氧化铜‑铂纳米复合体在抗菌方面的应用的制作方法

本发明涉及纳米材料领域，具体地说，涉及一种能高效产生活性氧自由基的氧化铜-铂纳米复合体在抗菌方面的应用。

背景技术：

由细菌感染引起的疾病，日益成为威胁人类健康的罪魁祸首之一。如：霍乱、肺炎、疟疾、结核及肝炎等，都是由于细菌或微生物传播而引起的。在生物医学移植物、手术设备、工业管道等器械中，细菌集落和生物膜又是引起一些传染性疾病暴发和医院获得性感染的主要原因。细菌集落及生物膜可以在外围形成保护屏障，使得传统的抗菌治疗以及免疫响应不能彻底清除这些病原灶。抗生素的问世，为人类战胜这些疾病提供了有效的治疗途径。但是，抗生素滥用会引起细菌耐药性的急剧增加，导致许多药物无法治疗的“超级感染”，如：耐甲氧西林金黄葡萄球菌的感染等。在2002年，大约有170万病人遭受了医院获得性感染，其中一半人是由于泌尿管和中心静脉留置导管灭菌不彻底而引发的二次感染。

随着纳米科技的发展，越来越多的无机纳米抗菌材料也应运而生。无机抗菌材料具有低毒性、耐热性、耐久性、持续性、抗菌谱广等优点，日益成为生活制品的最佳选择。无机抗菌材料又以含金属离子金属氧化物型抗菌剂和半导体光催化型抗菌剂为主。金属离子金属氧化物型抗菌剂是利用金属本身所具有的抗菌能力来达到抗菌目的，例如银系列的抗菌材料。银离子本身就可以通过电荷引力吸附在细菌表面，破坏细胞壁，并与菌体内的巯基基团反应，使得蛋白凝聚，下调破坏细菌的细胞合成酶的活性，使细胞丧失分裂增殖能力而死亡。但是这类抗菌剂一般成本较高，稳定性差，生物安全性评价不完善，并且长期暴露于材料下也会影响人类的健康。

氧化铜-铂纳米复合体是首先通过水热法制备得到的氧化铜纳米片，然后在氧化铜纳米片的分散液中，通过硼氢化钠还原氯铂酸得到的。经试验发现，其对细菌(如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)具有一定的抗菌作用，但抗菌效果并不十分理想。若能基于该纳米复合体开发一种使其强效抗菌的途径，将对由细菌引发的传染病的防治十分有利。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供氧化铜-铂纳米复合体在抗菌方面的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了氧化铜-铂纳米复合体在抗菌方面的应用，具体为利用氧化铜-铂纳米复合体与过氧化氢共同作用，引起细胞内活性氧自由基含量的增加，进而引起细菌内部氧化应激失调，达到抑菌目的。

作为优选，上述应用针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用格外显著，因此，优选所述细菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。

进一步地，当所述细菌为大肠杆菌时，所述氧化铜-铂纳米复合体的作用浓度为10～20μg/mL，所述过氧化氢的作用浓度为40～60μM。作为优选，所述氧化铜-铂纳米复合体的作用浓度为15～20μg/mL，所述过氧化氢的作用浓度为45～55μM。更为优选，所述氧化铜-铂纳米复合体的作用浓度为20μg/mL，所述过氧化氢的作用浓度为50μM。

进一步地，当所述细菌为金黄色葡萄球菌时，所述氧化铜-铂纳米复合体的作用浓度为10～20μg/mL，所述过氧化氢的作用浓度为250～450μM。作为优选，所述氧化铜-铂纳米复合体的作用浓度为15～20μg/mL，所述过氧化氢的作用浓度为250～350μM。更为优选，所述氧化铜-铂纳米复合体的作用浓度为20μg/mL，所述过氧化氢的作用浓度为300μM。

进一步地，所述抗菌表现为抑制细菌生长和/或清除细菌生物膜。

第二方面，本发明提供了一种抗菌剂，包括氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢。该抗菌剂现用现配，针对不同细菌将氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢按照上述优选方案组合即可。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明利用氧化铜-铂纳米复合体材料和过氧化氢共同作用，产生大量活性氧自由基。在正常的生理状态下，活性氧自由基受到机体自身的酶(超氧化物歧化酶等)和小分子(抗坏血酸等)的调节，使其处于稳态，不会对机体产生伤害。一旦稳态被打破，引起细胞内活性氧自由基含量的增加，进而引起细菌内部氧化应激失调，达到抑菌目的。所述氧化铜-铂纳米复合体材料不仅可以有效地抑制细菌生长而且还能清除细菌生物膜。

