专利名称：一种检测真姬菇菌种质量变化的方法
技术领域：
本发明涉及现代农业技术的菌种质量评价技术领域，具体的说是一种简单评价栽 培真姬菇菌种质量变化的方法。
背景技术：
食用菌产业的发展，需要大量的菌种。菌种作为重要的生产资料，对产业的发展起 着重要的作用，从某种意义上甚至可以说是决定了栽培的成败。但是，由于多年形成的分散 生产经营方式，菌种生产缺乏规范，菌种生产和质量常出现这样、那样的问题，随着产业的 发展，问题日益突出，甚至成为主产区的社会不安定因素。产业的发展迫切需要对菌种进行 科学有效的管理。为了保护和合理利用食用菌种质资源，规范品种选育及生产、经营、使用 和管理，根据《中华人民共和国种子法》(以下简称《种子法》)和《中华人民共和国植物新 品种保护条例》，农业部制定了《食用菌菌种管理办法》(以下简称《管理办法》)。在《管理 办法》第四章菌种质量禁止生产经营假、劣菌种。但实际生产中，优质菌种经长期无性世代 繁殖，不知不觉中已经发生了退化。突然有一天，这些“退化”一下子表现出来。不同食用 菌退化的表现各异，而这些现象，在营养菌丝阶段从形态外观上通常是无法区分的。真姬菇[Hypsizygus marmoreus (Peck) Bigelow]，又名蟹味菇、海鲜菇、鸿喜菇、玉 蕈、胶玉蘑，隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、离褶菌族、玉蕈属，是一种质地脆 嫩，味道鲜美，营养丰富，具有多种保健功效的珍稀食用菌，深受广大消费者的喜爱。真姬菇 是已经实现工厂化生产的主要食用菌之一，产量仅次于金针菇、杏鲍菇。真姬菇是栽培期较 长的食用菌，大约需要90 110d。这主要由于真姬菇菌丝培养必须经一个生理成熟期(后 熟期)，才能长出较好的菇。如果到出菇时才发现是劣质菌种，对于一个日产5吨的中等规 模食用菌工厂，已经生产了 3000000瓶。如上所述，通过栽培试验检测菌种质量的方法，虽 然可靠，但对食用菌工厂时间就是效益，闲置厂房设备也是损失。对于菇农来说劣质菌种则 是一季减产甚至是绝收。目前，检测菌种质量，栽培试验是最具说服力的方法。该方法主要可以考察菌种是 否均一且性状稳定，对生长周期短的食用菌可能还可行。菌种在培养基质上生长和出菇的 过程中，一方面可从形态特征、生理生态特性方面考察菌种质量，另一方面可以从畸菇率、 原基发生期、原基发生数量、菇体色泽、产量等方面考察菌种质量。退化品种的菌种经栽培 后，常表现出菇期不一致、菇潮不明显、产量下降、对不良环境或杂菌的抗性降低等现象，而 老化菌种则表现为出菇提前、菇体变薄等现象。而该检测菌种质量方法的缺点就是周期长， 尤其对生长周期长的菌种，使用该方法有待商榷。新近发展起来的DNA指纹分析技术，如RAPD、RFLP等，可以从基因组水平进行菌种 鉴别。该方法可以检测病菌侵染、杂菌污染、菌株混杂等问题，暂且不论该方法是否能解决 菌种质量其他问题(如退化菌株)，但就其操作的复杂性，对缺乏生物技术知识的菇农来说 也是很难接受的。其他还有一些检测菌种质量的方法，如形态特征观察、生理特征、生化测 定等，这些方法一般都需要长期的栽培经验和一定的生物学基础。根据目前研究，上述方法与菌株质量并不存在必然联系。因此，无论是食用菌工厂还是广大菇农都亟需一种快速、简 便的评价菌种质量的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的检测评价真姬菇菌种质量变化的方法，它可克 服现有技术中检测方法操作复杂、需要长期的栽培经验和一定的生物学基础，无法满足食 用菌工厂和广大菇农需要的一些不足。为了实现上述目的，本发明的技术方案是一种检测真姬菇菌种质量变化的方法， 其特征在于所述的评价方法包括下列步骤a.菌种菌丝体的培养；b.检测菌种质量液体培养基的配置；c.液体培养标准菌种，并记录标准参数；d.液体培养待评价菌种；e.观察培养液变化；测定培养液在615nm处的吸光度，根据公式D = 1-A615 (菌 种培养液)/A615 (空白培养液)，来计算D值；f.将培养液颜色、D值和所建立标准菌种的参数进行比较，检测菌种质量变化趋势。上述菌丝体在用于食用菌生产时，为保藏菌种菌丝体和用于栽培的各级菌种；在 用于育种筛选菌株时，为出发菌株和各个衍生菌株。上述接种量可根据培养基的多少放大或缩小，适当正增加接种量可以加速检测时 间，但需要摸索培养基变色的完成时间即培养天数。