专利名称：检测JAK2V617F突变的方法及其专用引物与TaqMan－MGB探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及用分子生物学方法对突变碱基进行定性、定量检测的引物和探针，特别是涉及用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantification PCR，RQPCR)技术对骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变进行定性、定量检测的引物和TaqMan-MGB探针。
背景技术：
骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorders，MPDs)是一组由一种或多种造血细胞系或结缔组织成分异常增殖所引起的疾病。研究表明，MPDs与血液细胞过量产生或失去功能的血液疾病密切相关。四种主要的MPDs分别为慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、真性红细胞增多症(polycythemiavera，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)和原发性骨髓纤维化(idiopathic myelofibrosis，IMF)。其中，95％的CML患者存在BCR/ABL融合基因，PCR-BCR/ABL检测已成为用于CML诊断的常规项目，而其余三种MPDs分别是影响红细胞、巨核细胞、血小板及骨髓微环境的恶性肿瘤，长期以来，未发现特异的分子诊断标志。
2005年，有关MPDs发病机理研究的主要进展是发现部分PV、IMF和ET患者具有JAK2V617F突变，该突变是后天获得性的髓系细胞中JAK2激酶自氨基端第617位氨基酸残基由缬氨酸(V)突变为苯丙氨酸(F)，造成JAK2激酶活性增加，细胞生长信号系统获得活化，进而导致细胞异常增殖。这一发现，不仅使快速、可靠、准确诊断MPDs成为可能，而且可针对突变型JAK2开发出与格列卫类似的新的靶向疗法(格列卫目前正在被用来治疗慢性髓性白血病)，将为治疗MPDs提供一种新的治疗方法。
已发现74-97％以上的PV、23-57％的ET以及35-95％的IMF患者中JAK2V617F突变的检测结果呈阳性。在慢性髓性单核细胞白血病(CMML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)和急性髓性白血病(AML，尤其是M2、M6、M7型)患者中该突变的检测阳性率可达13-18％(其中CNL、CMML已被世界卫生组织新的分型归为MPD及MPD/MDS)；而在急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病及继发性红细胞增多症等疾病患者中该突变的检测结果为阴性，上述统计结果表明可将JAK2V617F突变的检测用于白血病的鉴别和诊断中。
由于MPDs病人可发展为急性白血病，如在PV患者体内发现的JAK2V617F突变与CD34+细胞数呈正比，且随病程进展突变量增加，因此发现该突变并进行相应治疗，将为该疾病的早期靶向治疗提供重要依据，以防病情进一步恶化。
目前，已报道的用于检测JAK2V617F突变的方法主要包括PCR直接测序和定性PCR等，这些方法普遍存在灵敏度低、特异性不高、费时费力且易污染等缺点，使应用受到一定限制。
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针(TaqMan探针)，探针只与模板特异结合，其结合位点位于两条引物之间，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。目前常用的TaqMan荧光探针为寡核苷酸，其5′端标记有报告荧光基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端标记有淬灭荧光基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；当探针与靶序列配对时，PCR延伸反应聚合酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR扩增过程中，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及未知模板的扩增曲线可对未知模板进行定量分析。但是，实际上，探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且，荧光基团也会产生不同波长的荧光，都会使得本底偏高。