附图说明

图1是实施例1所述氧化铜-铂纳米复合体的透射电镜图。

图2是氧化铜-铂纳米复合体对细菌胞内活性氧自由基含量的影响图。

图3是不同浓度的氧化铜-铂纳米复合体对两种细菌的抑制效果图。

图4是氧化铜-铂纳米复合体对细菌生长状态的荧光强度图。

图5是氧化铜-铂纳米复合体对细菌生物膜破坏的效果图。

图6是不同浓度的过氧化氢对细菌存活率的影响图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例使用的原料包括：

1、来自美国典型培养物收藏中心(ATCC)的大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 6538。

2、液体LB培养基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1mol/L NaOH调pH至7.4，高压蒸汽灭菌20min。

3、固体LB培养基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，15g/L琼脂，1mol/LNaOH调pH至7.4，高压蒸汽灭菌20min。

4、液体TSB培养基配方：胰蛋白胨17g/L，大豆木瓜蛋白酶消化物3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，1mol/L NaOH调pH至7.4，高压蒸汽灭菌20min。

下述实施例中细菌悬浮液的制备方法为：通过无菌操作，使用接种环将两种细菌接种于LB培养基中，37℃、150rpm过夜培养。

下述实施例中细菌生物膜的培养方法为：(1)通过无菌操作，在24孔板中加入900μL TSB培养基。(2)将对数生长期的细菌分别取100μL加入每孔。(3)将24孔板静止于培养箱中孵育48小时，37℃，每个12小时更换新鲜TSB培养基。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1氧化铜-铂纳米复合体的制备

1、氧化铜纳米片制备

将0.5g二水合氯化铜和0.5g CTAB溶解在15mL水中，并加入1mL氢氧化钠溶液(0.3g/mL)；将上述反应溶液移入20mL反应釜中，120℃反应6h。反应结束后，经离心、洗涤，得到氧化铜纳米片。

2、氧化铜-铂纳米复合体制备

首先，取660μL氧化铜纳米片(170mg/L)加入到2.34mL超纯水中，超声10min，使其均匀分散。然后，向上述混合液中加入23.5μL H₂PtCl₆·6H₂O水溶液(19.3mM)。最后，在冰浴下，快速搅拌并逐滴加入1mL NaBH₄水溶液(4.8mM)，滴加结束后继续搅拌2h。反应结束后，经离心、洗涤，得到氧化铜-铂纳米复合体。氧化铜-铂纳米复合体的透射电镜图如图1所示，从图中可见，铂纳米颗粒均匀地分布在氧化铜片上。

实施例2氧化铜-铂纳米复合体在抗菌方面的应用

1、氧化铜-铂纳米复合体对细菌胞内活性氧自由基的测量

步骤：(1)收集对数生长期的细菌，用0.01M的PBS洗涤，并调节其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的离心管中。(2)向离心管中加入终浓度为20μg/mL氧化铜-铂纳米复合体，并同时加入过氧化氢。对于大肠杆菌过氧化氢终浓度为(50μM)，金黄色葡萄球菌过氧化氢终浓度为(300μM)。(3)将上述离心管放置于培养箱中，37℃、150rpm，作用3小时。(4)向上述体系中，加入荧光探针DCFH-DA(100μM)，37℃、150rpm，孵育30分钟。(5)用酶标仪测定激发在485nm，发射在530nm处的荧光值。(6)计算细菌细胞内活性氧自由基的含量。

2、氧化铜-铂纳米复合体对细菌存活率的评价

(A)稀释平板法

步骤：(1)收集对数生长期的细菌，用0.01M的PBS洗涤，并调节其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的离心管中。(2)向离心管中加入终浓度分别为5、10、15和20μg/mL氧化铜-铂纳米复合体，并同时加入过氧化氢。对于大肠杆菌过氧化氢终浓度为(50μM)，金黄色葡萄球菌过氧化氢终浓度为(300μM)。(3)将上述离心管放置于培养箱中，37℃、150rpm，作用3小时。(4)通过无菌操作，将上述混合物稀释10倍，然后取100μL涂布于LB平板上，每个处理三次重复。(5)将上述涂布的培养皿放置于37℃培养箱中培养24小时。(6)通过统计菌落数，初步得到氧化铜-铂纳米复合体对细菌生长的抑制情况。

