专利名称：盐藻的培养方法
技术领域：
本发明涉及藻类植物的培养方法，特别是涉及一种培养盐藻的方法。
背景技术：
盐藻是中国培养较早、培养方法比较成熟的藻种，具有生长速度快、有益代谢产物积累量大等特点。盐藻在胁迫环境中(高温、高盐和/或强光)可积累大量的β-胡萝卜素，最多高达藻细胞干重的14％，是自然界中β-胡萝卜素含量最高的生物之一。研究表明，β-胡萝卜素不仅是维生素A的前体和食品加工业的天然色素，还能防治癌症、肿瘤和心血管疾病以及老年性痴呆和白内障等与年龄有关的退化性疾病；以海水为培养基对盐藻进行培养时，还可积累大量的蛋白质，含量高达细胞干重的50-60％，其中包括人类必需氨基酸在内的18种氨基酸，是一种优良的蛋白饲料和人类食品加工原料；此外，盐藻在胁迫环境中还可积累大量的甘油，含量高达干重的80％。天然甘油是优质的化妆品原料，同时也是化工、轻工和医药工业的重要原料(杨雪梅，吴超员。盐藻的研究与开发。生命科学，1994，6(5)7-10)。现代药理学研究表明，盐藻和β-胡萝卜素还具有潜在的免疫调节(Zheng WF，Wang L，Shi F et al.Effectson cell immunity in mice by water extract of Dunaliella salina.中成药，2004，261031-1036；Amar EC，Kiron V et al.Enhancement of innate immunity in rainbowtrout(Oncorhynchus mykiss Walbaum)associated with dietary intake ofcarotenoids from nutural products.Fish & Shellfish Immunology，2004，16527-537)、抗肿瘤(刘成玉，王春波，蓝孝贞，段建华，仲维珍，谭润鸾.盐藻β-胡萝卜素对恶性肿瘤病人红细胞免疫粘附肿瘤细胞能力的影响.中国海洋药物，2000，130-32)、抗动脉粥样性硬化(王春波，蓝孝贞，张鲁平，张仁亮，周绪祥，王玉贞，赵丽丽，刘建国，张京浦.盐藻β-胡萝卜素对实验性动脉粥样性硬化预防作用的研究.中国海洋药物，1998，17-12)以及预防脂肪肝(王春波，蓝孝贞，张鲁平，张仁亮，张敏，王玉贞，王海青，周绪祥，张京浦，盐藻β-胡萝卜素对鹌鹑脂肪肝的影响，海洋与湖沼，1999，30658-662)等多种药理活性。基于β-胡萝卜素所具有的潜在的药用价值，使其具有了更高的商业价值。目前，盐藻的大量培养已经引起了研究人员的极大关注，尤其是关于β-胡萝卜素的生产方面。
目前，通常采用Medified Johnson’s培养基或富含无机营养元素的海水为培养基在光反应器或培养池中对盐藻进行培养，同时向光反应器或培养池中鼓入空气(García-González M.，Moren J， JP，Anguis V，Prieto A，Manzano C，Florencio FJ，Guerrer MG.Conditions for open-air outdoor culture of Dunaliellasalina in southern Spain.J.App.Phycol.2003，15177-184)。为了提高盐藻的生物量及β-胡萝卜素的积累量，研究人员还探索了不同的培养方式，如向培养基中添加NaHCO3(Hejazi MA，Wijffels RH.Effect of light intensity on β-caroteneproduction and extraction by Dunaliella salina in two-phase bioreactors.Bimol．Eng.2003，20171-175)或向培养基中鼓入CO2(Wilson PDG，Hilton MG，Waspe CR，Steer DC，Wilson DR.Production of13C-labelled β-carotene from Dunaliellasalina.Biotechnol.Lett.1997，19401-405)以补充碳源的不足，或采用自动化方式向培养池中添加营养矿物质(Suzenki T，Moci H.Automatic supplementationof minerals in fed-batch culture to high cell mass concentration.Biotechnol.Bioeng.1985，272-7)等方法促进盐藻生长。