一种基于Fe₃O₄@Au的磁性弛豫开关及其制备方法

专利名称：一种基于Fe₃O₄@Au的磁性弛豫开关及其制备方法
技术领域：
本发明属于磁性弛豫开关检测技术领域，具体涉及一种基于Fe304@AU磁性纳米颗 粒的磁性弛豫开关及其制备方法。
背景技术：
基于超顺磁性纳米颗粒的生物传感器是近几年发展起来的一种高效检测技 术，它突破了磁共振在体外应用的限制，这种技术被称为磁性弛豫开关技术(Magnetic RelaxationSwitch)。在一个外加磁场中，顺磁性颗粒本身的磁偶极会在其周围产生一个微 小的磁场扰动，引起在此影响范围内的水分子中^核自旋退化，这样通过无线电波脉冲序 列检测的屮信号会减弱，得到的弛豫指数退化曲线所确定的时间常数即为T2，当目标分子 出现在溶液中时，磁性颗粒表面的基团与目标分子结合，引起磁性颗粒从分散状态转变为 团聚状态，本来分散的微磁场“团聚”以后对水分子中^核的自旋退化作用发生改变，导致 T2的变化，T2的变化量与目标分子浓度相关，据此可对目标分子作定量分析，而在检测目标 分子的过程中，磁颗粒浓度无需知道。目前对生物分子的检测大多采用光学分析的办法，包括紫外可见吸收分析、荧光 发光分析、浊度分析等，这些技术都需要样品有良好的透光性。MRSw技术的优势在于可以检 测浑浊溶液中目标分子的含量，例如血液，细胞培养液，牛奶等，这样可以大大减少繁复的 样品预处理步骤。MRSw技术目前处于起步阶段，尽管有明显的实用前景，但MRSw的T2信号变化与 被分析物的浓度相关性不够稳定，而且T2信号在被分析物的浓度达到检测范围最高值之前 和之后有截然不同的变化趋势，很有必要采用其它检测手段对弛豫开关技术进行补充和论 证，以多重检测的方式提高MRSw的实际应用价值。另一方面，一般的磁性纳米颗粒表面修 饰基团并不容易，要修饰不同的基团更是困难，而利用Au与巯基的特殊键合作用可以使探 针颗粒表面修饰识别基团或抗体变得轻而易举。以 magnetic relaxation switches 和 Fe304@Au 纳米颗粒为关键词分别对 1992 年以来的全球专利检索，其中以magnetic relaxation switches为关键词没有找到相关 的专利，另以Magnetic、Relaxation以及Sensor为关键词组合对国际专利检索，其中涉 及磁性弛豫开关的专利 1 项 US20060269965(Water Relaxation-Based Sensor)；而涉及 Fe304iAu纳米颗粒的专利有2项，分别是一种金磁核壳纳米粒子的制备方法(申请专利号 CN200810029399. 0)，该专利描述了一种在超声作用下合成Fe304@Au纳米颗粒的方法；另一 篇专利是一种金包覆磁粒原位引发高灵敏化学发光检测大肠杆菌的新方法(申请专利号 CN200810031350. 9)，该专利描述的是一种利用Fe304@Au纳米颗粒被氧化释放出Au3+，加入 鲁米诺后弓I发化学发光，然后对大肠杆菌进行检测的技术。

发明内容
本发明的目的是设计一种基于Fe304@AU核壳结构磁性纳米颗粒的磁性弛豫开关及其制备方法。本发明设计的基于Fe304@AU的磁性弛豫开关，采用的探针为表面修饰有识别分子 的花朵状磁性纳米颗粒，该花朵状磁性纳米颗粒为Fe304@AU核壳结构。所述的表面修饰有识别分子的花朵状磁性纳米颗粒探针的粒径在50-70nm范围， 外观呈花朵状。所述的表面修饰有识别分子的花朵状磁性纳米颗粒探针的元素质量比(通过ICP 测定)为 Fe Au = 1 3.4。所述的表面修饰有识别分子的花朵状磁性纳米颗粒探针的紫外可见吸收峰在 578nm 处。所述的表面修饰有识别分子的花朵状磁性纳米颗粒探针的弛豫度为R2 = 9. 35mM_1 s-1。本发明提出的基于Fe304@AU核壳结构磁性纳米颗粒的磁性弛豫开关的制备步骤 如下a.在葡聚糖溶液中通过共沉淀的方法合成直径小于5nm的Fe304颗粒；b.在铁浓度为14—16mg Fe/mL的Fe304水溶液中通过葡萄糖还原氯金酸的方法 合成花朵状Fe304@AU核壳结构磁性纳米颗粒；c.在Fe304@AU纳米颗粒表面自组装上胱胺，并通过EDC/NHS催化连接上生物素， 获得功能化的磁性纳米颗粒BiOtin-Fe304@Au。往上述分散好的BiOtin-Fe304@Au水溶液中加入不同量的抗生物素蛋白Avidin， 反应lOmin后测定溶液的自旋-自旋弛豫时间T2。与现有技术相比，本发明具有以下特点1、采用的花朵状Fe304@AU纳米颗粒探针弛豫度大小合适，能在溶液中长时间保持
