专利名称：羊型布鲁氏杆菌m5菌株核糖体蛋白l7/l12的基因、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及羊型布鲁氏杆菌M5菌 株(5rwce〃a metoe"w's M5 )核糖体蛋白L7/L12的基因、其编码蛋白及应用。
背景技术：
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属引起的一种人畜共患 传染病。布鲁氏菌是哺乳动物寄生菌，对人和哺乳动物具有高度感染 性和致病性。该菌属有羊、牛、猪、犬、林鼠、海洋哺乳动物和绵羊 七个生物种，中国流行的主要是前4种。羊、牛、猪等家畜最易感染， 其中以羊种最为常见。由于布鲁氏菌是兼性细胞内寄生菌，它不仅寄 生于单核-巨噬细胞系统，且可在胎盘绒毛上皮细胞、肾实质细胞、 睾丸的纤维母细胞及胚胎细胞中繁殖，引起生殖器官和胎膜发炎、流 产、不育和各种组织的局部病灶。人类对布鲁氏菌易感， 一般羊种布 鲁氏菌对人毒力最高。人与病畜接触后，细菌可通过消化道和呼吸道 粘膜、皮肤及眼结膜等途径而感染。由于布鲁氏菌的细胞内寄生特性，致使抗生素等化学药剂对其防 治效果较差，而只有机体产生的由T细胞介导的细胞免疫则是预防及 控制该病的最为有效的措施。虽然目前应用的全菌减毒活疫苗、死疫 苗及亚单位疫苗对于疾病的发生起到了一定的预防作用。但是由于不 能诱导机体产生强而有效的细胞介导免疫，因而研究与开发新型疫苗 对于控制疫情的蔓延已经成为一项重要的研究课题。由于布鲁氏菌的 细胞内寄生特性，使其可以在巨噬细胞内长期潜伏，因此，接种疫苗 的关键在于能够诱导机体产生具有记忆功能的适应性免疫应答，细胞
介导免疫是针对布鲁氏菌病所需要的最重要的免疫应答。因此，选择 能够诱导Thl型免疫应答的T细胞抗原研制亚单位疫苗或者选择编码T细胞抗原的基因制备DNA疫苗国内外已有一些报道。最近一些 国家应用的牛种RB51、羊种REV.l及羊种M5 (司瑞等，羊布鲁氏 菌B C S P31、 OMP31、 L7/L12基因的原核表达载体构建及表达， 中国人兽共患病杂志，1002-2694(2005)11-0961-04)(中国)减毒活疫 苗，虽然可以分别用于牛和羊的免疫，然而，这些遗传性不确定的菌 株仍可引起流产和持续性发热，致使其安全性和有效性出现了问题。 目前已经证实的布鲁氏杆菌T细胞抗原包括BFR、 P39、 L7/L12、 SOD及31KD蛋白等已经用于亚单位疫苗的实验研究，而这些蛋白 抗原的编码基因也有用于DNA疫苗的实验研究。但目前国内外尚未 见有关羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因序列和氨 基酸序列的报道。由于现有疫苗存在诸多不足，同时人群对羊型布鲁 氏杆菌最易感、毒性反应最强烈，因此造成了近年来布鲁氏菌病感染 率呈直线上升趋势，对畜牧业的发展及人类的健康造成极大的危害。 筛选和鉴定羊型布鲁氏杆菌M5菌株L7/L12基因对开发新型疫苗及 检测试剂盒具有极其重要的意义。发明内容本发明的目的在于提供羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白 L7/L12的基因、其编码蛋白及应用。L7/L12基因具有如序列表SEQ ID NO.l所示的核苷酸序列，其 编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。本发明还包括序 列表SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几 个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质，以及编码这些蛋白质的 基因。L7/L12基因全长438bp ， 5 ，非编码区长39bp ， 3，非编码区长24bp ， 自40bp~414bp为其开放阅读框，编码124个氨基酸。在GenBank中进行同源搜索，未发现与该基因相同的序列报道，为一新基因。本发明基因可以通过如下方法获得以羊型布鲁氏杆菌M5菌株 基因组DNA为模板，利用如序列表SEQ ID N0.3和4所示的引物进 行扩增，扩增条件是94。C预变性4min后，以94°C 30s、 55°C 40s、 72°C 40s反应35个循环，72。C延伸10min。本发明还包括含有上述基因的表达载体、含有所述表达载体的宿 主细胞。利用本发明的基因可以用来制备基因疫苗，如通过本发明的序列 设计合成siRNA或者shRNA或者是microRNA用于基因沉默。也可 以通过制备本发明基因的表达蛋白，研发重组蛋白疫苗，或者是开发检测试剂盒。本发明的基因具有极其重要的价值，通过本发明基因开发出的相 关基因工程产品，可以有效地用于布鲁氏菌病的检测、预防和治疗。 为布鲁氏菌病提供有新的有效的解决途径。
图1为PCR获得的目的基因片段L7/L12的琼脂糖凝胶电泳检测 结果，图中1为DL2000DNAMarker; 2、 3为PCR产物。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的 范围。1.羊型布鲁氏杆菌M5菌株的培养首先用布氏肉汤培养基复苏羊型布鲁氏杆菌M5株冻干菌(购自 中国药品生物制品检定所)，布氏肉汤培养基(购自中国进出口商品 检验技术研究所)固体斜面上进行划线培养，37°C、 5%(302条件下 培养10天，待布鲁氏杆菌在固体斜面上生长形成肉眼可见的单菌落 后，用接种环小心刮取单个菌落，接种到液体布氏肉汤培养基中，37t: 水浴摇床培养24hr后得到浓度适宜的菌液。
