0rpm/ min离心10分钟，将上清转移至新的离心管中。
[0028] (3)DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往离心管中加入两倍体积的沉淀剂，混 勾后加入DNA吸附柱，13000rpm/min离心2min，弃废液，加入500 y 1去蛋白液，13000rpm/ min离心lmin，弃废液，加入500 y 1漂洗液，13000rpm/min离心lmin，弃废液，加入500 y 1 漂洗液，13000rpm/min离心2min，弃废液，13000rpm/min离心2min，静置吹干。
[0029] (4)DNA洗脱：往吸附柱中加入30 y 1洗脱液，13000rpm/min离心2min，所得液体 为农杆菌质粒DNA。取3-6 y 1 DNA水溶液，于1 %琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0030] 试剂的配方如下： 下表为本实施例提取到的农杆菌质粒DNA的纯度检测图。
[0031] DNA吸附柱为硅胶模吸附柱，购自北京天恩泽公司。
[0032] YEB液体培养基：5g/L牛肉浸膏，5g/L胰蛋白胨，1 g/L酵母提取物，5g/L蔗糖， 0. 5g/L七水硫酸镁，用氢氧化钠调PH至7. 0。
[0033] Buffer A:0. lmol/L 氯化钠，10mmol/L 三轻甲基氨基甲烧（PH = 8)，0? lmol/L 乙 二胺四乙酸（PH = 8)。
[0034]Buffer B: 50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L 三轻甲基氨基甲烧（PH = 8)，10mmol/L 乙 二胺四乙酸（PH = 8)，2. 5mg/ml溶菌酶。
[0035] Buffer C:0. 2mol/L氢氧化钠，1%质量体积比的十二烷基硫酸钠（SDS)，氢氧化钠 溶液与SDS溶液单独配置，使用前现配现用，等体积混合即是Buffer C溶液。
[0036] Buffer D: 3mol/L醋酸钾，11. 5%冰醋酸。
[0037] BufferE:3mol/L 乙酸钠（PH = 4.8)，用冰乙酸调 PH 至 4.8〇
[0038] Buffer F:酸：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1。
[0039] Buffer G:氯仿：异戊醇的体积比为24:1。
[0040] 沉淀剂：70%无水乙醇。
[0041] 去蛋白液：511盐酸胍，2〇1111三羟甲基氨基甲烷（作18)，？11 = 6.6，使用前加入乙 醇，使得乙醇在去蛋白液中的终浓度为38%。
[0042] 漂洗液：20禮氯化钠（恥(：1)，21111三羟甲基氨基甲烷〇^8)，口11=7.5,85%比重 无水乙醇。
[0043] 洗脱液：10mM T三羟甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 8. 5。
[0044] 利用本试剂盒提取的农杆菌质粒的电泳检测结果见图1，泳道1、2均为利用本试 剂盒提取的农杆菌质粒电泳检测图，泳道3为TAKARA公司的DL4500Marker。从图中1可看 出，本方法可以提取到农杆菌质粒DNA。农杆菌质粒DNA的纯度检测结果见表1。利用本试 剂盒提取到的农杆菌质粒DNA的0D (260:280)值的范围在1. 78-1. 79之间，具有较高纯度， 因此可看出本试剂盒可以快速提取到纯度高的农杆菌质粒DNA。
【主权项】
1. 一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，包括农杆菌菌液培养，农杆菌细胞破碎，DNA吸 附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，其特征是： 农杆菌菌液培养：挑取含有质粒的农杆菌菌株接种到50-100ml YEB液体培养基中， 在恒温摇床上28-30°C，160-200rpm/h，培养40-48h，吸取2-4ml菌液于5ml离心管中， 10000-13000 rpm/min 离心 5-10min，弃上清，保留沉淀； 农杆菌细胞破碎：往含有农杆菌沉淀的5ml离心管中加入3-4ml Buffer A，漩涡悬 浮菌体后10000-13000rpm/h离心3-5min，弃上清，保留沉淀；往沉淀中加入3-4ml Buffer A,漩祸悬浮菌体后10000-13000rpm/h离心3-5min，弃上清，保留沉淀；往沉淀中加入 0. 4-0. 5ml Buffer B，漩祸悬浮菌体，室温下静止10_20min，加入0. 8-lml新配置的Buffer C，上下颠倒离心管5-10次，室温下静止10-20min，加入0. 