专利名称：：一种检测感染性轮状病毒的方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测感染性轮状病毒的方法。技术背景通过水传播的病原微生物是危害人类健康和生态安全的重大隐患，全世界约有1/4的疾病是由水中病原微生物直接或间接引起的(Gerba,C.P.，Pathogensintheenvironment.In:Pepper,I丄，Gerba,C.P.，Brusseau，M丄(Eds.),PollutionScience.AcademicPress,NewYork,1996.p.279-299)。轮状病毒是水环境中广泛存在的病原微生物之一，主要来自人和动物的排泄物(MortezaAbbaszadegan，PeterStewart,1andMarkLeChevallierAStrategyforDetectionofVirusesinGroundwaterbyPCRAppliedandEnvironmentalMicrobiology,February1999，65(2):444-449)。在全球范围内，轮状病毒是引起腹泻最主要的原因，每年因水传播轮状病毒造成腹泻人数约为1.11亿，死亡人数高达44万(UmeshD.Parashar，ErikG.Hummelman，JosephS.Bresee，MarkA.Miller,卞andRogerI.GlassGlobalIllnessandDeathsCausedbyRotavirusDiseaseinChildrenEmergingInfectionsDiseases2003Vol.9，No.5)。我国秋冬季节50%60%的婴幼儿腹泻都是由轮状病毒引起的(常汝需，何翠娟.腹泻患儿粪便标本中轮状病毒检测方法比较[J].中华儿科杂志，2000，38(11):703704)。同时，轮状病毒还可以感染动物，是动物病毒性腹泻的主要原因(Bernd-AndreasSchwarz，ReinhardBange,ThomasW.Vahlenkamp，ReimaxJ"ohne，HermannMullerDetectionandquantitationofgroupArotavirusesbycompetitiveandreal-timereversetranscription-polymerasechainreactionJournalofVirologicalMethods105(2002)277-285)。这些轮状病毒进入水环境中后，在相当长的时间里仍保持较高的传染性和致病性，常规的水处理和消毒工艺不能完全将其去除禾口灭活(Hambidge，A.，Reviewingefficacyofalternativewatertreatmenttechniques.HealthEstate2001.55(6)，23-25)，已有众多研究者在污水(Baggi，F.，Peduzzi，R.，2000.GenotypingofrotavirusesinenvironmentalwaterandstoolsamplesinSouthernSwitzerlandbynucleotidesequenceanalysisof189basepairsatthe5—endoftheVP7gene.J".Clin.Microbiol.38，3681-3685)、地表水(Baggi,F.，Peduzzi，R.，2000.GenotypingofrotavirusesinenvironmentalwaterandstoolsamplesinSouthernSwitzerlandbynucleotidesequenceanalysisof189basepairsatthe5—endoftheVP7gene.J.Clin.Microbiol.38，3681-3685;Gilgen,M.，Germann,D.,Luthy，J".，Hubner,Ph.,1997.Three-stepisolationmethodforsensitivedetectionofenterovirus,rotavirus,hepatitisAvirus,andsmallroundstructuredvirusesinwatersamples.Int.J.FoodMicrobiol.37，189-199)、地下水以及饮用水(Gratacap-Cavallier，B.，Ge画laz，0.，Brengel-Pesce，K.，Soule，H.，Innocenti-Francillard,P.，Bost，M.,Gofti，L，Zmirou，D.，Seigneurin，J.M.,2000.Detectionofhumanandanimalrotavirussequencesindrinkingwater.Appl.Environ.Microbiol.66，2690-2692)中检测出轮状病毒。