专利名称：肠道病毒71型cDNA感染性克隆、其构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及RNA病毒拯救技术，具体地说，涉及肠道病毒71型cDNA感染性克隆、 其构建方法及应用。
背景技术：
肠道病毒(Enterovirus) 71型(EV71)属于小核糖核酸病毒科,肠道病毒属。基因组为单股正链RNA。EV71主要感染5岁以下的儿童，通过粪-口途径或飞沫进行传播，其感染主要弓I起手足口病(HFMD)，在临床上与柯萨奇病毒A16感染所引起的手足口病难以区别。严重的EV71感染还能引起无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹以及心肌炎和肺水肿等多种与神经系统相关的疾病，导致重症甚至死亡病例的发生。EV71自1969 年首次由Schmidt等从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来后， 已在世界范围内引起十多次的爆发和流行。近年来，EV71的流行在亚太地区呈上升趋势， 令人关注的是该地区的EV71感染引起越来越严重的中枢神经系统症状。2008年和2009年以EV71感染为主的手足口病在中国大陆多个省市流行，共导致479名儿童死亡。目前尚无治疗EV71感染的特效药物，主要通过对症治疗控制病情的发展。应用反向遗传学技术构建RNA病毒的感染性克隆，比传统的细胞传代方法制备病毒的安全性高，并且可以避免病毒在传代过程中引入的突变。此外通过基因工程的技术手段可以容易地实现对病毒基因组的改造，如定点突变、重组、缺失和嵌合等，为阐明病毒的致病机制，研发新的抗病毒药物及获得新的疫苗候选株奠定重要的基础。Racaniello VR和Baltimore D于1981年首次利用反向遗传学技术构建了脊髓灰质炎病毒的cDNA感染性克隆，提供了在DNA水平上研究RNA病毒的可能。2005年，Arita 等构建了 EV71标准株BrCr的一系列变异体的感染性克隆，研究了在猴子模型中，决定温度敏感性的突变位点对病毒神经毒力的影响。近年来，中国大陆时有EV71的流行爆发，迫切需要构建出能够代表我国EV71流行株特点的感染性克隆，为研究EV71的致病机理和抗病毒药物提供技术支持。缺乏我国EV71流行株的感染性克隆以及EV71的快速变异，使得利用传代病毒进行药效评价的结果可靠性差，成为影响抗EV71药物研发的主要技术瓶颈。因此构建我国EV71流行株的感染性克隆，将填补我国EV71标准株的空白，并为抗EV71病毒药物的研发及EV71疫苗的研发奠定重要基础。
发明内容
本发明的目的是提供肠道病毒71型流行株的cDNA感染性克隆、其构建方法及应用。为了实现本发明目的，本发明的一种肠道病毒71型cDNA感染性克隆，其是通过反向遗传操作技术获得的肠道病毒71型SZ98 pro株的cDNA感染性克隆。所述肠道病毒71 型SZ98 pro株是中国深圳98的实验室传代株(SZ98 pro)。前述的肠道病毒71型cDNA感染性克隆，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. I所
3示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第215位Ρι·ο替换为His，或将第362位Glu替换为Gly，均不会影响其功能。前述的肠道病毒71型cDNA感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。本发明还提供一种构建上述肠道病毒71型cDNA感染性克隆的方法，其是以肠道病毒71型SZ98 pro株的基因组为模板，通过RT-PCR得到全长cDNA克隆。本发明还提供含有上述肠道病毒71型cDNA感染性克隆的载体。优选地，出发载体为 pBR322。本发明还提供含有上述载体的宿主细胞,其为大肠埃希氏菌(Escherichia coli) SZ98 pro/pBR322/DH5 α，已于2011年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为 CGMCC No. 5659。本发明还提供制备肠道病毒71型SZ98 pro株的拯救病毒的方法，首先对肠道病毒71型SZ98 pro株进行了全基因组测序，根据测序结果设计用于构建cDNA克隆的引物和酶切位点，通过引物在基因组cDNA的5’端引入T7启动子，在其3’端引入polyA尾，然后以肠道病毒71型SZ98 pro株的基因组为模板，进行RT-PCR反应，得到全长cDNA克隆，酶切线性化后利用T7聚合酶系统进行体外转录，用体外转录出的RNA转染vero细胞，获得拯救病毒。本发明进一步提供上述肠道病毒71型cDNA感染性克隆在制备抗EV71病毒药物及疫苗中的应用，并通过对感染性克隆进行基因工程改造，以更好地阐明病毒的致病机制， 研究抗病毒的策略。本发明构建的我国EV71流行株的感染性克隆，填补了我国EV71标准株的空白，为抗EV71病毒药物的研发及EV71疫苗的研发奠定重要基础。通过对感染性克隆的基因工程改造，可以更好地阐明病毒的致病机制，研究抗病毒的策略。