针对TaqMan探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan-MGB探针(TaqManMinor Groove Binder Probe，TaqMan-MGB探针)，TaqMan-MGB探针是带有一个小沟结合物基团的寡核苷酸探针，工作原理与TaqMan探针相同，报告荧光基团连接在探针的5′端(如FAM、VIC等)，3′端标记有淬灭基团，不同的是淬灭基团为不发光的淬灭基团(Non-FluorescentQuencher，NFQ)，淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3’端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide，DPI3)，DPI3可折叠进由探针末端5-6bp核苷酸形成的小沟内。DPI3呈新月行，与B型DNA螺旋的浅深小沟一样螺旋，主要通过范德华力稳定。TaqMan-MGB探针显示了更强的序列特异性。可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值—而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高，一个15bp的MGB探针的信噪比大于6，优于理想状态下的25bp的普通TaqMan探针(信噪比约为1.5)。允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。
总之，与传统的TaqMan探针比较，TaqMan-MGB探针有以下优势MGB增加了探针熔点温度(Tm)，这样可使探针较短，尤其适合富含A/T的序列，并且提高配对与非配对模板间的Tm值差异，可进行更多重的PCR；提高信噪比，由于在探针的3′端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近，实验的结果更精确，分辨率更高；且实验步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高。
但是，目前尚没有专门用于检测DNA或cDNA上的JAK2V617F突变的实时荧光定量PCR检测技术，因为没有合适的引物和特异性荧光探针。
发明内容
本发明的目的是提供分别针对DNA和cDNA的用于对骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变进行定性、定量检测的引物。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA JAK2V617F突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2组成的引物对。
序列表中的SEQ ID №1由24个碱基组成，该序列为JAK2激酶基因(GenBank号NT_008413)自5’端第88559-88582位碱基的反向互补序列，SEQ ID №2由26个碱基组成，该序列为JAK2激酶基因自5’端第88405-88430位碱基，扩增片段长度为178bp。
用于检测骨髓增殖性疾病cDNA JAK2V617F突变的引物，是由序列表中SEQ IDNO3和SEQ ID NO4组成的引物对。
序列表中的SEQ ID №3由27个碱基组成，该序列为JAK2激酶基因(GenBank号NM_004972)cDNA的自5’端第2243-2269位碱基，SEQ ID №4由25个碱基组成，该序列为JAK2激酶基因cDNA的自5’端第2354-2378位碱基的反向互补序列，扩增片段长度为136bp。
本发明还提供了分别针对DNA和cDNA的对骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变进行定性、定量检测的TaqMan-MGB探针。
本发明所提供的TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的DNA序列；所述探针为经过荧光标记的，SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端不仅标记有不发光的淬灭基团，还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide，DPI3)。
所述报告荧光基团可为FAM、VIC等，不发光的淬灭基团可为NFQ(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)等。
将具有序列表中SEQ ID NO5的TaqMan-MGB探针命名为TaqMan-MGB Probe1，序列表中的SEQ ID №5由15个碱基组成，该序列为野生型JAK2激酶基因(DNA，GenBank号NT_008413)自5’端第88519-88533位碱基的反向互补序列，针对88526位的碱基G；同时，该序列为野生型JAK2激酶基因(cDNA，GenBank号NM_004972)自5’端第2336-2350位碱基的反向互补序列，针对2343位的碱基G。
将具有序列表中SEQ ID NO6的TaqMan-MGB探针命名为TaqMan-MGB Probe2，序列表中的SEQ ID №6由15个碱基组成，该序列为JAK2激酶(DNA，GenBank号NT_008413)JAK2V617F突变基因自5’端第88520-88534位碱基的反向互补序列，针对88526位的突变碱基T；同时，该序列为突变型JAK2激酶基因(cDNA，GenBank号NM_004972)自5’端第2337-2351位碱基的反向互补序列，针对2343位的突变碱基T。
本发明的另一个目的是提供一种检测骨髓增殖性疾病基因组DNA JAK2V617F突变的方法。
