多肽、其生产方法及用图
【技术领域】
[0001]本发明具体特别涉及一种祀向人肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)的多肽、其生产方法以及应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]癌症是一种严重危害人类身体健康的重大疾病。世界卫生组织所属的“国际癌症研究机构”(IARC)预计，2030年癌症病例将达2140万例，死亡将超过1320万人。癌症的治疗与控制已成为现代医学一个亟待解决的难题。癌症治疗的常用手段主要有手术切除、放疗和化疗，但这些常规疗法常会带来多种副作用，如手术切除难以对浸润性肿瘤做到完全切除且易复发；放化疗对患者的健康组织会造成损伤，也容易产生抗药性。
[0003]鉴于常规治疗手段的缺陷与副作用，在抗癌药物研发领域，研究者们一直在致力于靶向治疗药物的研制。根据肿瘤发病机制以及涉及到的信号通路研制出的靶向治疗药物能精确且特异地靶向病灶，从而能够有效治疗肿瘤且大大降低对正常组织的副作用。
[0004]常见的抗肿瘤靶向治疗药物多是某影响肿瘤生长的细胞信号通路组分蛋白的单克隆抗体。目前已有多种靶向治疗药物进入了临床试验，也有药物通过FDA批准进入市场。如VEGF的单克隆抗体巴伐单抗,商品名Avastin,能抑制肿瘤新生血管的形成达到抑制肿瘤的生长的目的；HER2受体的单克隆抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab),商品名Herceptin,能靶向治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌。目前，单抗药物的研发已成为了靶向治疗药物的研制的一个重要的方向，但抗体药物研制的费用极高，生产成本也高，因此，目前常用的单抗药物价格也是极为昂贵的。另外，抗体的分子量大，对于结构紧密的实体瘤难以渗透到内部，这会影响其疗效的发挥。因此，寻找新的靶向药物分子是靶向药物研发的一个重要的方向。
[0005]多肽筛选成本较低，筛选周期也较短，改造方便，因此在靶向药物研制中备受关注。多肽分子量小，有较低的抗原性；且易于渗透进入细胞间隙，便于发挥作用；另外能通过多个靶点的靶向多肽组合形成多靶向药物，应用前景良好。
[0006]恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道，恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道，血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长，称肿瘤转移。肿瘤转移给肿瘤的治疗带来极大的困难，因此，如何抑制或减缓肿瘤的转移是肿瘤靶向治疗研究的一个重要的课题。人的肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)所激活的受体c_Met介导的信号通路是介导肿瘤细胞发生转移的重要途径之一，已经有多项研究证明C-Met通路的调节紊乱与受体或者配体的高表达有关，目前，已经有研究者筛选到了 C-Met的单克隆抗体或者多肽，而HGF的抗体也已经获得。
[0007]鉴于靶向多肽在作为靶向药物中的优势，筛选一种能够靶向HGF的多肽具有重要意义。
【发明内容】
[0008]本发明的目的之一在于提供一种多肽，其具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，能特异性靶向结合与肿瘤细胞迁移相关的信号通路组分一肝细胞生长因子，从而可以抑制HGF/c-Met信号通路相关的细胞迁移过程，细胞实验结果显示该多肽有抑制肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞迁移的作用，在抗肿瘤转移药物研发与制备中有广泛的应用前景。
[0009]本发明的目的之二在于提供用以编码前述多肽的、分离的多核苷酸。
[0010]本发明的目的之三在于提供包含用以编码前述多肽的多核苷酸的表达载体。
[0011]本发明的目的之三在于提供包含前述多核苷酸或前述载体的宿主细胞。
[0012]本发明的目的之四在于提供前述多肽在制备肿瘤细胞检测或诊断试剂盒的应用。
[0013]本发明的目的之五在于提供前述多肽在制备肝细胞生长因子靶向制剂的应用。
[0014]本发明的目的之五在于提供一种肿瘤细胞检测或诊断试剂盒，其包含前述的多肽。