另外，在盐藻的培养过程中，影响盐藻生长速率和生物量积累的因素可能还包括溶解氧量、碳源、矿物质营养源、光强和温度。像许多其它浮游植物一样，盐藻在生长过程中也会向周围环境中释放一些低分子的可溶性有机碳(Giordano M，Davis JS，Bowes G.Organic carbon release byDunaliella salina(Chlorophyta)under different growth conditions of CO2，nitrogen and salinity.J.Phycol.，1994，30249-257)和多糖等有机大分子物质(Mykestad SM Release of extracellular products by phytoplankton with specialemphasis on polysaccharides. Sci. Total Enoviron.1995，165155-164)。经研究发现，藻类分泌的胞外多糖量高，从而使培养液的粘度较大，不利于藻类对营养物质的吸收，导致生长受到一定程度的抑制(苏传东.盐度和营养限制对蓝杆藻(Cyanothec.sp)113菌株生长和胞外多糖产量的影响，海洋湖沼通报，2005，469-73)。上述培养方法均不能解决盐藻培养过程中多糖对藻细胞生长的抑制问题，因而盐藻生物量和代谢产物(特别是β-胡萝卜素)积累量的提高效果均不显著。
发明内容
本发明的目的是提供一种可显著提高盐藻生长速率、生物量及β-胡萝卜素积累量的培养方法。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案一种培养盐藻的方法，是将盐藻在接种了芽孢杆菌的培养基中进行培养。
在上述培养方法中，所述盐藻培养基的选择是多种多样的，如海水、ModifiedJohnson’s培养基、f/12或ASP2等，优选为Modified Johnson’s培养基；所述盐藻的常规培养条件可为培养温度24-26℃，优选为25℃，光照强度100-150μmoles·m-2·s-1，优选为130μmoles·m-2·s-1，光照时间10-14h/天，优选为12h/天。
为获得较好的培养效果，所述培养方法优选为振荡培养，振速为100-150rpm，优选为130rpm。
所述芽孢杆菌的选择也是广泛的，如短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、腊质芽孢杆菌(Baillus cereus)、多粘性芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)或凝固芽孢杆菌(Bacillus coaglans)等芽孢杆菌中的一种或几种。
所述芽孢杆菌的接种量为10-1000cfu/mL，优选为100cfu/mL。
为进一步提高盐藻体内β-胡萝卜素的积累量，可在对数生长期，对盐藻进行高温、高盐和/或强光胁迫；所述高温胁迫的温度设为30-37℃，高盐胁迫的NaCl浓度设为3-5M，强光胁迫的光照强度设为500-900μmoles·m-2·s-1。
用上述培养方法获得的盐藻以及从中提取的β-胡萝卜素也是本发明要保护的。所述提取的β-胡萝卜素可以制备成抑制肿瘤、抗辐射等药物，还可作为食品色素，制成口服液、冲剂、口含片或水分散型干粉等多种剂型的天然胡萝卜素。
本发明提供了一种培养盐藻的方法。该培养方法是向常规培养盐藻的培养基中接种芽孢杆菌，芽孢杆菌可起到促进藻细胞生长和分裂的作用。实验证明，接种芽孢杆菌后，盐藻的生长速率、生物量及β-胡萝卜素积累量均得到显著提高，生长速率可达4.135×105/天，生物量可达846.88mg·L-1，β-胡萝卜素积累量可达125.4mg·L-1。