因此，快速准确检测水环境中的轮状病毒，对于降低轮状病毒感染风险、预防控制轮状病毒疾病爆发流行、保障水质安全具有十分重要的意义。水环境样品中轮状病毒传统检测方法是细胞培养法，这种方法操作复杂、所需时间长，特异性不强，而且此方法还需要专门的实验室和技术人员，限制了其在水质管理中的广泛应用。近十多年来，分子生物学技术的迅速发展，呈现灵敏、特异、快速等优点，为水环境中轮状病毒的快速检准确检测提供了新手段，成为水环境中轮状病毒检测的研究热点。Kittigula等(LeeraKittigula,SomEkchaloerakieta，FuangfaUtraxachkija，KanokratSiripanichgona，DusitSujiraratb，SupomvitPungchittona，AugsanaBoonthumcAnefficientvirusconcentrationmethodandRT—nestedPCRfordetectionofrotavirusesinenvironmentalwatersamplesJournalofVirologicalMethods124(2005)117-122)在RV的VP7上设计引物，利用RT-nest-PCR方法检测河流、生活污水和污水中的RV，最低可检测到1.67PFU的RV，进而对RT-nest-PCR的扩增产物进行序列分析，所有的结果都符合VP7的基因序列。但是单纯利用这些方法只能确定水环境样品中是否存在轮状病毒的核酸，并不能提供其是否具有感染性等信息。(Clinicalmicrobiologicalreview65:4118—4125，2003)。
发明内容本发明的目的是提供一种检测感染性轮状病毒的方法。本发明所提供的检测感染性轮状病毒的方法，是将待检测样品和轮状病毒的宿主细胞共培养，然后提取所述宿主细胞的总RNA，利用由核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段组成的引物对进行RT-PCR，如待检测样品中得到300-400bp的PCR产物，则所述待检测样品中有感染性轮状病毒。所述PCR产物的大小具体为318bp。所述共培养的时间具体可为24-72小时。该方法中，其培养的条件为培养宿主细胞的条件。所述待检测样品具体可为水样。其中，所述待检测样品在与轮状病毒的宿主细胞共培养之前，需对待测样品进行如下处理1.将大体积水样浓縮，如浓縮至lml。2.将待测样品用0.2um的无菌滤器过滤除菌。3.向除菌后的待测样品中加入无菌胰酶，混匀，37"C温育lh，以提高轮状病毒感染宿主细胞的能力。所述轮状病毒的宿主细胞优选为容易培养的动物细胞，如MA-104细胞(恒河猴肾细胞系)。其中，序列表中序列1的核苷酸序列是5'-CCTCACTTATACACTTTGCC-3';序列表中序列2的核苷酸序列是5'-TTCGCTTCGTCAGTTTGCT-3'。本发明中所用的上下游引物分别为序列1和序列2，该引物位于与轮状病毒感染性密切相关的结构蛋白VP7的保守区域，因此基于此建立的方法可检测广泛的、具有感染性的轮状病毒，提高了检测范围和精度。本发明的方法将传统检测轮状病毒的细胞培养法与RT-PCR方法相结合，利用RT-PCR方法快速、灵敏、特异地检测感染性轮状病毒在宿主细胞(如MA-104)中复制产生的RNA来检测具有感染性的轮状病毒。本发明方法一方面通过细胞培养法识别扩增环境样品具有感染性的轮状病毒，提高其检测的敏感性，降低环境样品中杂质对后续RT-PCR反应的干扰，另一方面利用轮状病毒致病基因VP7保守片断设计的特异性引物及优化后的RT-PCR反应条件，快速灵敏准确地检测细胞中复制的轮状病毒RNA，最终达到快速准确检测环境中具有感染性轮状病毒的目的。本发明不仅具有特异性好、灵敏度高、抗杂质干扰能力强等优点，而且还能提供环境介质中轮状病毒潜在的感染效应等信息，为快速检测环境介质中具有感染性的轮状病毒、评估环境中轮状病毒感染风险、预防轮状病毒疾病爆发流行提供强有力的技术支持。图1为Trizol法提取RNA的琼脂糖凝胶电泳结果图2为不同退火温度的PCR结果图3为ICC-RT-PCR方法检测不同感染时间的轮状病毒的情况图4为ICC-RT-PCR方法检测饮用水中具有感染性的轮状病毒结果具体实施方式实施例1、检测感染性轮状病毒的方法1.轮状病毒滴度测定采用组织培养半感染量(Mediantissuecultureinfectiondose，TCID5。)滴定。1)轮状病毒宿主细胞MA-104细胞系的培养将恒河猴肾细胞系MA-104细胞株接种于5ml含有10%FBS的DMEM高糖细胞培养液中，37°C5%0)2培养箱培养，每2—3天传代一次。传代时取长满单层的细胞，弃去陈旧细胞培养液，用少量PBS溶液清洗细胞表面一次，加入少量胰酶消化液(能盖住细胞表面即可)，37'C消化。