本发明所提供的检测骨髓增殖性疾病基因组DNA JAK2V617F突变的方法，包括以下步骤1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA；2)以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板，用由序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2组成的引物对及所述TaqMan-MGB探针进行PCR扩增；3)对步骤2)的扩增产物进行等位基因鉴别分析，若用于标记SEQ ID NO5的荧光染料发出的荧光强度呈S型增长，同时用于标记SEQ ID NO6的荧光染料发出的荧光强度无增长，表示野生型基因型GG；反之，表示纯合突变基因型TT；若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长，则表示杂合突变基因型GT；4)根据步骤3)的基因型分析结果进行判断，具有纯合突变基因型TT或杂合突变基因型GT的的受试者的JAK2V617F突变检测结果为阳性。
本发明还提供了一种检测骨髓增殖性疾病cDNA JAK2V617F突变的方法。
本发明所提供的检测骨髓增殖性疾病cDNA JAK2V617F突变的方法，包括以下步骤1)分离受试者的骨髓、外周血或组织的单个核细胞，提取RNA，再以RNA为模板用常规方法逆转录合成其cDNA；2)以受试者骨髓或外周血的cDNA为模板，用由序列表中SEQ ID NO3和SEQID NO4组成的引物对及所述TaqMan-MGB探针进行PCR扩增；3)对步骤2)的扩增产物进行等位基因鉴别分析，若用于标记SEQ ID NO5的荧光染料发出的荧光强度呈S型增长，同时用于标记SEQ ID NO6的荧光染料发出的荧光强度无增长，表示野生型基因型GG；反之，表示纯合突变基因型TT；若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长，则表示杂合突变基因型GT；4)根据步骤3)的基因型分析结果进行判断，具有纯合突变基因型TT或杂合突变基因型GT的的受试者的JAK2V617F突变检测结果为阳性。
在上述检测骨髓增殖性疾病基因组DNA或cDNA JAK2V617F突变的方法中，为便于对检测结果进行分析，可在步骤2)中添加阳性对照和阴性对照，其中，纯合突变基因型TT阳性对照可为来自HEL细胞的DNA或cDNA，野生型基因型GG对照可为来自K562细胞的DNA或cDNA，杂合突变基因型GT可为来自HEL细胞和K562细胞的DNA或cDNA的不同比例的混合物，并以JAK2V617F突变/JAK2总与ΔCt(CtJAK2V617F突变-CtJAK2野生)做标准曲线，测试样本的平均ΔCt代入标准曲线计算JAK2V617F突变/JAK2总。阴性对照可为不含DNA或cDNA的PCR扩增体系。
此外，根据步骤3)的分析结果，测试样本为杂合突变基因型GT的，可根据标准曲线计算JAK2V617F突变基因占JAK2总基因型(JAK2V617F突变/JAK2总)的百分比值。
本发明的第四个目的是提供一种检测骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变的试剂盒。
本发明所提供的检测骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变的试剂盒，可包括上述用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA或cDNA JAK2V617F突变的引物以及TaqMan-MGB探针。
通过提取待测样品的基因组DNA或由RNA经反转录合成的cDNA，再将本发明的引物和TaqMan-MGB探针结合实时荧光定量PCR检测技术，通过检测人JAK2基因中第617位缬氨酸(V)或苯丙氨酸(F)位点，可达到检测骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变的目的。本发明所提供的引物及探针可用于临床及科研中对JAK2V617F突变进行检测，不仅为MPDs的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，而且可进一步提供JAK2突变基因与野生JAK2基因的确切比值，从而可为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为JAK2基因第617位氨基酸位点野生基因型GG的扩增曲线图2为JAK2基因第617位氨基酸位点突变基因型TT的扩增曲线图3为JAK2基因第617位氨基酸位点杂合基因型GT的扩增曲线图4为检测部分样品的JAK2基因第617位氨基酸位点基因型分析结果图5为用定性PCR方法鉴定部分样品的JAK2V617F突变的结果图6为测序验证部分样品的JAK2V617F突变的结果图7为计算JAK2V617F突变基因占JAK2总基因型(JAK2V617F突变/JAK2总)的百分比值的标准曲线(DNA)图8为本发明JAK2V617F突变检测方法的灵敏度测定结果图9为用一条TaqMan-MGB探针在一管中检出突变基因型T的扩增曲线具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物、TaqMan-MGB探针的合成及序列测定工作均由上海基康生物技术有限公司完成。