4-lml Buffer D，轻柔颠倒离心 管数次，使其充分混匀；加入〇.2-lml Buffer E，轻柔颠倒离心管数次，使其充分混匀，将离 心管冰浴5-10min后10000-13000rpm/h离心10_15min，将上清转入新的离心管中；加入与 上清等体积的Buffer F溶液抽提，10000-13000rpm/min离心5-10分钟，将上清转移至新 的离心管中；加入与上清等体积的Buffer G抽提，10000-13000rpm/min离心10-20分钟， 将上清转移至新的离心管中； DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往离心管中加入两倍体积的沉淀剂，混匀后加 入DNA吸附柱，10000-13000rpm/min离心l-2min，弃废液，加入500-600 y 1去蛋白液， 10000-13000rpm/min 离心 l-2min，弃废液，加入 300-500 y 1 漂洗液，12000-13000rpm/min 离心l-2min，弃废液，加入500-600 y 1漂洗液，12000-13000rpm/min离心l-2min，弃废液， 12000-13000rpm/min 离心 l_2min，静置吹干； DNA洗脱：往吸附柱中加入30-60 y 1洗脱液，12000-13000rpm/min离心l_2min，所得 液体为农杆菌质粒DNA，取3-6 y I DNA水溶液，于1-2%琼脂糖凝胶中电泳检测。2. 根据权利要求1所述的一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，其特征是所述的DNA吸 附柱为硅胶模。3. 根据权利要求1所述的一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，其特征是所述的吸附柱 YEB液体培养基：5-10g/L牛肉浸膏，5-10g/L胰蛋白胨，l-10g/L酵母提取物，5-10g/L蔗 糖，0. 5-lg/L七水硫酸镁，用氢氧化钠调PH至7. 0-8. 0。4. 根据权利要求1所述的一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，其特征是所述的 Buffer A:0. 1-0. 5mol/L氯化钠，PH=8-9的10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，PH=8-9的 0? 1-0. 3mol/L乙二胺四乙酸。5. 根据权利要求1所述的一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，其特征是所述的Buffer B:50-80mmol/L 葡萄糖，PH=8-9 的 25-50mmol/L 三羟甲基氨基甲烷，PH=8-9 的 10-20mmol/ L乙二胺四乙酸，2. 5-4mg/ml溶菌酶。6.根据权利要求1所述的一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，其特征是所述的Buffer C:0. 2-0. 5mol/L氢氧化钠，1-3%SDS溶液，氢氧化钠溶液与SDS溶液单独配置，使用前现配 现用，等体积混合即是BufferC溶液；所述的D:3-5mol/L醋酸钾，11. 5-20%冰醋酸；所述 的131^€6『￡:?11=4.8-6的3-51]1〇1/1^乙酸钠，用冰乙酸调？11至4.8-6;所述的13 1^€6『卩： 酸：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1 ;所述的BufferG:氯仿：异戊醇的体积比为24:1。7. 权利要求1所述的一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，其特征是所述的沉淀剂： 70-80%无水乙醇。8. 权利要求1所述的一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，其特征是所述的去蛋白液： 3-6M盐酸胍，10-30 mM三羟甲基氨基甲烷，pH=6. 0-7.0,用前加乙醇，使得乙醇在去蛋白液 中的终浓度为30-40%。9. 权利要求1所述的一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，其特征是所述的漂洗液： 20-50mM氯化钠，2-5mM三羟甲基氨基甲烷，pH=7. 0-8. 0,80-90%比重无水乙醇。10. 权利要求1所述的一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，其特征是所述的洗脱液： 10-20mM三羟甲基氨基甲烷，pH=8. 0-9.0。
【专利摘要】本发明涉及一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，属于生物技术领域。本发明提供一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，包括农杆菌菌液培养，农杆菌细胞破碎，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱具体步骤，得到DNA水溶液，于1-2%琼脂糖凝胶中电泳检测。常规的农杆菌质粒提取步骤繁琐，操作麻烦，一般需要4h左右才能完成农杆菌质粒DNA的提取。利用本发明提供的试剂盒仅需1.5h即可完成农杆菌质粒DNA的提取，该试剂盒与常规提取方法相比不仅节省了大量时间，同时也更加方便、快捷，具有一定的经济效应。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105039310
【申请号】CN201510449485
【发明人】王清水, 余彦
【申请人】福建师范大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月28日