显微镜下观察，待大部分细胞肿胀、变圆时，加入含有10X胎牛血清的DMEM(高糖)细胞培养液，用吸管反复吹打几次，形成均匀的细胞悬液，900rpm离心5min，弃上清，加入10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，按l:2比例移至新的细胞培养瓶中，37°C5%(:02培养。取生长到90X汇合的MA-104细胞，用2.5X的胰酶消化MA-104细胞，吹打成细胞悬液并计数，配成8000—10000个细胞/100wl的细胞悬液。迅速加入到96孔板中，每孔100ul，在加入96孔板的过程中不断吹打混匀。37°C，5%0)2孵育24h左右，待细胞长至90%汇合，用于接种病毒。2)轮状病毒标准株的培养(1)取约500u1轮状病毒SA-11株(ATCC号为VR-1565)病毒液，加入等体积0.002%的胰酶，混匀，37。C温育lh。(2)将胰酶处理后的RVSA-11接种于生长良好的MA-104单层细胞，37。C吸附2h，每隔20min摇动一次，以便RV与细胞充分接触。(3)去除所有吸附液体，加入5ml含2%FBS的DMEM培养基。(4)37°C，5%0)2孵育5-8天，见明显细胞病变效应CPE(细胞变大变圆、脱落)。(5)收获细胞培养液，反复冻融3次，800rpm离心5min，去除细胞碎片。(6)混匀后分装，一8(TC保存备用。3)轮状病毒感染宿主细胞MA-104细胞系分别取100yl轮状病毒SA-ll株培养液，按l:IO梯度稀释，g卩lOOiU病毒液加入900ul无血清DMEM培养基，混匀。依次稀释，更换吸头。使其成为10°、10—1、10_2、10—3、10—4、10—5、10—e共7个稀释梯度。将不同稀释梯度的病毒液加到96孔板种，每个稀释度重复6孔，每孔加入100yl病毒稀释液，37°C,5%C02孵育lh，每孔加入含2%FBS的DMEM培养基。分别设置病毒阳性对照(100y110°稀释度SA-11株培养液)和阴性对照(lOOulDMEM培养基)。每日观察、记录不同稀释梯度发生细胞病变(CPE)的孔数，直到阴性对照细胞完全脱落为止。根据Reed-Muench，计算TCID50。结果如表l所示，表明SA-11株TCID50在10—3(100%)和10—4(17%)之间，距离比=(高于50%的百分数一50)/(高于50%的百分数一低于50%的百分数)=(92.8—50)/(92.8—14.3)=0.5将计算得到的距离比0.5加在高于50%的病毒稀释度的对数(3)上，因此该病毒的TCIDs。为100u110—"稀释的病毒液，査反对数，为3548，即该病毒液100ul稀释3548倍，为1个TCID50。lmLTCID50为10—45，Log(TCID5。/mL)为4.5。实验测得步骤2)获得含SA-11株病毒液的滴度为10"TCID5。/mL。表l、SA-11株TCID50测定原始数据<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2、RT-PCR的方法A、细胞RNA提取及质量鉴定方法(1)取lml滴度为101'5TCID5。/mL轮状病毒SA-11株(ATCC号为VR-1565)的轮状病毒液，分别加入100u1的0.002%的胰酶37。C孵育lh。(2)取培养至90%汇合的MA-104细胞(25cm2)，用无菌PBS缓冲液洗2次，接种胰酶处理后的轮状病毒液，37'C吸附2h，每隔20min摇动一次细胞培养瓶，以便病毒充分接触细胞。(3)去除所有吸附液，加入3mL含2XFBS的DMEM培养基，37°C，5%0)2培养2天，用Trizol法提取细胞总RNA。B、Trizol法提取细胞总RNA(1)去除细胞瓶中所有培养液，迅速加入lmLTrizol提取试剂，摇动5min，使得Trizol与细胞充分接触，以充分裂解蛋白，吸入到1.5ml离心管中。(2)加入200nl三氯甲烷，剧烈振荡30slmin，室温放置510rain;4°C，13000rpm，离心15min。(3)吸取上层液体于等体积(约600iU)异丙醇中，剧烈振荡30slmin，室温放置10min，4°C，13000rpm，离心15min(在离心管底部可看到少许沉淀。)。(4)弃上清，加lmL75X乙醇(DEPC水配制)，轻轻弹起沉淀，4°C，8000rpm，离心8min。(5)弃上清，室温干燥5min，待乙醇完全挥发，加入20ulDEPC水，充分融解RNA。(6)立即做逆转录或者保存于一80°C。C、RNA质量检测RNA质量检测主要通过一下两种方法完成(l)用微量核酸定量仪测定0D260/0D280值及RNA的浓度，以OD260/OD280值处于1.92.2之间为好。部分样品检测结果如表2。表2Trizol法提取细胞RNA质量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)琼脂糖凝胶电泳取RNAlyl加入上样口，1%琼脂糖凝胶电泳，120V，电泳1015min，EB染色后凝胶成像系统下观察电泳结果，呈现两条明显的主带，分别为28S和18S，表明提取RNA质量较好。