图I为SZ98与SZ98 pro序列对比结果。图2为通过比对24株EV71的结构蛋白VPl的基因序列绘制的系统进化树。图3为用脂质体转染体外转录得到的EV71病毒基因组的RNA到vero细胞24h后， 观察到的CPE结果。图4为接种SZ98 pro株拯救病毒的vero细胞经裂解后,离心所得上清的western blotting.结果。图5为用SZ98 pro株拯救病毒接种vero细胞后的病毒增殖曲线。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I肠道病毒71型SZ98 pro株的基因组测序与序列分析根据EV71基因组的保守序列设计了 9对通用引物对肠道病毒71型中国深圳98的实验室传代株，即SZ98 pro株进行基因组测序。使用DNAStar软件对SZ98株与其实验室传代株的基因组序列包括5’ -NTR区、3’ -NTR区和蛋白编码区的序列以及由其编码的蛋白氨基酸序列进行分析和比对，SZ98与SZ98 pro序列对比结果如图I所示。从GenBank提取 EV71其他株的基因组序列进彳丁对比。SZ98株与其实验室传代株的基因组序列一致为96%, 其中5’-UTR区的一致性为98%，3’-UTR区的一致性为93 %。两者编码的多聚蛋白氨基酸序列的一致性为97%。通过比对24株EV71的结构蛋白VPl的基因序列，应用MeGa3. I软件绘制系统进化树(图2)。实施例2肠道病毒71型SZ98 pro株的全长cDNA克隆的构建根据测序结果和选择的酶切位点设计了 2对引物，5’端上游引物Sal-T7_EV71+ 引入T7启动子序列及Sal I酶切位点，3’端下游引物Hind-End-引入37个Poly(T)及 HindIII酶切位点。由Sangon公司合成。用Trizol提取病毒基因组RNA。用长片段逆转录酶 M-MLV Reverse Transcriptase (货号M1705,购自 Promega 公司)以病毒基因组 RNA 为模板，以3’端下游引物Hind-End-为反转录引物，42°C反应2h反转录全长cDNA，然后用 DNA聚合酶PrimeSTAR(货号DR010S，购自TaKaRa公司)分两段进行基因组全长扩增。反应产物进行I %琼脂糖电泳检测。RT-PCR扩增产物经胶回收纯化后，双酶切依次连入PBR322 载体，用Sal I和HindIII酶切鉴定是否插入了目的片段，并对阳性克隆进行全长的基因组测序，排除克隆构建过程中突变的引入。肠道病毒71型SZ98 pro株的全长cDNA克隆， 其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，由其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。用构建好的含有肠道病毒71型SZ98 pro株全长cDNA克隆的pBR322载体转化大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DH5 α，得到 SZ98pro/pBR322/DH5 α，保藏号 CGMCC No.5659。实施例3体外转录与细胞转染细胞培养待vero细胞(非洲绿猴肾细胞)生长为单层，用PBS清洗细胞面3次。 用O. 25%的胰酶消化细胞，待细胞变圆时终止消化，将胰酶吸出，立即加入含10% FBS的高糖DMEM培养基，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底并分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，用培养基将细胞浓度调整为2 X IO5个/ml，六孔板每孔接种2ml，置37 °C，5 % CO2孵箱培养。24h后(细胞丰度为80% )用于RNA转染。体外转录与细胞转染用HindIII对病毒cDNA克隆的3’端进行酶切，得到线性化的DNA模板,酹-氯仿抽提纯化后用T7 RNA聚合酶体外转录试剂盒MEGA script High Yield Transcription Kit (货号AM1334,购自 Ambion 公司)在体外转录出 RNA,用 Trizol 进行提取和纯化。vero细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基中，接种六孔板24h后，换成不含血清的DMEM培养基，用Lipofectamine 2000进行转染，每孔转染2 μ g RNA。转染后每天观察细胞，可见典型的CPE，部分细胞圆缩、脱落(图3，A为病毒转染后的细胞形态，B 为细胞对照)。待CPE达75%以上或观察5d后，收获细胞及培养液进行鉴定与传代。实施例4RT-PCR鉴定拯救病毒的特异序列应用通用引物2F(1094) (5，-GCAGTGGATAAACCAACGC-3’)和 2R(2116) (5’-ATAGGCTATGAGCATCTTGC-3’)扩增病毒基因组第1094位至2116位核苷酸，通过测序分