上述液体培养基最终颜色评价，黄色一绿色一蓝色，为由好到差的顺序。根据保藏 种和栽培用各级种比较，向差的方向变化较大的菌种即明显看出变蓝幅度较大的需要谨慎 使用，或不使用。上述利用分光光度计在615nm测定培养液的吸收值并计算出D值，使用于菌种厂 或工业化食用菌生产企业，可以更为精确的检测菌种的质量细微变化，当D值较保藏菌种 减小30 %，菌种质量较差，变化较大，需谨慎使用或弃用。使用时本发明克服了传统通过栽培试验检测菌种质量周期长效率低的缺点，首次 利用正常菌株与退化菌株在液体培养基中具有不同的使合成染料褪色的能力，而退化菌株 的产量和畸形菇数量与液体培养基颜色成一定的相关性，实现了对真姬菇劣质菌株的有效 鉴别。同时，为其他食用菌菌种评价提供了有效的借鉴。需要说明的是这里提出的评价方法适用于生产中同一菌种质量的相对优劣变化， 该方法不适用于因真假菌种而引起的菌种质量问题。
图1为本发明评价方法的结构框2为15、18号菌株培养液经离心去菌丝体后和空白CK的显色结果图3 图19为1 18号菌株的全波段扫描结果
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。本发明所述的一种检测真姬菇菌种质量变化的方法，其特征在于所述的检测方 法包括下列步骤a.菌种菌丝体的培养；b.检测菌种质量液体培养基的配置；c.液体培养标准菌种，并记录标准参数；d.液体培养待评价菌种；e.观察培养液变化；测定培养液在615nm处的吸光度，根据公式D = 1-A615 (菌 种培养液)/A615 (空白培养液)，来计算D值；f.将培养液颜色、D值和所建立标准菌种的参数进行比较，检测菌种质量变化趋势。步骤a中，菌种菌丝体可以是保藏菌种，母种，生产用各级种，组织分离获得的菌 种，必须为活体，且可形成子实体的真姬菇菌种纯培养物。步骤b中，检测菌种质量的液 体培养基各成分的重量百分比为乳糖3-6%、蛋白胨7-9%、酵母粉4-5%、溴百里酚蓝 0. 02-0. 03%，余量为蒸馏水，pH7. 0，上述各成分的重量百分比之和为100%。步骤c中，标准菌种的选择为所要评价菌种的保藏菌种，将培养于马铃薯葡萄糖 琼脂平板的保藏菌种和不同批次菌种的菌块1cm2，接种于装有50mL液体检测培养基的 150mL三角瓶中，若进行静置培养务必使接种的菌块浮于液面，因为该培养过程是需氧的， 如沉入液内，会影响检测结果；若摇床培养没有上述要求，接种后，置于25°C环境培养，摇 床150rpm振荡培养5天，或静置培养10天。步骤d中，接种Icm2的菌丝体到IOOmL液体 培养基中，液体培养于23 ^TC,静置或震荡均可，150rpm振荡培养4 5天或静置培养 10 14天，观察液体培养基颜色变化，当静置培养时，接种务必使菌块浮于液体表面，以保 证培养在较短时间完成。步骤e中，观察液体培养基颜色的变化黄色一绿色一蓝色，为菌种质量由好到 差。使用分光光度计测定培养液在615nm处的吸光度，通过D= 1-A615 (菌种培养液)/ A615 (空白培养液)公式可得到各菌种的D值，D值越大质量越好，反之，质量越差。步骤f中，比较保藏菌种与栽培菌种之间的颜色差异a、若栽培菌种液体培养基 颜色较保藏菌种差异不明显，则可以使用；b、若栽培菌种液体培养基颜色较保藏菌种明显 变蓝的趋势，则说明该批次菌种质量不好，产量将下降，畸形菇数量上升，需谨慎使用，或弃 用；C、记录了每次检测保藏菌种的颜色，如发现保藏菌种较此前颜色变蓝且幅度较 大，则需要对保藏菌种进行提纯复壮，或者更换菌种；比较保藏菌种与栽培菌种之间D值变 化，当D值变低小于等于30%时，则可以使用；当D值变低大于30%时，则说明该批次菌种 质量不好，产量将下降，畸形菇数量上升，需谨慎使用，或弃用；当批次间保藏种D值变低大 于30%时，则需要对保藏菌种进行提纯复壮，或者更换菌种。步骤f中，所谓菌种质量变化 趋势的检测，即预测该菌种用于栽培时，产量、畸形菇数量相对原菌种的变化情况。实施例本发明首先对要评价菌种的保藏种进行检测，建立该菌种的参数基准(即接种 量，液体培养基量，培养天数和培养方式)，检测培养液变色幅度，或吸光度；根据上述参数基准，比较保藏种不同批次的变化情况，决定是否需要提纯复壮菌种，或更换新菌种；根据 上述参数基准对栽培各级种进行检测，比较保藏种与栽培各级种培养液变色幅度，或吸光 度，判断栽培种质量是否发生变化及变化趋势，再变化情况决定栽培种质量及使用与否。菌种的选择生产过程中菌种质量检测时，选择真姬菇菌株见表1(中国微生物菌种保藏管理 委员会农业微生物中心上海食用菌分中心提供)建立标准检测体系。18号菌株为上海浦东 天厨菇业有限公司提供生产用白色真姬菇菌株。表1供试真姬菇菌株