其中，部分样品检测结果如图1所示，图1中，1-6为用本发明的方法提取的不同样品。D、逆转录反应1)RNA逆转录为cDNA反应体系(10nl)为5XRT-buffer2u1dNTPMixture(各10mM)0.5u1OligodTPrimer(50mM)0.5u1Rtase(200U/U1)0.25u1RnaseInhibitor(40U/ul)0,25ulRNaseFreedH205.51RNA1u12)逆转录反应条件为42°C1015min95°C2min逆转录合成的cDNA直接用于PCR反应或者一2(TC保存。E、PCR反应的建立及优化1)引物设计在NCBI网站中下载人轮状病毒和猴轮状病毒株SA-ll的所有VP7的序列，利用Primer5.0软件进行引物设计和合成，引物的GC含量在40-60%之间，引物长度在1825bp之间，扩增产物〈400bp。设计引物序列如下VP7-sense(5-3):CCTCACTTATACACTTTGCC(序列1)VP7-antisense(5-3):TTCGCTTCGTCAGTTTGCT(序列2)2)退火温度选择其温度梯度由梯度PCR仪自动生成(表3)。其中，阴性对照模板为灭菌后的去离子水。表3梯度PCR的温度梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，退火温度如表3。4)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物扩增反应结束后取10!xl加2"1混匀，经2.5%琼脂糖凝胶电泳3040分钟后于紫外仪上观察；若在318bp处出现明亮的反应条带，则为轮状病毒阳性，否则为阴性。PCR结果如图2所示，表明适于VP7引物的退火温度为59。C。图2中，l至8对应于表3中的样品号，M为DNA分子量标准100bpDNALadder。F、在不同感染时间本发明的方法可检测到轮状病毒的最低感染滴度主要步骤如下-1.取培养增殖的轮状病毒液，依次稀释为lml滴度为(10—2510—85TCID5。/mL)的样品。2.向步骤1轮状病毒样品中加入100u1的0.002%的胰酶，37t:孵育lh。3.取培养至90%汇合的脆-104细胞(25cm2)，用无菌PBS缓冲液洗2次，接种步骤2处理后的轮状病毒液，37。C吸附2h，每20min摇动一次细胞培养瓶，以便病毒充分接触细胞。4.去除所有吸附液，加入3mL含2%FBS的DMEM培养。5.分别感染1，2，3，8天后，按照步骤B用Trizol法提取细胞总RNA。6.按照步骤D和E，对提取的总RNA进行RT-PCR，琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。其中，PCR的退火温度为59i:。结果如图3所示，表明在感染时间为2448h时，该方法最低可检测到lml滴度为10—"TCID5。/mL的轮状病毒；延长感染时间至72h，最低可检测lml滴度为l(T25TCID5。/mL的轮状病毒；培养感染轮状病毒的MA-104细胞8天，该方法可以检测到lml滴度为10—"的轮状病毒；观察细胞均没有明显病变现象。图3中，M:100bpDNALadder;(A):16，lml滴度分别1025，10"，10°'5，10—°5,l(T15，10—25TCID50/ml的轮状病毒感染MA-104细胞1天(24h)后检测结果；7，阳性对照；8，阴性对照。(B):911，lml滴度分别为10—15,l(T25，10—35TCID50/ml的轮状病毒感染MA-104细胞2天(48h)后检测结果；12，阳性对照；13，阴性对照。(C):1416，lml滴度分别为10—15，10—25，10—35TCID50/ml的轮状病毒感染MA-104细胞3天(72h)后检测结果；17，阳性对照；18，阴性对照。(D):1926，lml滴度分别为10—25，10—3.5，10-4.5，10-55，10-65,10—75，10—85TCID50/ml的轮状病毒感染MA-104细胞8天后检测结果；18，阴性对照。其中，阳性对照为细胞内参照e-actin的扩增产物，阴性对照模板为灭菌后的去离子水。其中+表示检测结果呈阳性，一表示检测结果为阴性。实施例2、ICC-RT-PCR方法检测饮用水中感染性轮状病毒1.分别向1L饮用水中投加100、10、1、0.ly1滴度为104'5TCID5。/ml的轮状病毒，使水样中轮状病毒的滴度分别为10°5、10—°5、l(T15、10—25TCID5。/ml，室温搅拌30min。2.分别水样中加入氯化铝，使其终浓度为0.05mol/L，搅拌。3.用孔径为0.45ym、直径为47mra的醋酸纤维滤膜过滤水样，滤速为100ml/min。