一种自组装四氧化三铁纳米颗粒的制法和用途的制作方法

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种自组装四氧化三铁纳米颗粒及其制备与用途。

背景技术：

Fe₃O₄纳米颗粒因为其独特的磁性、无毒性和生物相容性被广泛用于生物医学研究。它不仅具有表面效应、量子尺寸效应、体积效应和宏观量子隧道效应，而且还能因单磁畴颗粒的出现而表现特殊的性质，如高磁化率、超顺磁性、高矫顽力等。已经在磁性分离纯化，药物靶向输送，核磁共振成像造影剂，磁热疗等生物医学领域得到广泛的应用。

载荷Fe₃O₄自组装纳米颗粒的表面化学和粒径影响其生物活性。当载荷纳米颗粒的粒径达到几百纳米时，容易被肝脾的网状内皮组织细胞吞噬；若太小(～10nm)则会被缠绕在肾小球上的毛细血管筛选和选择通过。结合了钝化处理和靶向配体的表面修饰能够改进纳米颗粒的表面化学性质，降低它的体内非特异性。比较常见的钝化处理是表面修饰PEG，这样既能抑制蛋白质的吸附，又能延长停留时间。靶向配体例如小分子，多肽类，蛋白质或者抗体，能通过针对肿瘤细胞表面过度表达的受体实现特异性。

技术实现要素：

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种自组装四氧化三铁纳米颗粒及其制备与应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种自组装四氧化三铁纳米颗粒，包括：由主分子和客分子形成的包合物，其主分子为β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺，客分子为金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子和金刚烷封端的聚乙二醇。

优选地，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺可以是接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺。

优选地，接枝前的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是1800～10000。

优选地，所述接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺中，每条聚乙烯亚胺长链上接枝有4～7个β-环糊精分子。

优选地，所述金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子可以是表面连接有金刚烷的四氧化三铁纳米粒子。

优选地，金刚烷可通过酰胺键连接到四氧化三铁纳米粒子表面上。

优选地，每个四氧化三铁纳米粒子表面连接有一个及一个以上金刚烷。

优选地，所述金刚烷封端的聚乙二醇中，金刚烷可通过酰胺键连接到聚乙二醇的端部。

优选地，未封端前的聚乙二醇的分子量可以是2000～5000。

所述自组装四氧化三铁纳米颗粒中，β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子和金刚烷封端的聚乙二醇之间的重量份数比例为2:(0.1～2)：(3.15～6.3)。

本发明的第二方面，提供了前述自组装四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，包括：

(1)按配比取客分子金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子和金刚烷封端的聚乙二醇，混合，溶解，获得客分子溶液；

(2)在步骤(1)获得的客分子溶液中加入主分子β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺，涡旋混合均匀，即可获得自组装四氧化三铁纳米颗粒。

优选地，制备时，β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子和金刚烷封端的聚乙二醇之间的重量份数比例为2:(0.1～2)：(3.15～6.3)。

优选地，金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子可通过包括如下步骤的方法获得：将金刚烷通过酰胺反应连接到四氧化三铁纳米粒子上。

优选地，金刚烷封端的聚乙二醇可通过包括如下步骤的方法获得：将金刚烷通过酰胺反应连接到聚乙二醇的端部。

优选地，β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺可通过包括如下步骤的方法获得：将β环糊精与对甲苯磺酰氯反应获得磺酰化β-环糊精；然后将磺酰化β-环糊精接枝到PEI上，获得β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺。

本发明的第三方面提供了一种由前述制备方法获得的自组装四氧化三铁纳米颗粒。

本发明的第四方面提供了前述自组装四氧化三铁纳米颗粒在制备磁共振成像造影剂中的用途。

本发明的第五方面，提供了前述自组装四氧化三铁纳米颗粒在制备肿瘤光热治疗剂中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明以金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子、金刚烷封端的聚乙二醇和β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺为组建模块，通过阳离子水凝胶网络合成自组装四氧化三铁纳米颗粒。所述自组装四氧化三铁纳米颗粒具有良好的弛豫率和光热转化性能，可用于制备磁共振成像造影剂或制备肿瘤光热治疗剂，广泛应用于肿瘤的诊断和治疗。