2. 提取细菌全基因组DNA将培养得到的浓度适宜的菌液用(离心柱型)细菌基因组DNA 提取试剂盒(购自天为时代公司)获得羊型布鲁氏杆菌M5菌株的全 基因组DNA，参照试剂盒说明书操作，收集浓度适宜的布鲁氏杆菌 培养液3ml， 10000rpm离心lmin,弃上清；加200ul缓冲液GA，悬 浮沉淀，加入20ul蛋白酶K (20mg/ml)溶液，混匀；加入220ul缓 冲液GB,充分混勾，7(TC放置10min;加入220ul无水乙醇，混勻； 将所得的溶液和絮状沉淀加入吸附柱CB中，12000rpm离心30s，弃 废液；加500ul蛋白液GD， 12000rpm离心30s，弃废液；加入700ul 漂洗液GW, 12000rpm离心30s，弃废液；加入500ul漂洗液GW， 12000rpm离心30s,弃废液；将吸附柱CB放回废液收集管中， 12000rpm离心2min;将吸附柱转入一个干净的离心管中，加入200ul 洗脱缓冲液TE( 60-70'C水浴预热)，混匀，室温放置5min， 12000rpm 离心30s;得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2min, 12000rpm 离心2min，离心得到的溶液即为基因组DNA溶液。最后在260nm 波长下检测DNA浓度。3. PCR扩增获得L7/L12基因以上述操作方法2所得到的基因组DNA为模板，设计引物(上 游引物5，- CTGTCAACAGTTCAAACCTTAAT -3， ( SEQ ID N0.3 ); 下游引物5，- AACATCCGCCAGAATAGTCC -3， ( SEQ ID N0.4 ))， PCR方法扩增目的基因片段。具体实验方案36.6ul灭菌六蒸水， 6.6ul MgCl2(25mM),各1.2ul上下游引物(100uM ), 6ul buffer (10xEx Taq Buffer, Mg2+free )， 4.8ul dNTP Mixture ( 2.5mM ), 3.0ul模板 (4.4326ug/ml )， 0.6ul Ex Taq DNA聚合酶(5U/ul )，于终体积为60ul 反应体系中进行如下PCR循环94。C预变性4min后，以94°C 30s、 55°C40s、 72。C40s反应35个循环，72。C延伸10min。反应结東后， 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为0.8%，电压为IIOV。 电泳结東后，用(离心柱型)琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天为时代)回收目的电泳条带(参照说明书)，得到目的基因片段。4.核糖体蛋白L7/L12基因序列测定将上述经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳并回收纯化得到的目的基 因片段连接入pMD19-T Simple Vector(购自大连宝生物TaKaRa公司) 中，并转化入感受态DH5a中，接种到LB细菌培养基平板(内含终 浓度为100ug/mlAmp, 0.5mMIPTG, 80ug/ml X-gal)培养12hr，进 行蓝白筛选。小心挑取筛选得到的阳性菌落接种到LB液体培养基中 (内含终浓度为100ug/mlAmp)进行扩增，37。C水浴摇床培养12hr。 取适量的阳性菌培养液，由上海生工生物工程有限公司进行DNA序 列测定。其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.l所示。将测定的核糖体蛋白L7/L12的基因序列结果与GenBank中公布 的DNA序列进行比较，结果显示，本发明获得的核糖体蛋白L7/L12 的基因序列与公布的布鲁氏杆菌核糖体蛋白L7/L12的基因序列存在 较多差异，为一个新的羊型布鲁氏杆菌核糖体蛋白L7/L12基因序列。
序歹IJ表<110>内蒙古人学<120>羊刑布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因、其编码蛋白及应用<130> <160> 4〈170〉 Patentln version 3.3<210> 1 <211> 438 <212> DNA<213> 羊节布兽氏杆菌M5菌株 〈220〉<221> CDS<222> (40). . (414)<400> 1ctgtcaacag ttcaaacctt aattatagga aatacaaaa atg get gat etc gca 54Met Ala Asp Leu Ala 1 5aag ate gtt gaa gac ctt teg gcc ctg acc gtt ctg gaa gcc get gag 102 Lys lie Val Glu Asp Leu Ser Ala Leu Thr Val Leu Glu Ala Ala Glu10 15 20ctg tec aag ctt etc gaa gag aag tgg ggc gtt teg get get get ccg 150 Leu Ser Lys Leu Leu Glu Glu Lys Trp Gly Val Ser Ala Ala Ala Pro25 30 35gtc get gtt get get gcc ggt