使病毒吸附在滤膜表面。4.用50mlpH为3.0的112504溶液通过滤膜，滤速为100ml/min，以洗去滤膜表面阳离子。5.取下滤膜，用灭过菌的剪刀将滤膜剪碎，放入50ml离心管中，加入10mlpH为10.5的NaOH溶液，剧烈振荡3060s，放置510min，再剧烈振荡3060min。然后加入50ul50raMH2S04和200ul50XTE缓冲液，振荡以充分混匀。以洗脱滤膜吸附的病毒。6.将所有洗脱液转移至超滤管(截留分子量为50000道尔顿)中，4°C，2500rpm离心510min，浓縮至O.5lml。7.用孔径为0.2ixm的无菌滤器过滤浓縮至lml的待测水样，以去除细菌。8.将除菌后的水样加入100u1无菌的0.002%的胰酶37。C孵育lh，以提高病毒感染宿主细胞的能力。9.然后用2ml无血清的DMEM培养基通过滤器，以减少水样通过滤器损失。10.取培养至90X汇合的MA-104细胞(25cm2)，用无菌PBS缓冲液洗2次，将过滤后的水样和DMEM培养基接种于MA-104细胞，37。C吸附2h，每20min摇动一次细胞培养瓶，以便病毒充分接触细胞。11.去除所有吸附液，加入3mL含2XFBS的DMEM培养基，37°C，5%0)2培养。12.感染2天后，按照实施例1的Trizol法提取细胞总RNA。13.对提取的RNA按照实施例1的方法进行RT-PCR、琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。其中，PCR的退火温度为59°C。结果如图4所示，轮状病毒的滴度分别为10°'5、IO一05、10—15、10—25TCID50/ml的水样检测结果均为阳性。图4中，M:lOObpDNALadder;14，1L轮状病毒滴度分别10°'5，10-。5，,5，1(F25TCID50/ml的饮用水样经浓缩后，感染MA-104细胞2天(48h)的检测结果；5，未感染的MA-104细胞对照；6，阳性对照模板为滴度为10"TCID5。/mLSA-ll株病毒培养液；7，阴性对照模板为灭菌后的去离子水。其中+表示检测结果呈阳性，一表示检测结果为阴性。序列表<160>2〈210〉1<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223><400>1cctcacttatacactttgcc20〈210〉2<211〉19<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉〈400〉2ttcgcttcgtcagtttgct19权利要求1、一种检测感染性轮状病毒的方法，是将待检测样品和轮状病毒的宿主细胞共培养，然后提取所述宿主细胞的总RNA，利用由核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段组成的引物对进行RT-PCR，如待检测样品中得到300-400bp的PCR产物，则所述待检测样品中有感染性轮状病毒。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述共培养的时间为24-72小时。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR产物的大小为318bp。4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述宿主细胞为MA-104细胞。5、根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述待检测样品为水样。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述水样在与轮状病毒的宿主细胞共培养之前，对所述水样进行如下处理将水样浓縮，过滤除菌；向除菌后的待测样品中加入无菌胰酶，混匀，37'C温育lh。全文摘要本发明公开了一种检测感染性轮状病毒的方法。该检测感染性轮状病毒的方法，是将待检测样品和轮状病毒的宿主细胞共培养，然后提取所述宿主细胞的总RNA，利用由核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段组成的引物对进行RT-PCR，如待检测样品中得到300-400bp的PCR产物，则所述待检测样品中有感染性轮状病毒。本发明不仅具有特异性好、灵敏度高、抗杂质干扰能力强等优点，而且还能提供环境介质中轮状病毒潜在的感染效应等信息，为快速检测环境介质中具有感染性的轮状病毒、评估环境中轮状病毒感染风险、预防轮状病毒疾病爆发流行提供强有力的技术支持。文档编号C12Q1/68GK101126107SQ20071012035公开日2008年2月20日申请日期2007年8月16日优先权日2007年8月16日发明者苗何,丽刘,施汉昌,丹李,胡秀华申请人:清华大学