(B)荧光强度法

步骤：(1)收集对数生长期的细菌，用0.01M的PBS洗涤，并调节其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的离心管中。(2)向离心管中加入终浓度为(20μg/mL)氧化铜-铂纳米复合体，并同时加入过氧化氢。对于大肠杆菌过氧化氢终浓度为(50μM)，金黄色葡萄球菌过氧化氢终浓度为(300μM)。(3)将上述离心管放置于培养箱中，37℃、150rpm，作用3小时。(4)通过无菌操作，将上述混合物分别加入1.5μL STYO 9和PI两种荧光染液，每个处理三次重复。STYO 9可以标记所有的细胞，而PI只能标记受损的细胞，引起STYO 9的绿色荧光下降，进而区分活细胞和死细胞。(5)通过离心去除多余染液，然后用酶标仪分别记录激发在480nm，发射在500nm和激发在490nm，发射在550nm处的荧光信号。(6)通过统计荧光强度，进一步得出氧化铜-铂纳米复合体对细菌生长的抑制情况。

3、氧化铜-铂纳米复合体对细菌生物膜的破坏

步骤：(1)用0.01M PBS对上述培养48小时的生物膜清洗，去除残余培养基。(2)向24孔板中加入终浓度分别为5、10、15和20μg/mL氧化铜-铂纳米复合体，并同时加入过氧化氢，用PBS补足体积至1mL。对于大肠杆菌过氧化氢终浓度为(50μM)，金黄色葡萄球菌过氧化氢终浓度为(300μM)。(3)将上述24孔板放置于培养箱中，37℃静止作用3小时。(4)通过无菌操作，使用移液枪移除作用后的混合液，用PBS进行两次清洗。(5)向24孔板中加入500μL甲醇，固定生物膜15min。(6)每孔加入300μL结晶紫染液(1％)，静止染色30min。(7)去除多余染液，并用PBS清洗两次后，用数码相机对孔底部的生物膜进行拍照。(8)每孔加入1mL乙醇，提取吸附在生物膜上的染液，并使用酶标仪测定其在595nm处的吸收值。(9)计算氧化铜-铂纳米复合体对细菌生物膜的破坏程度。

对比例1

本对比例与实施例2的区别在于：在实施例2的各项实验中，均不加入过氧化氢。并与实施例2所得结果进行对比，结果见图2～图5。

其中，图2为氧化铜-铂纳米复合体对细菌胞内活性氧自由基含量的影响图。如图2所示，只加入过氧化氢时，细菌胞内的活性氧自由基没有出现剧增，由此推断，该浓度下的过氧化氢不会对细菌的生长产生影响。只加入氧化铜-铂纳米复合体时，细菌胞内的活性氧自由基会有所增加。如果同时使用氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢时，细菌胞内的活性氧自由基会呈现倍数性增加。氧化铜-铂纳米复合体联合过氧化氢时，会导致大肠杆菌内部活性氧自由基有2.7倍的增加；也会引起金黄色葡萄球菌内部活性氧自由基有8.2倍的增加。

图3为氧化铜-铂纳米复合体对两种细菌的抑制效果图。如图3A和3B所示，在5μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的联合作用下，两种细菌的存活率已经明显下降至50％左右。没有过氧化氢存在时，5μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体对两种细菌的存活率影响极小，可以忽略不计。在10μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的联合作用下，两种细菌的存活率已经明显下降至30％以下。若没有过氧化氢辅助时，仅10μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体对细菌的生长影响极小，可以忽略不计。在15μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的联合作用下，两种细菌的存活率已经明显下降至10％以下。没有过氧化氢存在时，只15μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体作用下，其对细菌的生长影响极小，可以忽略不计。在20μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢联用作用下，两种细菌的存活率已经明显接近0％。无过氧化氢辅助时，仅氧化铜-铂纳米复合体作用时，细菌依旧维持很高的存活率。图3C和3D分别为对应处理条件下平板菌落图，从平板图中可以明显发现，5μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的联合作用抑菌效果要好于单独的氧化铜-铂纳米复合体的抑菌效果。10μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的联用能在一定程度上抑制细菌生长，使得平板上的细菌菌落数有明显减少。而无过氧化氢存在时，仅10μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体时，平板上依旧会形成大量的细菌菌落。15μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的联用能显著地抑制细菌生长。20μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的联用能强烈地抑制细菌生长，平板上仅有很少的菌落。由此可知，氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的联用抑菌效果要优于单独的氧化铜-铂纳米复合体或过氧化氢的抑菌效果。

