也法化ISA的检测方法，用含切3通 道的激光扫描仪对反应结束的玻片进行扫描成像，选用合适的激光扫描参数使芯片上最高 信号接近饱和，所得图像存储为tiff文件。然后用芯片读数软件将每个点的英光信号转化 为数码信号。通过梯度稀释的急性肾损伤标志物的标准样品的数码信号绘制每个急性肾损 伤标志物的信号与浓度标准曲线，然后通过相应的标准曲线计算出每个急性肾损伤标志物 在未知样品中的浓度。
[0017] 本发明所述的用于用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒，具有W下特点和 优点：
[0018] (1)在芯片的组成上，本发明采用活性环氧基团包被的标准组织玻片，实验表明， 活性环氧基团包被的玻片可W更有效地吸附包被抗体在芯片的表面，并且使抗体的稳定性 增加。
[0019] (2)在芯片的点样前采用特定的框架结构，优化了芯片点阵，使得样本可批量检 巧||，操作简便，样本用量小，互不交叉污染。
[0020] (3)在芯片的制备工艺上，控制温度为70-75F，湿度为40-45%，该样的芯片可W改 善点样的形态，使抗体在玻片上的分布更加均匀。同时，室温的过夜静置有利于抗体更有效 地固定在玻片上。除此W外，真空抽气干燥2小时并用抗水蒸气的塑料小袋抽气密封并于 4C保存。实验表明，用该种方法所保存的芯片使得抗体更有效地固定在芯片表面，并有效 地增加芯片保存的稳定性。
[0021] (4)在芯片微阵列的点阵上，本发明采用不同浓度的H种阳性对照，并考虑同时使 用H者的不同强度信号来标准化不同的微阵列。实验表明，本发明可W明显地改善芯片的 敏感度和重复性。
[0022] 采用本发明的多急性肾损伤标志物联合检测抗体芯片试剂盒，能够同时检测出20 种常用临床诊断急性肾损伤标志物，实现了多样本多指标的联合检测，克服了现有技术操 作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、 能在普通实验室推广和规模化等优点。该些检测指标可用于人群普查，有利于建立基线资 料。监测该些指标的变化有利于准确诊断，及时治疗，将大大提高治愈率，减低医疗费用。
【具体实施方式】
[0023] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，该 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0024] 实施例1 ;抗体芯片点样条件的确定。
[0025] 1、捕获抗体的点样浓度：将捕获抗体在不同的缓冲液中（无菌水，PBS缓冲液，含 不同浓度牛白蛋白的PBS，含不同浓度甘油的PBS缓冲液等）W 2x的浓度稀释，用非接触性 点样仪点在芯片表面，然后用夹也化ISA方法比较它的活性和稳定性。实验表明，用含有 0. Ol-lOg/lOOml牛白蛋白PBS缓冲液稀释捕获抗体具有最好的线性率和稳定性。
[0026] 2、点样的条件控制；在室温下把捕获抗体直接点在玻片表面时，捕获抗体的点容 易产生空也点，而且不同抗体点活性差异较大，并且在最后生成的图像往往发现会有拖尾 现象。本发明控制点样温度为70-75F，湿度为40-45%时所点的抗体点具有最好的形状，并 且发现将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，第二天真空抽气干燥2小时，然后把整 张芯片用不透气的小袋封装，用该种方法制备的玻片捕获抗体具有最佳的活性并且可W在 4C至少稳定六个月W上。
[0027] 实施例2 ;本发明所述的用于用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒的制 备。
[0028] 为了检测样品中是否存在相应的急性肾损伤标志物，制备固定有针对于如下急性 肾损伤标志物的特异性抗体的玻片：肾损伤分子1、白蛋白、骨桥蛋白、H叶因子3、目2-微 球蛋白、丛生蛋白、趋化因子配体16、非转移性黑色素瘤糖蛋白B、肝脂肪酸结合蛋白、单核 细胞趋化蛋白-1、可溶性肿瘤坏死因子受体1、巧结合蛋白-1、Y干扰素诱导蛋白10、脫抑 素C、肝细胞生长因子、巨瞻细胞移动抑制因子、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、基质 金属酶组织抑制剂-1、血管细胞粘附蛋白1、血管内皮生在因子。