稳定；2、颗粒尺寸均勻，粒径分布在50-70nm之间，非常有利于依据分散和团聚间转换 而进行检测的磁性弛豫开关技术的实施，有较低的检测限；3、磁性纳米颗粒表面包覆有金层，能够很方便地针对所要检测的被分析物的类型 和性质修饰上特定的识别分子或蛋白；4、核壳结构颗粒在紫外可见吸收光谱中有特殊吸收，能够方便的引入紫外可见吸 收检测技术对检测结果进行印证。


图1 (A)为花朵状Fe304@Au磁性纳米颗粒的TEM全貌图；⑶为花朵状Fe304@Au磁 性纳米颗粒的TEM放大图。图2 (A)为花朵状Fe304@Au磁性纳米颗粒的X射线能谱(EDX)图；(B)为EDX测得 的花朵状Fe304@AU磁性纳米颗粒的元素质量百分数图。图3 (A)为花朵状Fe304@Au磁性纳米颗粒溶液的紫外可见吸收光谱图；(B)为通过 拟合1/T2对Fe浓度的关系直线求出Fe304@AU磁性纳米颗粒的弛豫度。图4为Biotin-Fe304@Au溶液以及未修饰Biotin的Fe304@Au溶液的T2时间与 Avidin浓度的关系图；插图为0-40nM的Avidin浓度范围内溶液T2对Avidin浓度的拟合线性关系图。图5为不同Avidin浓度下，BiOtin-Fe304@Au溶液的紫外可见吸收光谱图；插图为 各吸收谱线最大吸收峰位置与Avidin浓度的关系图。图6 (A)为不同Avidin浓度下，BiOtin-Fe304@Au溶液颗粒的动态光散射粒径分布 图；(B)为各粒径分布图分布峰位置与Avidin浓度的关系图。图7为本发明的结构图示。
具体实施例方式实施例1 合成葡聚糖包裹的纳米Fe304室温下在15mL葡聚糖水溶液(15% w/w，Mw = 20000)溶液中加入4mL浓NH40H( > 25%w/w)，使溶液pH值约为11. 7，然后在磁力搅拌下水浴加热到25°C。把0. 75gFeCl3 -6H20 和0. 28g FeS04 *4H20溶解在5mL水中，用0. 22 y m的滤膜过滤后逐滴加入到葡聚糖溶液中， 溶液变为黑色浑浊液，搅拌0. 5h。之后浑浊液lOOOOrpm离心20min除去较大的颗粒，上层 橙红色澄清液用去离子水透析24h(使用25kDa的透析袋)，以除去溶液中过量的铵离子、 游离的葡聚糖等。之后再通过离心超滤对上述溶液进行浓缩处理。TEM图显示得到的Fe304 纳米颗粒尺寸在3-5nm之间，ICP结果显示浓缩后的溶液浓度为0. 602mgFe/mL。 实施例2 合成花朵状Fe304@Au磁性纳米颗粒取5mL上述浓缩后的Fe304纳米颗粒溶液，加入4mL去离子水，磁力搅拌下加入 200 uL的NH20H(w/w = 1% )水溶液，搅拌lOmin，加入0. 5g葡萄糖作为还原剂，然后加入 50 ii L的NH40H(7% ),使溶液pH值约为9. 0，之后分4次每次加入100 uL 0. 25%的HAuC14 水溶液，一共加入400 u L，每两次之间间隔为lOmin，随着HAuC14的加入，溶液逐渐从红棕 色转变为暗红色。之后在7000rpm下离心6min，去除上清液，下层沉淀重新溶解在水中，之 后经过反复超声分散(80W)和离心分离洗涤5次去除没有包裹Au的Fe304，最终溶解在1 % 葡聚糖溶液中，溶液呈深蓝色，能在一周内保持稳定。TEM图显示颗粒外形类似花朵，粒径分 布在50-70nm之间(图1)，EDX显示颗粒中Fe与Au的比值为1 11 (w/w)(图2)，与ICP 结果吻合，UV-Vis显示在578nm处有明显的吸收峰(图3A)。实施例3 在Fe304@Au磁性纳米颗粒表面修饰生物素首先在颗粒表面自组装上胱胺取2mL上述Fe304@Au溶液7000rpm离心6mins去 除上清液，加入2mL ImM的PBS (pH = 8. 0)，边超声边加入胱胺溶液，使其最终浓度为4mM， 继续超声lOmin，然后磁力搅拌8h，再离心并用去离子水洗涤3次，最后超声分散在5mL ImM 的PBS(pH = 8. 0)溶液中，加入200 y L 5%的葡聚糖溶液以提高溶液的稳定性。然后通过胱胺连接Biotin 把 2mg Biotin, 10mg EDC, lmg NHS 溶解在 2mL 2mM 的PBS(pH = 7.4)缓冲液中，轻轻振摇lOmins，然后加入到上述Fe304@Au溶液中，磁力 搅拌12h后7000rpm离心6min，去除上清液，并用去离子水离心洗涤3次，然后分散在 3mL去离子水中，得到Biotin-Fe304@Au溶液，ICP测得溶液中Fe含量为31. 65 u g/mL, Au含量为107. 