实施例1、用于对骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变进行检测的引物和TaqMan-MGB探针的设计一、根据JAK2的基因组基因设计的用于对骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变进行检测的引物和TaqMan-MGB探针根据JAK2的基因组基因中包含第617位氨基酸残基(野生型为缬氨酸(V)，JAK2V617F突变体为苯丙氨酸(F))编码序列的基因序列(野生型JAK2基因的GenBank号NT_008413，JAK2V617F突变基因是将野生型基因自5’端第617位的缬氨酸的密码子GTC突变为苯丙氨酸的密码子TTC)及其反向互补序列用PrimerExpress Software 2.0软件设计一对PCR引物，同时根据野生型JAK2激酶基因及JAK2激酶JAK2V617F突变基因的反向互补序列设计2条TaqMan-MGB探针，将2条TaqMan-MGB探针的5’端分别标记报告荧光基团FAM(红色荧光)和VIC(绿色荧光)，3’端标记不发光的淬灭基团，并连接DPI3，引物、TaqMan-MGB探针序列及其解链温度和GC含量如表1所示
表1检测JAK2V617F突变的引物、探针序列及其解链温度和GC含量(DNA)
序列表中的SEQ ID №1由24个碱基组成，该序列为JAK2激酶基因(GenBank号NT_008413)自5’端第88559-88582位碱基的反向互补序列，SEQ ID №2由26个碱基组成，该序列为JAK2激酶基因自5’端第88405-88430位碱基，扩增片段长度为178bp；将具有序列表中SEQ ID N05的TaqMan-MGB探针命名为TaqMan-MGB Probe1，序列表中的SEQ ID №5由15个碱基组成，该序列为野生型JAK2激酶基因(DNA，GenBank号NT_008413)自5’端第88519-88533位碱基的反向互补序列，针对88526位的碱基G；将具有序列表中SEQ ID NO6的TaqMan-MGB探针命名为TaqMan-MGB Probe2，序列表中的SEQ ID №6由15个碱基组成，该序列为JAK2激酶(DNA，GenBank号NT_008413)JAK2V617F突变基因自5’端第88520-88534位碱基的反向互补序列，针对88526位的突变碱基T。
二、根据JAK2基因cDNA设计的用于对骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变进行检测的引物和TaqMan-MGB探针根据JAK2基因的cDNA中包含第617位氨基酸残基(野生型为缬氨酸，JAK2V617F突变体为苯丙氨酸)编码序列的基因序列(野生型JAK2基因cDNA的GenBank号NM_004972，JAK2V617F突变基因的是将野生型基因自5’端第617位缬氨酸的密码子GTC突变为苯丙氨酸的密码子TTC)及其反向互补序列用PrimerExpress Software 2.0软件设计一对PCR引物，同时根据野生型JAK2激酶基因及JAK2激酶JAK2V617F突变基因的反向互补序列设计2条TaqMan-MGB探针(序列与步骤一中相同)，将2条TaqMan-MGB探针的5’端分别标记报告荧光基团FAM和VIC，3’端标记不发光的淬灭基团，并连接DPI3，引物、TaqMan-MGB探针序列及其解链温度和GC含量如表2所示表2检测JAK2V617F突变的引物、探针序列及其解链温度和GC含量(cDNA)
SEQ ID №3由27个碱基组成，该序列为JAK2激酶基因(GenBank号NM_004972)cDNA的自5’端第2243-2269位碱基，SEQ ID №4由25个碱基组成，该序列为JAK2激酶基因cDNA的自5’端第2354-2378位碱基的反向互补序列，扩增片段长度为136bp。
序列表中SEQ ID NO5的TaqMan-MGB Probe1，由15个碱基组成，该序列为野生型JAK2激酶基因(DNA，GenBank号NT_008413)自5’端第88519-88533位碱基的反向互补序列，针对88526位的碱基G；同时，该序列为野生型JAK2激酶基因(cDNA，GenBank号NM_004972)自5’端第2336-2350位碱基的反向互补序列，针对2343位的碱基G。
序列表中SEQ ID NO6的TaqMan-MGB Probe2，由15个碱基组成，该序列为JAK2激酶(DNA，GenBank号NT_008413)JAK2V617F突变基因自5’端第88520-88534位碱基的反向互补序列，针对88526位的突变碱基T；同时，该序列为突变型JAK2激酶基因(cDNA，GenBank号NM_004972)自5’端第2337-2351位碱基的反向互补序列，针对2343位的突变碱基T。