附图说明

图1是Fe₃O₄-MNPs纳米粒子的合成示意图。

图2是Fe₃O₄-MNPs纳米粒子的TEM图。

图3是Fe₃O₄-MNPs纳米粒子在808nm近红外光照射下体外光热转化实验。

图4是Fe₃O₄-MNPs纳米粒子对A549细胞体外毒性实验。

图5是不同浓度Fe₃O₄-MNPs纳米粒子在体外的弛豫时间和弛豫率的测定。

图6是Fe₃O₄-MNPs纳米粒子在808nm近红外光照射下体内肿瘤热疗效果。

图7：β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺的结构示意图。

图8：金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子结构示意图。

图9：金刚烷封端的聚乙二醇结构示意图。

图10：Ad-PEG的氢谱图。

图11：6-ots-β-CD的氢谱图。

图12：CD-PEI的氢谱图。

具体实施方式

包合物

包合物系指一种分子被全部或部分包合于另一种分子的空穴结构内，形成特殊的络合物。这种包合物包括：主分子和客分子，主分子即是包合材料，具有一定的空穴结构，足以将客分子容纳在内。

自组装四氧化三铁纳米颗粒

本发明的自组装四氧化三铁纳米颗粒，包括：由主分子和客分子形成的包合物，其主分子为β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺，客分子为金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子和金刚烷封端的聚乙二醇。

所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺可以是接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺。

将β-环糊精接枝到聚乙烯亚胺上，获得接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺属于本领域技术人员所公知的技术。

接枝前的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是1800～10000。一实施例中，列举了接枝前的聚乙烯亚胺的分子量是10000，但是，其分子量并不仅限于10000。

所述接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺中，每条聚乙烯亚胺长链上接枝有4～7个β-环糊精分子。一实施例中，列举了枝接了5个β-环糊精分子的聚乙烯亚胺长链，但是其接枝率并不仅限于此。

所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺的结构示意图可参见图7。

所述金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子可以是表面连接有金刚烷的四氧化三铁纳米粒子。

将金刚烷连接到四氧化三铁纳米粒子表面上属于本领域技术人员所公知的技术。例如，金刚烷可通过酰胺键连接到四氧化三铁纳米粒子上。

每个四氧化三铁纳米粒子表面可以连接有一个及一个以上金刚烷。

所述金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子的结构示意图可参见图8。

采用金刚烷对聚乙二醇进行封端属于本领域技术人员公知的技术。例如，所述金刚烷封端的聚乙二醇中，金刚烷可通过酰胺键连接到聚乙二醇的端部。

未封端前的聚乙二醇的分子量可以是2000～5000。一实施例中，列举了所述聚乙二醇的分子量为5000，但是并不仅限于此。

所述金刚烷封端的聚乙二醇的结构示意图可参见图9。

本发明的自组装四氧化三铁纳米颗粒的合成以金刚烷和β-环糊精的识别作用为基础。β-环糊精具有独特的生物降解性，无毒性，无光吸收性等，它有一个空腔结构，空腔内壁疏水，外壁亲水，因此它很容易基于空格内腔的双重疏水作用识别包络客体分子。本发明以金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子、金刚烷封端的聚乙二醇和β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺为组建模块，通过阳离子水凝胶网络合成载荷自组装纳米微球。这种水凝胶网络通过分子间的π-π键的堆积作用组建分子模块。而且，通过改变组建模块的用量比控制自组装四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4-MNPs的粒径，表面电荷和表面化学性质。

所述自组装四氧化三铁纳米颗粒中，β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子和金刚烷封端的聚乙二醇之间的重量份数比例为2:(0.1～2)：(3.15～6.3)。

本发明的自组装四氧化三铁纳米颗粒的粒径范围可以在10～500nm范围内。一般地，本发明的自组装四氧化三铁纳米颗粒的粒径范围在100～300nm范围内。

自组装四氧化三铁纳米颗粒的制备方法

本发明的自组装四氧化三铁纳米颗粒的合成示意图如图1所示。

本发明的自组装四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，包括：

(1)按配比取客分子金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子和金刚烷封端的聚乙二醇，混合，溶解，获得客分子溶液；

(2)在步骤(1)获得的客分子溶液中加入主分子β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺，涡旋混合均匀，即可获得自组装四氧化三铁纳米颗粒。

制备时，β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子和金刚烷封端的聚乙二醇之间的重量份数比例为2:(0.1～2)：(3.15～6.3)。

其中，金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子可通过包括如下步骤的方法获得：将金刚烷通过酰胺反应连接到四氧化三铁纳米粒子上。

亦即，可将金刚烷上的氨基与四氧化三铁纳米粒子上的羧基进行酰胺反应，获得金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子。