本发明具有成本低，收益大，无污染，操作简单，易于进行规模化养殖的优点，将对盐藻和β-胡萝卜素产业的跨跃式发展起到重要的推动作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为接种不同密度的芽孢杆菌对盐藻生长影响的检测结果图2为接种不同密度的芽孢杆菌对盐藻生物量影响的检测结果图3为接种不同密度的芽孢杆菌对盐藻β-胡萝卜素含量影响的检测结果图4为接种不同密度的芽孢杆菌在胁迫条件下β-胡萝卜素积累情况的检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、盐藻的培养及接种不同密度的芽孢杆菌对盐藻生长速率的影响将盐藻按1×105cfu/mL的密度接种于Modified Johnson’s培养基(pH 7.5)中，同时按接种量分别为0(对照)、10、100、1000cfu/mL向培养基中接种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，在24℃，光照强度150μmoles·m-2·s-1，光照时间10h/天的条件下对盐藻进行培养，以检测不同密度的芽孢杆菌对盐藻生长速率的影响。培养到对数生长末期时，隔天在显微镜下用血球计数板计数，用公式K＝(N-N0)/T(N为经过T时间培养后单位体积的藻细胞数，N0为T时间培养初始单位体积藻细胞数，T为培养时间(天))计算盐藻的日平均生长速率(K)。接种不同密度芽孢杆菌后培养基中盐藻的细胞密度统计结果如图1所示，经计算，短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)接入量为100cfu/mL时盐藻的生长速率为最大，K100cells ml-1＝4.135×105，而短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)接入量为0时，盐藻的生长速率为最小，K0cells ml-1＝2.985×105，即接入短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)后，盐藻的最大日平均生长速率是最小日平均生长速率的1.385倍，表明用本发明的方法对盐藻进行培养，可使盐藻的生长速率得到大幅提高。
实施例2、盐藻的培养及接种不同密度的芽孢杆菌对盐藻生物量的影响将盐藻按1×105cfu/mL的密度接种于Modified Johnson’s培养基(pH 7.5)中，同时按接种量分别为0(对照)、10、100、1000cfu/mL向培养基中接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，在26℃，光照强度100μmoles·m-2·s-1，光照时间14h/天，100rpm的条件下对盐藻进行振荡培养，以检测不同密度的芽孢杆菌对盐藻生物量的影响。培养到对数生长末期时，取接种不同密度芽孢杆菌的藻液各400mL，4800rpm离心10min，弃上清，藻体去盐后，冷冻，真空干燥，称重，得出盐藻的生物量。生物量统计结果如图2所示，芽孢杆菌接入量为100cfu/mL时，盐藻的生物量为最多，达846.88mg·L-1，而芽孢杆菌接入量为0cfu/mL时，盐藻的生物量最少，仅达574.5mg·L-1，盐藻生物量积累量的多少顺序依次为S100cfu ml-1＞S1000cfu m1-1＞S10cfu ml-1＞S0cfu ml-1(S代表生物量)。上述统计结果表明在盐藻的培养过程中，接入一定量的芽孢杆菌可显著提高盐藻的生物量，但是，若接入过量的芽孢杆菌则盐藻的生物量会稍有下降，但是与对照比仍有大幅提高，证明用本发明的方法对盐藻进行培养，可使盐藻的生物量积累得到大幅提高。
实施例3、盐藻的培养及接入不同密度的芽孢杆菌对盐藻β-胡萝卜素积累量的影响将盐藻按1×105cfu/mL的密度接种于Modified Johnson’s培养基(pH 7.5)中，同时按接种量分别为0(对照)、10、100、1000cfu/mL向培养基中接种凝固芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)，在25℃，光照强度130μmoles·m-2·s-1，光照时间12h/天，130rpm的条件下对盐藻进行振荡培养，以检测接入不同密度的芽孢杆菌对盐藻β-胡萝卜素积累量的影响。培养过程中每隔3天测定盐藻的β-胡萝卜素积累量，方法为首先，根据文献(刘建国，吴超元。盐藻和β-胡萝卜素研究述评[J]。