47 u g/mL,通过核磁共振成像分析仪测得BiOtin-Fe304@Au的弛豫度R2为 9. 35mM_1 ‘ (图 3B)实施例4 磁性弛豫开关分析检测抗生物素蛋白先对上述BiOtin-Fe304@Au溶液超声分散5min，再用0. 22 y m的滤膜过滤溶液，得到的滤出液即可作为母液使用。往核磁管中加入150 yL母液，加入不同量的0. lmg/ mLAvidin溶液，再加入一定量的2mM PBS(pH = 7. 4)缓冲液，使总体积为200 u L，此时各 核磁管中 Avidin 的浓度分别为0. 00，0. 15，3. 79，6. 06，7. 58，22. 73，37. 88，53. 03，75. 76， 151. 52和227. 27nM。摇勻后放在37°C水浴中反应5min，之后把核磁管依次放在核磁共振 成像分析仪中测定自旋_自旋弛豫时间T2，得到不同的Avidin浓度下溶液的T2时间，每个 浓度测定三次，最后以T2对Avidin浓度作图(图4)，为了证明颗粒的团聚是由Biotin与 Avidin特异性相互作用而不是Avidin的非特异性吸附所引起，往不含Biotin的Fe304@Au 溶液中加入0-150nM的Avidin，再测定溶液的T2时间，以T2对Avidin浓度作图(图4)。实施例5 紫外可见(UV-Vis)吸收光谱及动态光散射(DLS)粒径分析印证检测结 果上述测完T2后的溶液分别注入微量比色皿中测定紫外可见吸收光谱，以去离子水 作为空白，分析采用寻峰方式，最后把各浓度对应的吸收光谱绘于同一张图中(图5)，并以 各吸收光谱的吸收峰位置对Avidin浓度作图(图5插图)。上述各溶液稀释10倍后通过动态光散射粒度仪测定溶液中颗粒粒径的强度分布 (图6A)，再以各溶液中颗粒粒径强度分布的峰位置对原溶液中Avidin浓度作图(图6B)。采用本发明检测技术以Avidin作为模型蛋白能够检测到lOnM的蛋白浓度，检测 线性范围在5-35nM之间。在Fe304@AU颗粒表面修饰不同类型的识别分子要比在普通磁颗 粒表面修饰方便得多。而且Fe304@AU复合型探针有着特殊优势，能够方便的引入UV-Vis分 析和DLS粒径分析技术对检测结果进行相互印证，可以保证检测有较高的置信度。
权利要求
一种基于Fe3O4@Au的磁性弛豫开关，其特征在于采用的探针为表面修饰有识别分子的花朵状磁性纳米颗粒，该花朵状磁性纳米颗粒为Fe3O4@Au核壳结构。
2.如权利要求1所述的基于Fe3O4OAu的磁性弛豫开关，其特征在于表面修饰有识别分 子的花朵状磁性纳米颗粒探针的粒径在50-70nm范围。
3.如权利要求2所述的基于Fe3O4OAu的磁性弛豫开关，其特征在于表面修饰有识别分 子的花朵状磁性纳米颗粒探针的元素质量比为Fe Au=I 3.4。
4.如权利要求2所述的基于Fe3O4OAu的磁性弛豫开关，其特征在于表面修饰有识别分 子的花朵状磁性纳米颗粒探针的紫外可见吸收峰在578nm处。
5.如权利要求2所述的基于Fe3O4OAu的磁性弛豫开关，其特征在于表面修饰有识别分 子的花朵状磁性纳米颗粒探针的弛豫度为R2 = 9. 35ml-1 · s—1。
6.如权利要求1所采用的基于Fe3O4OAu的磁性弛豫开关的制备方法，其特征在于具体 步骤如下a.在葡聚糖溶液中通过共沉淀的方法合成直径小于5nm的Fe3O4颗粒；b.在铁浓度为14—16mgFe/mL的Fe3O4水溶液中通过葡萄糖还原氯金酸的方法合成 花朵状Fe3O4OAu核壳结构磁性纳米颗粒；c.在Fe3O4OAu纳米颗粒表面自组装上胱胺，并通过EDC/NHS催化连接上生物素 Biotin,获得功能化的磁性纳米颗粒Biotin-Fe304@Au。
全文摘要
本发明属于磁性弛豫开关检测技术领域，具体为一种基于Fe3O4@Au的磁性弛豫开关及其制备方法。本发明的磁性弛豫开关，采用的探针为表面修饰有识别分子的花朵状磁性纳米颗粒，该花朵状磁性纳米颗粒为Fe3O4@Au核壳结构。探针的粒径在50-70nm，探针的弛豫度为R2＝9.35mM-1·s-1。本发明通过在纳米颗粒表面金层上修饰识别分子生物素，实现对模型蛋白Avidin的快速简便检测，检测限低至10nM的水平。本发明解决了目前磁性弛豫开关技术实施不方便，检测结果不稳定的问题。
文档编号G01N21/33GK101865984SQ20101019163
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者孔继烈, 梁国海 申请人:复旦大学