[002引 1、抗体的来源：
[0030] 采用针对表1中所列蛋白质的特异性抗体，抗体的用途、来源、浓度均在表1详细 说明。所有的检测抗体均用Pierce长臂生物素标记试剂盒（Cat#131093)标记。具体方法 如下；将待标记的检测抗体在大量的IxPBS缓冲液（1毫升抗体在1升的PBS)中透析H次， 每次至少6小时。测定抗体浓度后按每毫克抗体加入80微克生物素DMS0溶液，混匀，在 室温下反应4小时。用PBS溶液对生物素标记的抗体进行透析，去除游离的生物素并标定 生物素标记的检测抗体浓度。
[0031] 表1蛋白质所对应的特异性抗体的用途、来源、浓度信息
[0032]
【主权项】
1. 一种用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： 抗体芯片，包括标准组织玻片和在标准组织玻片表面上固定的20种急性肾损伤标志 物的特异性抗体、三种阳性对照； 急性肾损伤标志物标准品混合物，是将20种急性肾损伤标志物标准品按照一定的量 混合在一起的冻干混合物； 生物素标记的急性肾损伤标志物检测抗体混合物；和 荧光素 Cy3标记的链霉亲和素。
2. 根据权利要求1所述的抗体芯片试剂盒，其特征在于：所述抗体芯片的基片是由活 性环氧基团包被的标准组织玻片，用2X8孔可拆卸型框架把玻片分割成16个互不干扰的 点样小区；所述16种急性肾损伤标志物的特异性抗体是采用非接触性点样方式固定在每 个点样小区内，每种特异性抗体、阳性对照均重复点样四次，以致在每个点样小区内形成 8X24矩阵的微阵列。
3. 根据权利要求1所述的抗体芯片试剂盒，其特征在于：所述的抗体芯片是将100 - IOOOpl的含0. 02-20ng特异性抗体的PBS缓冲液点样于所述玻片上，该PBS缓冲液含有 0. 01-10g/100ml牛白蛋白。控制点样温度为70-75F，湿度为40-45%，将点样好的玻片放于 室温条件下静置过夜，第二天真空抽气干燥2小时；干燥后的玻片装上配套的16孔框架把 一张玻片分割成16个互不干扰的小区。
4. 根据权利要求1所述的抗体芯片试剂盒，其特征在于：三种阳性对照是采用不同浓 度的生物素标记的小牛IgG，并作为不同微阵列间的标准化参照系。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性抗体为选自针对如下20种 急性肾损伤标志物的抗体：肾损伤分子1、白蛋白、骨桥蛋白、三叶因子3、β 2-微球蛋白、丛 生蛋白、趋化因子配体16、非转移性黑色素瘤糖蛋白Β、肝脂肪酸结合蛋白、单核细胞趋化 蛋白-1、可溶性肿瘤坏死因子受体1、钙结合蛋白-1、Y干扰素诱导蛋白10、胱抑素 C、肝细 胞生长因子、巨噬细胞移动抑制因子、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、基质金属酶组 织抑制剂-1、血管细胞粘附蛋白1、血管内皮生在因子。
【专利摘要】本发明涉及一种用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒。所述试剂盒包括：抗体芯片，包括标准组织玻片和在玻片表面上固定的20种急性肾损伤标志物的特异性抗体、三种阳性对照；急性肾损伤标志物标准品混合物，是将20种标准急性肾损伤标志物标准品按照一定的量混合在一起的冻干混合物；生物素标记的急性肾损伤标志物检测抗体混合物；和荧光素Cy3标记的链霉亲和素。本发明所述的试剂盒能够检测20个临床常用的急性肾损伤标志物，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。
【IPC分类】G01N33-68, G01N21-64, G01N33-533
【公开号】CN104569417
【申请号】CN201310476439
【发明人】黄若磐, 鲍伟胜, 陈蕴如, 陈巧林
【申请人】广州瑞博奥生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月12日