海洋与湖沼，1995，26(3)323-330)中的方法提取β-胡萝卜素，然后用722S分光光度计(购自上海分析仪器厂)测450nm的光吸收值，并按下式(式中D稀释倍数；2500为1％β-胡萝卜素纯品的百分吸收系数)计算β-胡萝卜素含量β-胡萝卜素(mg/L)＝OD450×D×10000/2500结果如图3所示，芽孢杆菌接入量为100cfu/mL时，盐藻的β-胡萝卜素积累量为最高，达125.4mg·L-1，而芽孢杆菌接入量为0cfu/mL时，盐藻的β-胡萝卜素积累量最低，仅为51.58mg·L-1，盐藻β-胡萝卜素积累量的多少顺序依次为W100cfu ml-1＞W1000cfu ml-1＞W10cfu ml-1＞W0cfu ml-1(W代表β-胡萝卜素积累量)；培养到对数生长末期时，向培养基中添加浓度为4.5M的NaCl进行盐胁迫，同时将光照强度设为600μmoles·m-2·s-1进行强光胁迫，约10-15天后直至藻体呈现橙色，然后用相同方法测定β-胡萝卜素的累积量，结果如图4所示(**表示极显著，P＜0.001)，经计算，芽孢杆菌接入量为100cfu/mL时，盐藻的β-胡萝卜素积累量最高，达125.4mg·L-1，其次是芽孢杆菌接入量为1000cfu/mL时，盐藻的积累量可达97mg·L-1；芽孢杆菌接入量为10cfu/mL时，盐藻的β-胡萝卜素积累量达到了85.08mg·L-1；芽孢杆菌接入量为0cfu/mL时，盐藻的β-胡萝卜素积累量最低，仅为51.58mg·L-1。上述统计结果表明在盐藻的培养过程中，接入一定量的芽孢杆菌可显著提高盐藻的β-胡萝卜素积累量，但是，若接入过量的芽孢杆菌则盐藻的β-胡萝卜素积累量会稍有下降，但是与对照比仍有大幅提高，证明用本发明的方法对盐藻进行培养，可使盐藻的β-胡萝卜素积累量得到大幅提高。
权利要求
1.一种培养盐藻的方法，是将盐藻在接种了芽孢杆菌的培养基中进行培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述盐藻培养基为海水、ModifiedJohnson’s培养基、f/12或ASP2培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述盐藻的常规培养条件为培养温度24-26℃，光照强度100-150μmoles·m-2·s-1，光照时间10-14h/天。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述培养温度为25℃，光照强度为130μmoles·m-2·s-1，光照时间为12h/天。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养方法为振荡培养，振速为100-150rpm。
6.根据权利要求1任一项所述的方法，其特征在于所述芽孢杆菌选自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、腊质芽孢杆菌(Baillus cereus)、多粘性芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)或凝固芽孢杆菌(Bacilluscoaglans)中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述芽孢杆菌的接种量为10-1000cfu/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法还包括在对数生长期，对盐藻进行高温、高盐和/或强光胁迫；所述高温胁迫的温度设为30-37℃，高盐胁迫的NaCl浓度设为3-5M，强光胁迫的光照强度设为500-900μmoles·m-2·s-1。
9.用权利要求1-8任一项所述方法获得的盐藻。
10.一种利用盐藻生产β-胡萝卜素的方法，是将盐藻在接种了芽孢杆菌的培养基中进行培养后，自获得的盐藻中分离β-胡萝卜素。
全文摘要
本发明公开了一种培养盐藻的方法。该方法是将盐藻在接种了芽孢杆菌的培养基中进行培养。实验证明，接种芽孢杆菌后，盐藻的生长速率、生物量及β－胡萝卜素积累量均得到显著提高，生长速率可达4.135×10
文档编号C12P23/00GK1923994SQ200610113359
公开日2007年3月7日 申请日期2006年9月25日 优先权日2006年9月25日
发明者郑维发, 杜彩华, 陈才法, 储成才 申请人:江苏省药用植物生物技术重点实验室