ggc get gcc cct get get gcc gca gaa 198 Val Ala Val Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Glu40 45 50gaa aag acc gaa ttc gac gtc gtt etc get gac ggc ggc get aac aag 246 Glu Lys Thr Glu Phe A印Val Val Leu Ala Asp Gly Gly Ala Asn Lys55 60 65ate aac gtg ate aag gaa gtg cgc gca etc acc ggt etc ggc etc aag 294 lie Asn Val lie Lys Glu Val Arg Ala Leu Thr Gly Leu Gly Leu Lys 70 75 80 85gaa gcc aag gac ttg gtc gaa ggc get ccg aag get gtc卿gaa ggc 342 Glu Ala Lys Asp Leu Val Glu Gly Ala Pro Lys Ala Val Lys Glu Gly恥 95 100gcc teg aag gac gaa get gag aag ate aag gca cag etc gaa get get 390 Ala Ser Lys Asp Glu Ala Glu Lys lie Lys Ala Gin Leu Glu Ala Ala105 110 115ggc gcc aag gtt gaa etc aag taa gtttggacta ttctggcgga tgtt 438 Gly Ala Lys Val Glu Leu Lys <213>平.观布兽氏杆菌M5齒株 400> 2Met Ala Asp Leu Ala Lys lie Val Glu Asp Leu Ser Ala Leu Thr Val15 10 15Leu Glu Ala Ala Glu Leu Ser Lys Leu Leu Glu Glu Lys Trp Gly Val20 25 30Ser Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Pro35 40 45Ala Ala Ala Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Ala Asp50 55 60Gly Gly Ala Asn Lys lie Asn Val lie Lys Glu Val Arg Ala Leu Thr 65 70 75 80Gly Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Val Glu Gly Ala Pro Lys85 恥 95Ala Val Lys Glu Gly Ala Ser Lys Asp Glu Ala Glu Lys lie Lys Ala100 105 110Gin Leu G]u Ala Ala Gly Ala Lys Val Glu Leu Lys 115 120〈210〉 3 <211> 23 <212〉 DNA <213> 人l:序列〈400> 3ctgtcaacag ttcaaacctt aat<210〉 4<211> 20<212> DNA〈213〉 人丄序列<400〉 4aacatccgcc agaat.agtcc
权利要求
1、羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因，其编码具有下述氨基酸序列的蛋白a)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，或b)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2、 如权利要求l所述的基因，其具有如SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。
3、 含有权利要求1或2所述基因的表达载体。
4、 含有权利要求3所述表达载体的宿主。
5、 权利要求1或2所述基因编码的蛋白质。
6、 权利要求1或2所述的基因在制备核酸疫苗中的应用。
7、 权利要求1或2所述的基因在制备检测试剂盒中的应用。
8、
9、 权利要求5所述的蛋白质在制备蛋白疫苗中的应用。
10、 权利要求5所述的蛋白质在制备检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明提供了羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因、其编码蛋白质及应用。本发明所述的基因，其编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。利用本发明的基因可以用来制备基因疫苗，如通过本发明的序列设计合成siRNA或者shRNA或者是microRNA用于基因沉默。也可以通过制备本发明基因的表达蛋白，研发重组蛋白疫苗，或者是开发检测试剂盒，为布鲁氏菌病提供有新的有效的解决途径。
文档编号C12N15/31GK101153284SQ200610113530
公开日2008年4月2日 申请日期2006年9月29日 优先权日2006年9月29日
发明者旭日干, 石艳春, 郑源强 申请人:内蒙古大学