金刚烷封端的聚乙二醇可通过包括如下步骤的方法获得：将金刚烷通过酰胺反应连接到聚乙二醇的端部。

亦即，可将金刚烷上的氨基与聚乙二醇上的羧基进行酰胺反应，获得金刚烷封端的聚乙二醇。

β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺可通过包括如下步骤的方法获得：将β环糊精与对甲苯磺酰氯反应获得磺酰化β-环糊精；然后将磺酰化β-环糊精接枝到PEI上，获得β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺。

自组装四氧化三铁纳米颗粒在制备磁共振成像造影剂中的用途

前述自组装四氧化三铁纳米颗粒具有良好的弛豫时间和弛豫率，可用于制备磁共振成像造影剂。例如，核磁共振成像中的T2造影剂。

自组装四氧化三铁纳米颗粒在制备肿瘤光热治疗剂中的用途

前述自组装四氧化三铁纳米颗粒在近红外光的照射下的光热转化性能好，可用于制备肿瘤光热治疗剂。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 Fe₃O₄-COOH纳米粒子的制备

Fe₃O₄-COOH纳米粒子为现有技术，既可以通过市售途径购买获得，也可自己制备。自己制备时，可采用如下方法：

将1.08g FeCl₃·6H₂O与0.44g FeCl₂·4H₂O加入到三口烧瓶中，加入60ml蒸馏水，在氮气保护下水浴加热至全部溶解。当温度趋于80～85℃时，加入10ml,5mol/L的NaOH溶液，反应1min后，加入含有聚丙烯酸1.11g的二甘醇溶液15ml，加热搅拌30min，离心分离。

实施例2 金刚烷修饰的四氧化三铁纳米粒子Ad-Fe₃O₄的制备

金刚烷，简称Ad。

称取533.13mg的MES配制浓度为25mmol/L的MES缓冲液100ml，并调节PH为5.07。称取0.9585g的EDC和1.0857g的Sulfo-NHS分别配成50mmol/L的溶液备用。用MES缓冲液清洗Fe₃O₄-COOH(6.8mg)纳米粒子3次并分散在MES缓冲液中，然后将EDC和Sulfo-NHS先后加入上述溶液中，常温下混合30min。用MES清洗3次后，在Fe₃O₄沉淀中分别加入0.1mmol/ml的Ad MES缓冲液，室温下混摇2h，离心分离。

实施例3 金刚烷封端的聚乙二醇Ad-PEG的制备

称取分子量为187.74g/mol的金刚烷盐酸盐47mg溶于10mlCH₂Cl₂，加入搅拌子，以适当的转速搅拌使得1-Ad溶解在二氯甲烷中。随后依次加入三乙胺26mg和50mg的mPEG-NHS，室温搅拌2h，用旋转蒸发仪除去二氯甲烷后加水溶解，将液体置于分子量为3500的透析袋透析三天，放入冻干机中过夜冻干。

对产物的结构进行表征，表征数据如图10所示：

表征数据如下：¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆):δ3.42-3.54(440H,OCH₂)，1.13-1.18(15H,protons on Ad)。

实施例4 6-O-(p-对甲基苯磺酸)-β-环糊精的制备

500ml三颈瓶中将20gβ-CD(17.6mmol)加入400mL 0.4mol/L NaOH溶液中，完全溶解后剧烈搅拌至无色(预先冰水浴0-5℃)。氮气保护下，用恒压漏斗在90.0min内缓慢加入15ml溶有6.723g对甲苯磺酰氯(35.2mmol)的乙腈溶液中，再于反应器中冰水浴反应5h，抽滤弃去未反应的TsCl，取滤液。用1mol/L的HCl酸化至pH2-3有白色固体生成，将滤液在4摄氏度下静置12h过夜，抽滤，白色固体用水重结晶两次，真空干燥得白色粉末。

对产物的结构进行表征，表征数据如图11所示：

对产物的结构表征数据如下:¹H NMR(400MHz，DMSO),δ3.18-3.78(C-2，-3，-4，-5)；4.79(C-1)；5.74(C-2，-3OH)。

实施例5 β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺CD-PEI的制备

将100mg PEI(分子量为10KD)溶解在100ml DMSO中，将实施例4制备的6-OTs-β-CD加入到该溶液中，在70℃条件下反应3天，用分子量为10KD的透析袋透析六天，过滤去除未反应的6-OTs-β-CD，冻干收集样品。

对产物的结构进行表征，表征数据如图12所示：

对产物的结构表征数据如下:¹H NMR(400MHz，D2O)δ4.92(环糊精上C₁H)，3.27-3.66(环糊精上C_2-6H),2.3-3.0(PEI上OCH₂)。

