一种快速定量检测髓过氧化物酶的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验领域，具体设及一种快速定量检测髓过氧化物酶的均相巧光 免疫试剂及其制备方法。
【背景技术】
[000引髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO)是一种由活化的中性粒细胞、单核细胞、 巨瞻细胞分泌的相对分子质量为150000的白细胞酶，是糖基化的四聚体的血红素蛋白。多 形核嗜中性粒细胞是血管内MP0最主要的细胞来源，分泌的MP0占全部细胞蛋白质的4%， 占全部循环MP0含量的95%。MP0水平与中性粒细胞激活程度呈显著的相关性，可作为中 性粒细胞的活化标志物。
[0003] 目前已经研究发现在冠状动脉粥样硬化的斑块中有大量具有MP0活性的中性粒 细胞巨瞻细胞的浸润，提示其在粥样斑块的形成及进展中具有重要作用。已证实在急性冠 状动脉综合征（Acute coronary syn化omes，AC巧患者的易损斑块中存在大量中性粒细胞 的浸润。用免疫染色发现MP0大量聚集在早期动脉粥样硬化病变富含脂质区域的胆固醇裂 缝中。研究也证明在不稳定斑块中有许多含MP0阳性的巨瞻细胞，此型细胞积聚在腐蚀或 破裂斑块中可导致ACS，而人脂质条纹中的巨瞻细胞含少量或不含MP0。
[0004] 目前国际上已有两个大型的临床实验揭示MP0是一个预测ACS等不良事件的强有 力的指标，并且提示MP0作为一项炎症指标，它的变化是先于屯、肌的缺血性改变。从长远而 言，该指标的应用将可W挽救许多常规检查阴性或者是症状较轻然而病变很严重的患者。 对ACS患者研究发现与肌巧蛋白TCTnT)、C反应蛋白（MP0)等指标一样，血浆MP0水平可W 独立预测ACS患者屯、血管事件的发病危险。选择1090例ACS患者，测量血浆MP0水平，并 进行了 6个月的随访，记录非致命性屯、肌梗死和死亡事件，结果显示，患者血浆MP0水平与 血浆化T、可溶性CD40配体、MP0水平W及ST段的改变无关。但随着MP0水平升高（〉350g/ L，31. 3% )，患者发生观察终点事件的风险显著增加.尤其对判断TnT水平低于0. Olng/ml 的ACS患者的危险性意义更大
[0005] 采用前瞻性研究方法评价基线血浆MP0水平对胸痛患者屯、血管事件的预测价值。 研究人选了 604例胸痛发作2化内就诊的患者，从胸痛发作到就诊的平均时间化。男性354 例，女性254例。就诊时测定基线MP0、化T、MP0、肌酸激酶同工酶水平。并根据临床及实验 室检查明确诊断。W年龄大于21岁，没有冠状动脉疾病临床证据的115名志愿者为对照组 人群。预后评价指标为主要不良屯、脏事件包括MI、再次梗死、必要的血运重建或死亡。通 过回顾医疗记录和电话随访评价30d和6个月时的事件。结果发现病例组总体MP0水平比 对照组MP0显著增加；就诊后16h内发生MI的患者比无MI患者基线MP0水平高，就诊时无 明显屯、肌坏死证据的患者，4-1化内有TNT升高的患者比TNT持续阴性的患者，MP0明显升 高；随访30d和6个月进行血运重建或发生主要不良屯、脏事件的患者与无并发症的患者相 比，基线MP0水平升高，与570例存活的患者相比，死亡的34例患者MP0水平也升高。MP0 作为独立风险预测因子而言，整体人群和初始TnT阴性的患者，MI风险随着基线MPO四分位 数的增加而增加，MP0水平可作为30d和6个月时主要不良屯、脏事件的预测因子。研究TNT 阴性患者的临床预后时发现，无屯、肌坏死证据的462例患者，随访30d及6个月时，发生主 要不良屯、脏事件组基线MP0水平比无事件组明显升高。经多因素校正分析，证实MP0水平 是30d和6个月主要冠状动脉不良事件和血运重建的强独立预测因子。此外在筛选试验中 单独应用TnT可预测出58%主要不良屯、脏事件，但加上MP0预测准确性则可达84. 5%。
[0006] 临床实验室MP0检测一直采用酶联免疫定量检测方法，但操作步骤繁琐，时间较 长，且需要多种检测仪器设备，不利于ACS患者快速检测和及时诊治的临床需求。目前发展 的金标试纸检测MP0的方法，虽然满足了临床快速检测的要求，但不能实现定量检测迫切 需求。因此，建立一种检测时间尽量缩短，并且检测除了能在实验室进行外，还要求能够进 行床旁检测，同时能定量测定MP0的检测方法，从而为临床提供准确的诊断依据，是十分必 要的。
[0007] 均相巧光分析法化omogeneous fluoroimmunoassay，HFIA)是在时间分辨巧光免 疫分析（time-resolued fluoroimmunoassay，TRFIA)技术的基础上形成的一种新的巧光免 疫分析技术。TRFIA技术采用的巧光物质与传统的巧光染料完全不同，采用的是铜系元素 館巧U)、得（Tb)等作为巧光材料，灵敏度非常高，稳定性好，低温条件可保存=年，因而成 为二十一世纪最热口的免疫分析技术。
[000引均相巧光免疫检测法是用同一抗原的两个抗体分别标记化和巧光染料 Alexa647。化标记抗体在游离状态时，受到340nm光线激发，只发射平均波长为615nm 巧光，而在抗原、抗体复合物形成时，发生能量传递，激发巧光染料Alexa647发射出665nm 巧光。标记抗体直接与待测样品进行抗原、抗体反应，如果能形成抗原、抗体复合物，则在 665nm出可测得巧光信号。该种方法省却了酶联免疫法反复解育和洗板等烦琐操作步骤，几 分钟就能获得结果，省时省力。并且，此法也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境 等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。此外，Eu 3+和 Alexa647该对巧光物质的最大发射光波长之间相差较大，未发生抗原抗体反应的本底巧光 值就非常低。而人血清中非特异性物质产生的300-500nm巧光，不能激发Alexa647发射巧 光信号650nm激发光。因此非特异性巧光非常低。