实施例2、骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变的检测一、用根据JAK2基因组基因设计的引物和TaqMan-MGB探针进行骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变检测用实施例1步骤一中根据JAK2基因组基因设计的引物和TaqMan-MGB探针对MPDs患者，包括PV、ET、MF、未归类的MPDs，及AML、CML、ALL、CLL和非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、嗜酸细胞增多症、骨髓增生异常综合征(MDS)、难治性贫血(AA)、特发性血小板减少性紫癫(ITP)的骨髓标本进行骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变的检测，同时以正常供者骨髓(NDM)为对照，具体方法如下1)待测样品基因组DNA的提取按DNA zol试剂盒(购自美国Gibco公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取MPDs患者及正常骨髓移植供者(见表3)的骨髓标本的基因组DNA，方法为用EDTA抗凝，用淋巴细胞分层液(相对密度1.077g/L，上海华精高科技有限公司)分离出单个核细胞，将分离出的单个核细胞及用常规方法培养的HEL(纯合突变阳性对照)、K562细胞系细胞(阴性对照细胞)用生理盐水洗涤2次后，加入600μl DNA zol试剂，轻轻混合吹打后加入600μl无水冷乙醇，4℃、12000rpm离心1分钟，弃上清，将沉淀用80％的冷乙醇洗涤一次，室温干燥，用适量的灭菌注射用水溶解沉淀，最后用DNA/RNA紫外检测仪测定DNA含量及纯度，结果A260/A280＞1.8，表明所提取的DNA纯度较高。
2)PCR扩增以步骤1)提取的DNA为模板，在实施例1步骤一中所述引物F1、R1及TaqMan-MGB探针的引导下，用ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行PCR扩增，并按等位基因鉴别实验操作步骤(具体方法参见美国应用生物系统公司7300/7500实时定量PCR仪入门指南)完成并分析，即依次进行读取等位基因鉴别实验PCR扩增前信号、执行扩增程序及读取、分析扩增后信号。其中，PCR反应体系为1×TaqMan通用PCR扩增预混试剂(购自美国应用生物系统公司)，引物F1、R1各400nM，荧光标记的2条TaqMan-MGB探针各200nM，150ng DNA。PCR反应条件为先50℃2分钟；然后95℃10分钟；最后95℃15秒，60℃1分钟，共40个循环。
3)等位基因鉴别分析对步骤2)的扩增产物进行等位基因鉴别分析，若用于标记TaqMan-MGB Probe1的荧光染料FAM发出的红色荧光强度呈S型增长，同时用于标记TaqMan-MGB Probe2的荧光染料VIC发出的绿色荧光强度无增长，表示野生型基因型GG，扩增曲线见图1(纵坐标为荧光强度(Delta Rn)，横坐标为PCR扩增的循环数，大箭头指示的曲线表示红色荧光强度变化，小箭头指示的曲线为绿色荧光强度变化)；反之，表示纯合突变基因型TT，扩增曲线见图2中大箭头指示的曲线(纵坐标为荧光强度(Delta Rn)，横坐标为PCR扩增的循环数)；若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长，则表示杂合突变基因型GT，扩增曲线见图3(纵坐标为荧光强度(Delta Rn)，横坐标为PCR扩增的循环数，大箭头指示的曲线表示绿色荧光强度变化，小箭头指示的曲线表示红色荧光强度变化)，各基因型的部分结果如图4所示(横坐标表示等位基因X即等位基因T，纵坐标表示等位基因Y即等位基因G，图4中Allele X表示等位基因T，Allele Y表示等位基因G，Both表示GT杂合子，NTC表示阴性对照)。
4)结果判断根据步骤3)的基因型分析结果进行判断，具有杂合突变基因型GT或纯合突变基因型TT的待测样品的JAK2V617F突变检测结果为阳性，受试者为骨髓增殖性疾病患者。
检测结果如表3所示，对其中108份标本用等位基因特异引物(突变基因特异上游引物5’-agcatttggttttaaattatggagtatatt-3’；上游引物5’-atctatagtcatgctgaaagtaggagaaag-3’；下游引物5’-ctgaatagtcctacagtgttttcagtttca-3’)同时进行了定性PCR检测(方法见文献Ejoanna Baxter，Linda M Scott，Peter J Canpbell et al，Acquired mutationof the tyrosine kinase JAK2in human myeloproliferative disorders，Lancet，2005；3651054-61)，部分样品的检测结果如图5所示(泳道M为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp的DNA Marker)，可扩增出203bp条带的为JAK2V617F突变，两种方法检测结果的一致率达100％，此外，还对其中8例标本(阳性6例，阴性2例)用测序的方法进行了验证，测序检测结果如图6所示，与以上两种方法的检测结果一致。表明用本发明的引物、TaqMan-MGB探针及方法可对JAK2V617F突变进行检测，检测结果准确。
