明显低于肝正常细胞株L02中miRNA-146a的拷贝数（图2)。
[0040] 实施例4MTT实验
[0041] 以2 X 103个细胞/孔接种于96孔板；培养过夜后，待细胞密度达到40 %时进行转 染。37°C培养24h-72h，检测细胞数；每孔加入100 ill培养基和20 ill MTS的混合液，37°C 孵育lh，酶联免疫检测仪490nm读取吸光度值，绘制生长曲线。
[0042] 实施例5细胞划痕实验
[0043] 以5X 105个细胞/孔接种于6孔板；培养过夜后待细胞密度达到40%时进行转 染。37°C培养24h，使细胞浓度达到90%左右；用黄枪头在培养孔中轻划2-3条划痕，换新 鲜培养基继续培养，每隔6h观察划痕愈合情况。
[0044] 实施例6细胞迁移实验
[0045] 以5X 105个细胞/孔接种于6孔板；培养过夜待细胞密度达到40%时进行转染。 37°C培养24h后换无血清培养基继续培养24h ;消化细胞制备单细胞悬液，稀释为5X 105个 细胞/ ml，每种细胞种3个小室，每个小室中加入100 iil，在24孔板中加入500 ill含10% FBS的培养基作为下液，将Transwell小室放入孔中，继续培养12-24h取出小室；用PBS擦 去小室内表面上未穿膜的细胞，甲醛固定30min，结晶紫染色30min，与显微镜下观察。20X 视野下细胞计数，共计数四个视野，取平均值。
【权利要求】
1. miR-146a作为肝癌血清分子标志物，其特征在于，所述核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1 所示。
2. -种检测miR-146a表达量的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 所示。
3. -种肝癌血清检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物，标 准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs，buffer，RNA酶抑制剂和灭菌水。
4. 根据权利要求2所述一种肝癌血清检测试剂盒，其特征在于，所述标准样品为未经 过处理的人血清样品中的RNA反转录成的cDNA。
5. -种非诊断目的的肝癌血清检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行： (1) 提取待检样品的总RNA ; (2) 将步骤⑴得到的总RNA反转录为cDNA ; ⑶利用权利要求3或4所述的一种肝癌血清检测试剂盒，以步骤⑵得到的cDNA为 模板，做定量PCR，检测样品中miR-146a的表达量； (4)若待检样品的表达量显著高于标准样品的表达量，则该待检样品取自肝癌患者的 生物样品。
【文档编号】C12N15/113GK104450703SQ201410143207
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】邵宁生, 李慧, 李少华, 李洁, 王玮, 丁红梅, 黄皑雪, 苏雪婷, 赵强 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所