析对病毒进行鉴定。实施例5免疫印迹(Western blotting)检测当六孔板中vero细胞的CPE达到50%时，用Iml预冷的PBS收集细胞并加入细胞裂解液RIPA(购自Promega公司)，冰浴半小时裂解细胞，离心收集上清液，即为细胞与病毒的总蛋白样品。进行SDS-PAGE电泳，转膜，抗体孵育及ECL显色。其中一抗为抗EV71鼠单克隆抗体(货号ab36367,购自abeam公司)，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG(货号SC2031，购自Santa Cruz公司)。免疫印迹结果(图4)显示有EV71的特异结构蛋白VPl和VP2两条带。条带位置与EV71标准株BrCr-TR和BrCr-TS —致。实施例6微量滴定法测定病毒的滴度(TCID5tl)将vero细胞接种至96孔板，按IX IO4个/孔进行接种。2d后细胞长成致密单层。 取待滴定的EV71病毒液进行10倍梯度稀释，即ICT1 10Λ倾掉96孔板中的生长液，用不含血清的DMEM培养基清洗2遍。每个稀释度设4孔，每孔加100 μ I病毒稀释液。另设病毒对照，每孔加病毒原液100 μ I ;细胞对照，每孔加DMEM培养基100 μ I。置37°C，5% CO2培养箱培养。每日观察细胞的CPE变化并记录结果，一般需要观察5 7天。按Reed-Muench 法或Karber法计算结果得，收获的SZ98 pro株拯救病毒液的滴度为7. 51gTCID5(l。实施例7绘制病毒增殖曲线待六孔板vero长至单层，用不含血清的DMEM培养基清洗细胞面2次，SZ98 pro 株拯救病毒按Μ. O. I = I接种细胞，37°C吸附30min，吸弃病毒接种液。然后六孔板每孔补加2ml含2% FBS的维持液，置37°C，5% CO2培养箱培养。在接种病毒后的0h、2h、4h、8h、 12h、24h、36h、48h和72h分别收集病毒培养上清和病毒感染的细胞至EP管中。将病毒液在常温和_80°C反复冻融3次，使病毒颗粒充分释放出来。4°C 3000rpm离心15min，去除细胞碎片，上清即为收获的病毒液。用微量滴定法测定各个时间点收获的病毒液的滴度，绘制病毒的增殖曲线(图5)。实施例8利用感染性克隆获得的拯救病毒筛选抗病毒药物Vero细胞接种96孔板2d后长至单层，用不含血清的DMEM培养基清洗细胞面2 次。拯救病毒液用含2% FBS的维持液稀释至100 μ 1，病毒稀释液中病毒量为100TCID5Q。 将发酵液或待测化合物用维持液进行10倍梯度稀释，然后进行抗EV71活性测定。每个样品设有药效孔和毒性孔。药效孔加入loo μ I病毒稀释液和loo μ I药物稀释液；毒性孔加 Λ 100 μ I药物稀释液和100 μ I维持液。另外设细胞对照孔(加入200 μ I维持液)和病毒对照孔(加入100 μ I病毒稀释液和100 μ I维持液)。置37°C，5% CO2培养箱培养，每天观察记录细胞的病变效应(CPE)，分析药物抗EV71的活性。培养3d后，细胞对照孔无CPE出现，病毒对照孔达100% CPE,以CPE低于50%且无药物毒性的化合物为初筛阳性结果，通过后续的复筛进一步确定其抗EV71的活性。以利巴韦林和干扰素作为阳性药物对照，结果表明浓度为10μ g/ml的利巴韦林和10μ g/ml的干扰素对拯救病毒增殖的抑制率均达75%以上。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种肠道病毒71型CDNA感染性克隆，其是通过反向遗传操作获得的肠道病毒71型 SZ98 pro株的cDNA感染性克隆。
2.根据权利要求I所述的肠道病毒71型cDNA感染性克隆，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的肠道病毒71型cDNA感染性克隆，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
4.一种构建权利要求1-3任一项所述肠道病毒71型cDNA感染性克隆的方法，其是以肠道病毒71型SZ98 pro株的基因组为模板，通过RT-PCR得到全长cDNA克隆。
5.含有权利要求1-3任一项所述肠道病毒71型cDNA感染性克隆的载体。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，出发载体为PBR322。
7.含有权利要求6所述载体的宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其为SZ98pro/pBR322/DH5a，保藏号CGMCC No.5659。
9.制备肠道病毒71型SZ98pro株的拯救病毒的方法，其特征在于，首先对肠道病毒 71型SZ98 pro株进行了全基因组测序，根据测序结果设计用于构建cDNA克隆的引物和酶切位点，通过引物在基因组cDNA的5’端引入T7启动子，在其3’端引入polyA尾，然后以肠道病毒71型SZ98 pro株的基因组为模板，进行RT-PCR反应，得到全长cDNA克隆，酶切线性化后进行体外转录，用体外转录出的RNA转染vero细胞，获得拯救病毒。
10.权利要求1-3任一项所述肠道病毒71型cDNA感染性克隆在制备抗EV71病毒药物及疫苗中的应用。全文摘要
本发明提供了一种肠道病毒71型cDNA感染性克隆、其构建方法及应用，其是通过反向遗传操作技术构建的我国EV71流行株的感染性克隆，填补了我国EV71标准株的空白，为抗EV71病毒药物的研发及EV71疫苗的研发奠定重要基础。通过对感染性克隆的基因工程改造，可以更好地阐明病毒的致病机制，研究抗病毒的策略。
文档编号C07K14/085GK102604969SQ20121002890
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者岑山, 张永欣, 金奇 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所