图4为细菌生长状态的荧光强度对比图。当细菌受到损伤时，红色荧光分子就会渗透至细菌内部，标记其核酸，使得绿色的荧光强度下降。如图所示，细菌生长状态良好时，其绿色荧光强度越高，红色荧光强度就会越低，其两者的比值就会很大。单独的过氧化氢，能使的两者的荧光比值下降，说明过氧化氢对细菌的生长还是产生了部分影响。荧光标记法相对于平板计数法更加灵敏地显示出细菌的生长状态。在氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的连用下，荧光比值会降低到0，说明氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢共同作用，产生活性氧自由基，用于抑制细菌生长。仅氧化铜-铂纳米复合体或过氧化氢作用时，荧光比值并没有出现显著性下降，说明其单独使用的抑菌效果不如联合作用的抑菌效果。

图5所制备的氧化铜-铂纳米复合体对细菌生物膜破坏的效果图。如图5A和5B所示，5μg/mL氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢联用时，不能有效地分解细菌生物膜。10μg/mL氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢联用时，能部分地分解细菌生物膜。15μg/mL氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢联用时，能很大程度地分解细菌生物膜。20μg/mL氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢联用时，能有效地分解细菌生物膜。图5C和5D是对应24孔板中的残存细菌生物膜照片，相对于空白组而言，5μg/mL氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢联合处理组中仍有大量残留生物膜。10μg/mL氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢联合处理组中，孔底残留的生物膜有所减少。而单独10μg/mL的氧化铜-铂纳米复合体处理下，孔底部的细菌生物膜并没有出现裂解，在孔底部依旧有大量细菌生物膜滋生。15μg/mL氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢联用处理组中，孔底残留的生物膜有大量减少。然而，单独15μg/mL氧化铜-铂纳米复合体作用时，其对细菌生物膜并没有任何影响，孔底部依旧有大量生物膜。20μg/mL氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢联用的处理组中，孔底仅有少许残留的细菌生物膜，因此其着色效果最差。由此可知，氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的联用能够有效地分解细菌生物膜，并且其分解效果要优于单独的氧化铜-铂纳米复合体或过氧化氢作用的效果。

实施例3

本实施例通过比较过氧化氢浓度对细菌存活率的影响，对过氧化氢的用量进行优化。

步骤：(1)收集对数生长期的细菌，用0.01M的PBS洗涤，并调节其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的离心管中。(2)向离心管中加入不同浓度的过氧化氢。使对于大肠杆菌过氧化氢终浓度分别为5μM、10μM、25μM、50μM、100μM，金黄色葡萄球菌过氧化氢终浓度分别为10μM、30μM、100μM、300μM、900μM。(3)将上述离心管放置于培养箱中，37℃、150rpm，作用12小时。(4)用酶标仪测定吸收在600nm处的值。(6)计算细菌存活率。

实验结果如图6所示，细菌的存活率会随着过氧化氢浓度的增加而下降。对于大肠杆菌，所选的过氧化氢浓度在50μM以下时，其对细菌的存活率影响较小，当过氧化氢浓度使用量达到100μM以上时，细菌的存活率出现急剧下降。对于金黄色葡萄球菌而言，所选的过氧化氢浓度在300μM以下时，其对细菌的存活率影响较小，当过氧化氢浓度使用量达到900μM以上时，细菌的存活率出现急剧下降。由于本抗菌体系中，是考虑到氧化铜-铂纳米复合体和过氧化氢的联合抑菌效应。故此，首选过氧化氢浓度的最佳选择条件为在某一浓度下，其本身对细菌的存活率不会造成很大影响，同时又能保证其用量充分。

综上所述，本发明针对大肠杆菌选择50μM的过氧化氢，针对金黄色葡萄球菌选择300μM的过氧化氢。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。