表3JAK2V617F突变在MPDs中的检出情况(DNA)
5)同时对阳性对照HEL细胞(100％纯合突变基因型TT阳性对照)的DNA依次用野生基因型GG对照K562细胞的DNA稀释为80％、40％、20％、10％、5％的比例，每梯度重复3-5管进行扩增，以其相应的平均ΔCt(CtJAK2V617F突变-CtJAK2 野生)做标准曲线为y＝-0.083x+0.1295，相关系数r＝0.999，其中Y代表不同的突变基因百分比，X代表平均ΔCt(CtJAK2V617F突变-CtJAK2野生)，测试样本的平均ΔCt代入上述标准曲线方程可计算出测试样本的突变基因百分比(JAK2V617F突变/JAK2总)。对上述部分阳性的MPDs患者的结果根据DNA标准曲线(见图7)计算其突变基因百分比(JAK2V617F突变/JAK2总)，结果平均值为20.58％±19.33％。
二、本发明骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变检测方法的灵敏度测定将HEL细胞(100％纯合突变基因型TT阳性对照)的DNA用野生基因型GG对照K562细胞的DNA依次稀释为2.5％、1.25％、0.6％、0.3％、0.16％、0.0001％(T/(G+T))的比例，按上述相同方法进行检测，结果在2.5％、1.25％、0.6％梯度均可检出基因型G和T的扩增曲线，表明本发明方法的检测灵敏度可达0.6％(见图8，纵坐标为荧光强度(Delta Rn)，横坐标为PCR扩增的循环数，从左至右依次为0.6％、2.5％、1.25％、2.5％、1.25％、0.6％(T/(G+T))的基因型G或T的扩增曲线，其中前3条(左起)为基因型G的扩增曲线，后3条为基因型T的扩增曲线)。
三、用根据JAK2cDNA基因设计的引物和TaqMan-MGB探针进行骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变检测再从部分MPDs患者(包括PV、ET、MF、未归类的MPDs及MDS，ALL，见表4)骨髓中分离单个核细胞，提取RNA，再以RNA为模板用常规方法逆转录合成其cDNA，再以此为模板，在实施例1步骤二中根据JAK2cDNA基因设计的引物和TaqMan-MGB探针的引导下用与步骤一相同的方法进行JAK2V617F突变检测，检测结果见表4，将该结果与步骤一的检测结果共同进行统计，结果如表5所示，表明用本发明根据JAK2cDNA基因设计的引物、TaqMan-MGB探针及方法可对JAK2V617F突变进行检测，检测结果准确。此外，对其中22例MPDs患者的DNA及cDNA标本同时用本发明的方法进行检测，阳性或阴性的检测结果一致，还对这22例中的8例标本同时进行了测序及等位基因特异定性PCR检测，检测结果均一致。上述检测结果表明用本发明的引物、TaqMan-MGB探针及方法可对JAK2V617F突变进行检测，检测结果准确。
表4JAK2V617F突变在MPDs中的检出情况(cDNA)
表5JAK2V617F突变在MPDs中的检出率(DNA及cDNA)
四、检测用一条TaqMan-MGB探针对JAK2V617F突变进行检测的灵敏度用一条TaqMan-MGB探针(SEQ ID NO6)，按上述相同方法在一管中检出突变基因型T的扩增曲线如图9所示，从左至右依次为80％、40％、20％、10％、5％、2.5％、1％、0.1％(JAK2V617F突变/JAK2总)的突变基因型T的扩增曲线，表明当该探针单独在一管中扩增时的检测灵敏度至少可达0.1％。此实验说明，根据临床需要，可在两管中分别扩增野生基因型G及突变基因型T，比在一管中同时扩增两个基因型的检测灵敏度高。
序列表<160>6<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tgctctgaga aaggcattag aaag 24<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2tatggacaac agtcaaacaa caattc 26<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3
ggataaagca cacagaaact attcaga 27<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4aaactcctga accagaatat tctcg25<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5ccacagacac atact 15<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6tccacagaaa catac 1权利要求
1.用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA JAK2V617F突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2组成的引物对。
2.用于检测骨髓增殖性疾病cDNA JAK2V617F突变的引物，是由序列表中SEQ IDNO3和SEQ ID NO4组成的引物对。