[0009] 本发明采用均相巧光免疫快速检测技术，利用巧光的高灵敏特点，同样也避免了 胶体金或者巧光MP0干式免疫试纸中的硝酸纤维素膜本身孔隙不均一特性对检测准确度 和重复性的不良影响。由于均相巧光免疫检测中样品与巧光标记抗体全过程都在液相中全 面接触，反应充分，因此可大幅度提高检测灵敏度和线性范围，同时反应在液相进行也增加 了样品的稀释倍数，消除了样品的基质效应影响，使定量结果有很好的可重复性，提高了定 量结果的精密度和准确度，可满足临床诊断大规模检测的要求。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有MP0检测技术的不足，提供一种快速定量检测MP0的 均相巧光免疫试剂组。本发明根据巧光免疫技术特点和MP0抗原抗体系统特点，设计新的 原材料，试剂和工艺流程，应用本发明提供的试剂组检测MP0水平，具有简单，快速，灵敏和 特异性好等特点，可同时定量检测高值和低值样品，并且性价比高，适用于临床快速检测。
[0011] 本发明的第一个方面是提供一种快速定量检测髓过氧化物酶的均相巧光免疫试 剂组，包括稀±元素馨合物标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体（anti-MPO)、近红外巧光化 合物标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体和系列浓度的髓过氧化物酶校准品。
[0012] 优选地，稀±元素馨合物为化馨合物。
[001 引更优选地，稀±元素馨合物为 BHHCT-Eu3+或 1，2-二（1"，1"，1"，2"，2"，3"，3"-走 氣-4"，6"-己二酬-6"-基-对节基）-4-氯横酷基苯与館（III)的配合物炬HHBCB-Eu3+)。
[0014] 优选地，所述近红外巧光化合物为Alexa系列近红外巧光化合物、DyLi曲t系列近 红外巧光化合物和CF系列近红外巧光化合物中的至少一种。
[0015] 更优选地，所述近红外巧光化合物Alexa647、DyLi曲t-DY647和CF647中的至少一 种。
[0016] 优选地，所述系列浓度的髓过氧化物酶校准品由校准品稀释液稀释髓过氧化物酶 配制而成，所述校准品稀释液为含0. 01-0. 5wt%阳G2000、l-5wt% BSA、0. 01-0. 05wt%表 面活性剂的磯酸盐缓冲液。
[0017] 髓过氧化物酶校准品可用塑料瓶密封包装。
[001引本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的均相巧光免疫试剂组的制 备方法，包括W下步骤：
[0019] 1)稀±元素馨合物标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：
[0020] 取0. 5-5mg/ml的抗髓过氧化物酶单克隆抗体溶液，加入0. 05-0. 5mol/L的化肥化 溶液后，调抑至8. 5-10,滴加10-100 y g/ml配体化合物溶液，揽拌反应0. 6-化，分离得 到配体化合物标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体，加入终浓度为0. 05-0. 5wt %的BSA和 0. 01-lwt %的NaNs，调抑至5. 5-6. 5,免疫分析前，加入Eu3+溶液，使配体化合物与化等 摩尔浓度，即得，其中，抗髓过氧化物酶单克隆抗体溶液、NaHC〇3溶液和配体化合物溶液的 体积比为 0. 1-1 : 1 : 0.01-0. 05 ;
[0021] 2)近红外巧光化合物标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：
[0022] 将抗髓过氧化物酶单克隆抗体用0. 05-0. 5mol/L的NaHC〇3溶液稀释至0. 5-5mg/ ml,加入近红外巧光化合物溶解液，揽匀，室温解育0. 5-化，分离得到近红外巧光化合物标 记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体；
[0023] 3)系列浓度的髓过氧化物酶校准品的制备；
[0024] 将髓过氧化物酶用校准品稀释液稀释配制成系列浓度，即得，
[0025] 其中，1)、2)和3)的顺序可W任意颠倒。
[0026] 其中，稀±元素馨合物标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用于免疫分析时，用标 记物稀释液稀释使用，2-8 °C分装保存。
[0027] 其中，近红外巧光化合物标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用磯酸盐缓冲液稀 释，2-6 °C保存。
[002引其中，髓过氧化物酶校准品2-6°C保存。
[0029] 优选地，抗髓过氧化物酶单克隆抗体在于配体化合物反应之前，先进行透析处理。
[0030] 优选地，步骤1)中配体化合物为BHHCT或BHHBCB。
[0031] 优选地，步骤1)中分离得到配体化合物标记的anti-MPO通过离屯、和柱层析方式 进行。柱层析采用Se地adexG-SO柱，0. 01-0. Imol/L畑4肥〇3(p服.0)洗脱。
[0032] 优选地，步骤2)中，分离得到近红外巧光化合物标记的anti-MPO通过柱层析的方 式进行。
[0033] 进一步优选地，步骤2)中，柱层析采用G25凝胶柱。
[0034] 优选地，步骤2)中，室温解育时，每隔10-20min混匀一次。
[0035] 本发明的均相巧光免疫试剂的使用；先将稀±元素馨合物标记的anti-MPO溶液 加入反应微孔中，再加入近红外巧光化合