权利要求
1.一种检测真姬菇菌种质量变化的方法，其特征在于所述的检测方法包括下列步骤a.菌种菌丝体的培养；b.检测菌种质量液体培养基的配置；c.液体培养标准菌种，并记录标准参数；d.液体培养待评价菌种；e.观察培养液变化；测定培养液在615nm处的吸光度，根据公式D=1_A615(菌种培 养液)/A615 (空白培养液)，来计算D值；f.将培养液颜色、D值和所建立标准菌种的参数进行比较，检测菌种质量变化趋势。
2.如权利要求1所述的一种检测真姬菇菌种质量变化的方法，其特征在于步骤a中， 菌种菌丝体可以是保藏菌种，母种，生产用各级种，组织分离获得的菌种，必须为活体，且可 形成子实体的真姬菇菌种纯培养物。
3.如权利要求1所述的一种检测真姬菇菌种质量变化的方法，其特征在于步骤b 中，检测菌种质量的液体培养基各成分的重量百分比为乳糖3-6%、蛋白胨7-9%、酵母粉 4_5%、溴百里酚蓝0. 02-0. 03%，余量为蒸馏水，pH7. 0，上述各成分的重量百分比之和为 100%。
4.如权利要求1所述的一种检测真姬菇菌种质量变化的方法，其特征在于步骤c中， 标准菌种的选择为所要评价菌种的保藏菌种，将培养于马铃薯葡萄糖琼脂平板的保藏菌种 和不同批次菌种的菌块Icm2，接种于装有50mL液体检测培养基的150mL三角瓶中，若进行 静置培养务必使接种的菌块浮于液面，因为该培养过程是需氧的，如沉入液内，会影响检测 结果；若摇床培养没有上述要求，接种后，置于25°C环境培养，摇床150rpm振荡培养5天， 或静置培养10天。
5.如权利要求1所述的一种检测真姬菇菌种质量变化的方法，其特征在于步骤d中， 接种Icm2的菌丝体到IOOmL液体培养基中，液体培养于23 ^°C，静置或震荡均可，150rpm 振荡培养4 5天或静置培养10 14天，观察液体培养基颜色变化，当静置培养时，接种 务必使菌块浮于液体表面，以保证培养在较短时间完成。
6.如权利要求1所述的一种检测真姬菇菌种质量变化的方法，其特征在于步骤e中， 观察液体培养基颜色的变化黄色一绿色一蓝色，为菌种质量由好到差。
7.如权利要求1所述的一种检测真姬菇菌种质量变化的方法，其特征在于步骤e中， 使用分光光度计测定培养液在615nm处的吸光度，通过D= 1-A615(菌种培养液)/A615(空 白培养液)公式可得到各菌种的D值，D值越大质量越好，反之，质量越差。
8.如权利要求1所述的一种检测真姬菇菌种质量变化的方法，其特征在于步骤f中， 比较保藏菌种与栽培菌种之间的颜色差异a、若栽培菌种液体培养基颜色较保藏菌种差异 不明显，则可以使用；b、若栽培菌种液体培养基颜色较保藏菌种明显变蓝的趋势，则说明该 批次菌种质量不好，产量将下降，畸形菇数量上升，需谨慎使用，或弃用；c、记录了每次检测 保藏菌种的颜色，如发现保藏菌种较此前颜色变蓝且幅度较大，则需要对保藏菌种进行提 纯复壮，或者更换菌种；比较保藏菌种与栽培菌种之间D值变化，当D值变低小于等于30% 时，则可以使用；当D值变低大于30%时，则说明该批次菌种质量不好，产量将下降，畸形菇 数量上升，需谨慎使用，或弃用；当批次间保藏种D值变低大于30%时，则需要对保藏菌种进行提纯复壮，或者更换菌种。
9.如权利要求1所述的一种检测真姬菇菌种质量变化的方法，其特征在于步骤f中， 所谓菌种质量变化趋势的检测，即预测该菌种用于栽培时，产量、畸形菇数量相对原菌种的 变化情况。
全文摘要
本发明公开了一种检测真姬菇菌种质量的方法，即采用含有活性染料的液体培养基对真姬菇菌种质量进行评价。本发明利用正常菌株与退化菌株具有不同的使合成染料褪色的能力，成功建立了基于该方法的评价技术，实现了对初步真姬菇菌种质量的评价。采用本方法能够快速、经济的评价真姬菇菌种质量。
文档编号C12Q1/02GK102080120SQ200910199728
公开日2011年6月1日 申请日期2009年12月1日 优先权日2009年12月1日
发明者冯志勇, 陈明杰, 陈辉, 高君辉 申请人:上海市农业科学院