3.用于检测骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变的TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的DNA序列；所述DNA序列的5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端不仅标记有不发光的淬灭基团，还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽。
4.根据权利要求3所述的TaqMan-MGB探针，其特征在于所述报告荧光基团为FAM或VIC，不发光的淬灭基团为NFQ。
5.一种检测骨髓增殖性疾病基因组DNA JAK2V617F突变的方法，包括以下步骤1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA；2)以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的由序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2组成的引物对及权利要求3或4所述的TaqMan-MGB探针进行PCR扩增；3)对步骤2)的扩增产物进行JAK2激酶基因的等位基因鉴别分析，若用于标记SEQ ID NO5的荧光染料发出的荧光强度呈S型增长，同时用于标记SEQ ID NO6的荧光染料发出的荧光强度无增长，表示野生型基因型GG；反之，表示纯合突变基因型TT；若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长，则表示杂合突变基因型GT；4)根据步骤3)的基因型分析结果进行判断，具有纯合突变基因型TT或杂合突变基因型GT的受试者的JAK2V617F突变检测结果为阳性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤2)中添加阳性对照和阴性对照，其中，阳性对照为来自K562和/或HEL细胞的DNA，阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。
7.一种检测骨髓增殖性疾病cDNA JAK2V617F突变的方法，包括以下步骤1)分离受试者的骨髓、外周血或组织的单个核细胞，提取RNA，再以RNA为模板用常规方法逆转录合成其cDNA；2)以受试者骨髓或外周血的cDNA为模板，用权利要求2所述的由序列表中SEQID NO3和SEQ ID NO4组成的引物对及权利要求3或4所述的TaqMan-MGB探针进行PCR扩增；3)对步骤2)的扩增产物进行JAK2激酶基因的等位基因鉴别分析，若用于标记SEQ ID NO5的荧光染料发出的荧光强度呈S型增长，同时用于标记SEQ ID NO6的荧光染料发出的荧光强度无增长，表示野生型基因型GG；反之，表示纯合突变基因型TT；若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长，则表示杂合突变基因型GT；4)根据步骤3)的基因型分析结果进行判断，具有纯合突变基因型TT或杂合突变基因型GT的受试者的JAK2V617F突变检测结果为阳性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤2)中添加阳性对照和阴性对照，其中，阳性对照为来自K562和/或HEL细胞的cDNA，阴性对照为不含cDNA的PCR扩增体系。
9.一种检测骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物以及权利要求3或4所述的TaqMan-MGB探针。
全文摘要
本发明公开了用于检测JAK2V617F突变的方法及其专用引物与TaqMan－MGB探针。用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA JAK2V617F突变的引物，是由序列表中SEQ ID No1和SEQ ID No2组成的引物对。用于检测骨髓增殖性疾病cDNA JAK2V617F突变的引物，是由序列表中SEQ ID No3和SEQ ID No4组成的引物对。该TaqMan－MGB探针是序列表中SEQ ID No5和SEQ ID No6的DNA序列；所述DNA序列的5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端不仅标记有猝灭基团，还连接有二氢环化吲哚卟啉－三肽。本发明不仅为MPDs的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，而且可进一步提供JAK2突变基因与野生JAK2基因的确切比值，从而可为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。
文档编号C12N15/11GK1932038SQ20061011341
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者阮国瑞, 刘艳荣, 陈珊珊, 黄晓军, 李玲娣, 秦亚溱, 李金兰, 王峰蓉 申请人:北京大学人民医院