[0015]本发明的目的之六在于提供前述多肽在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
[0016]本发明的目的之七在于提供一种抗肿瘤转移药物组合物，其包含可药用载体及前述的多肽。
[0017]关于本发明的具体内容，将在下文结合附图及相应实施例做详细解释说明。
【附图说明】
[0018]通过结合附图进行的示例性实施例的以下描述，本发明的这些和/或其他方面和优点将变得清楚和更易于理解，其中:
图1示出了前7轮筛选的PE荧光强度随着富集的次数增加不断加强的流式细胞仪记录的等高线图(PE指代藻红蛋白受激发所发出的荧光，SSC指代流式细胞仪检测的颗粒的侧向散射光数据；eCPX为筛选中使用的细菌展示多肽库原库的自命名，Ml代表完成了一次磁珠分选，缩小了库容的细菌展示多肽库子库，而F1-F6分别指代进行了 I至6次荧光激活细胞分选术分选得到的库容更小的子库)。
[0019]图2示出了在经过较为严格的洗涤条件下，单克隆菌clone I以及clone 2所带PE荧光的强度变化，间接地示出了两个细菌单克隆与HGF结合的比例变化情况。
[0020]图3示出了在孵育过程中使用不同的细胞因子干扰单克隆菌clone I和clone 2分别与HGF孵育后在流式细胞仪检测结合率汇总直方图(BSA指代牛血清白蛋白，VEGF指代血管内皮生长因子，bFGF指代碱性成纤维细胞生长因子，EGF指代表皮生长因子；另，图中*表示该数据与HGF组比较有显著性差异，0.01〈P〈0.05)。
[0021]图4示出了使用MTT法检测不同浓度的control p印tide，HGP-1和HGP-2多肽在独立使用时对人类非小细胞肺癌细胞系A549增殖的抑制作用(**表示该组数据与HGF组比较有极显著差异，P〈0.01)。
[0022]图5示出了使用细胞划痕法检测不同浓度的control p印tide，HGP-1和HGP-2多肽在独立使用时对人类黑色素瘤细胞系MDA-MB-435S迁移的抑制作用(**表示该组数据与HGF组比较有极显著差异，P〈0.01)。
具体实施方案
[0023]根据本发明的具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所具有的氨基酸序列的多肽是通过细菌表面展示多肽库和磁珠分选以及荧光激活细胞分选术筛选得到，得到的多肽可以与肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)特异性地结合，因此可望能够运用于靶向治疗肿瘤迁移的靶向药物研发中。
[0024]下面示例性实施例中未注明条件的实验方法可以按本领域内的常规的实验方法进行，例如，可以参照 Sambrook 等人的《Molecular cloning: a laboratory manual))(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。
[0025]1.构建细菌表面展示随机肽库
本发明所使用的细菌表面展示随机肽库是从美国加州大学圣巴巴拉分校化学工程系的Patrick S.Daugherty实验室获得。本实施例中选择大肠杆菌MC1061 [F_araD139D (ara-leu) 7696 galE15 galK16 D (lac) X74 rpsL (StrR) hsdR2 (rK-mK]3) mcrA mcrBl](Casadaban and Cohen, 1980)菌株进行细菌展不多肽库的构建,所用质粒为pBAD33。该细菌展示多肽库的构建过程如下。首先，对外膜蛋白(OmpX, outer membrane protein X)进行改造，用氨基酸序列GSKSRR把OmpX的C端和N端连上，并在OmpX第2个环(loop)的s53和s54残基之间打开,形成游离于胞外的C00H端和NH2端,成为CPX (circularlypermuted outer membrane protein OmpX)骨架(请参见 Rice et al.(2006) proteinSc1.15,825-836)。而把CPX骨架蛋白的165位的丙氨酸突变为亮氨酸，166位的甘氨酸突变为丝氨酸，成为 eCPX (enhance CPX)。(请参见 Jeffrey J.Rice et al.ProteinEngineering, Design & Select1n.2008, 21(7): 435 - 442.)将包含有 15个随机氨基酸的序列X15连接到CPX骨架的N端。把经过改造的质粒转化入大肠杆菌MC1061 [F_araD139D (