实施例6 自组装Fe₃O₄纳米粒子的制备

将1mg Ad-Fe₃O₄与3.15mg Ad-PEG在室温下混合，加入到PBS溶液中，利用涡旋仪涡旋10秒，静置3分钟后，在该混合溶液中加入2mg CD-PEI，涡旋10秒，确保金刚烷-环糊精主客体作用充分完成，静置20min。所得纳米粒子平均粒径约为120nm。该处方设为处方①为我们后续实验常用处方，所得纳米粒子平均粒径约为120nm。同时我们还做了Ad-Fe3O4,Ad-PEG,CD-PEI三种组分重量分别为0.1mg:3.15mg:2mg、0.5mg:3.15mg:2mg、1mg:3.15mg:2mg、1mg:6.3mg:2mg、2mg:6.3mg:2mg设为处方②、③、④、⑤、⑥。测得处方②、③、④、⑤、⑥所制备的纳米粒子粒径也都在100-300nm之间。

实施例7 自组装Fe₃O₄纳米粒子的体外光热转化实验

我们测定实施例6制备出来的自组装纳米粒子在波长为808nm近红外光的照射下的的光热转化实验，结果见图3。从图3中我们可以看出Ad-Fe₃O₄浓度为0.1mg/ml的自组装纳米粒子在808nm近红外光的照射下，温度可以升高24℃。肿瘤的磁热疗相关报告中表明肿瘤的杀伤温度只要大于42℃即可。处方②、③、④、⑤、⑥所制备的纳米粒子在同等实验条件下得到的结果与处方①无差异。

实施例8 自组装Fe3O4纳米粒子的细胞毒性实验

细胞株为人肺腺癌细胞A549。通过CCK8法测定实施例6中制备出来的自组装纳米粒子对A549细胞的体外杀伤效果，结果见图4。从图4中可以看出自组装Fe₃O₄纳米粒子没有细胞毒性，说明该自组装体具有良好的生物相容性。同时，在图4中可以看出在单纯的808nm近红外光的照射下细胞仍保持较高的存活率，但是在加入自组装纳米粒子的同时用近红外光照射，该纳米粒子可以将吸收的光能转化为热能，杀死肿瘤细胞且纳米粒子的浓度越高光热转化效率越高导致细胞存活率越低。处方②、③、④、⑤、⑥所制备的纳米粒子在同等实验条件下得到的结果与处方①无差异。

实施例10 自组装Fe₃O₄纳米粒子在体外弛豫时间和弛豫率的测定

所选用的仪器为MesoMR23-60H-I中尺寸核磁共振成像分析仪，共振频率为23.405MHz，磁体强度0.55T，线圈直径为60mm。选用实施例6中处方①制备出来的自组装纳米Fe₃O₄粒子，稀释成不同浓度的溶液，利用该核磁共振仪测出弛豫时间，做出标曲，如图5所示。根据图5所做的标曲我们可计算得到该自组装Fe₃O₄纳米粒子的弛豫率，弛豫率为37.211。随着Fe元素浓度的增大，灰度也逐渐变暗，说明该纳米粒子可以作为核磁共振成像中的T2造影剂。处方②、③、④、⑤、⑥所制备的纳米粒子在同等实验条件下得到的结果与处方①无差异。

实施例11 自组装Fe₃O₄纳米粒子对于荷瘤小鼠体内光热治疗效果

荷瘤小鼠通过将人肺腺癌细胞A549通过皮下注射种到裸鼠右前肢下，两个周后裸鼠即可长出一定大小的皮下瘤。我们将实施例6中处方①制备得到的纳米粒子通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，实验组在第二天开始利用808nm的近红外光每天照射肿瘤部位20min，对照组包括：①不注射自组装Fe₃O₄纳米粒子只进行近红外光的照射②只尾静脉注射自组装Fe₃O₄纳米粒子不进行近红外光照射③尾静脉注射PBS作为空白对照组。结果如图6所示，实验组在照射第二天肿瘤部位就出现一定程度的烧焦，在照射第四天肿瘤被完全烧焦不再生长，而其他对照组肿瘤部位没有明显变化，肿瘤在逐渐增大。处方②、③、④、⑤、⑥所制备的纳米粒子在同样的实验条件下得到的结果与处方①无差异。结果表明我们的自组装Fe3O4纳米粒子对于进行肿瘤光热治疗具有一定的效果，可以一定程度上抑制肿瘤的生长。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。