专利名称：一种快速细菌细胞裂解试剂配方的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物快速检测技术领域，提供一种快速细菌细胞裂解试 剂配方。
背景技术：
细菌总数指标与食品的腐败变质、食品被污染的程度有密切关系，是 对人体健康可能造成危害的一种信号，国内外己把这个指标作为衡量食品 被微生物污染程度的重要指标。细菌总数指标，作为食品卫生安全的必检 项目，则必须进行抽查取样送交至技术中心检测。当前，细菌总数检测，
国内外普遍采用的是平板计数法，这种方法需要对微生物进行培养24 48 小时，检验周期长，操作繁琐，费时费力，且需专业人士操作，不易现场 检测、极大影响工作效率。所以开发一种快速、准确、简便的用于食品卫 生现场快速检测的仪器，在食品卫生安全控制中将具有重大的需求及现实 意义。
三磷酸腺苷(ATP)生物荧光法是现阶段国外研究和应用较多的一种 细菌总数检测方法，因该法无需进行微生物培养，且操作简单，测试速度 快，所以目前此方法已受到广泛关注。三磷酸腺苷(ATP)生物荧光法的
理论基础是基于待测食品或器具一定表面积上所含的细菌个数是一定的， 且每种细菌个体所含的三磷酸腺苷(ATP)量在常态下都处在同一个数量 级上。其检测基本原理是首先利用细菌细胞裂解剂将细菌细胞破碎，释放
出胞内三磷酸腺苷(ATP)，在荧光素酶的催化作用下，三磷酸腺苷(ATP) 与荧光素反应释放荧光，荧光强度与三磷酸腺苷(ATP)量成比例，而三 磷酸腺苷(ATP)量与样品中细菌总数成比例，因此根据所检测到的生物 荧光量，依据荧光强度与细菌总数的对应关系，即可得知样品中细菌总数。 在三磷酸腺苷(ATP)生物荧光法检测中，其关键步骤是对细菌细胞 的裂解，细菌细胞裂解剂裂解释放三磷酸腺苷(ATP)的效率直接决定生 物荧光检测法的检测精度和检测限。进行细菌细胞裂解时，有三个因素需 要考虑，作为细菌细胞裂解剂，除了能够裂解细菌细胞膜释放三磷酸腺苷 (ATP);同时应能够抑止胞内三磷酸腺苷(ATP)降解酶，三磷酸腺苷(ATP) 降解酶可降解三磷酸腺苷(ATP)从而降低荧光强度；最后所引入的细菌 细胞裂解剂不能够对最终的三磷酸腺苷(ATP)生物荧光反应产生影响。 目前使用的细菌细胞裂解法有乙醇法，丁醇法、表面活性剂法、超声波法 和电场法等。在乙醇法和丁醇法中，乙醇和丁醇试剂较为温和，裂解效率 较低，裂解时间30min，且乙醇和丁醇的引入可对后续引入的荧光试剂产 生影响，致使本法应用范围受到限制；利用表面活性剂(如十二垸基磺酸 钠、曲拉通等)对细菌细胞进行裂解，三磷酸腺苷(ATP)产出率较高， 但表面活性剂不能抑止三磷酸腺苷(ATP)降解酶，同时长碳链化合物的 引入可对荧光试剂产生较为明显的影响，利用该方法进行生物荧光检测时 最低检测限较高，通常需要104 105 CFU/ml浓度的细菌总数，满足不了
实际检测要求。超声波法和电场法是近期出现的利用物理方法进行细菌细 胞裂解的方法，但利用这些方法通常需要配备专用仪器，使其在现场检测 应用受到限制。因此开发一种裂解速度快、三磷酸腺苷(ATP)产出率高、 同时抑止三磷酸腺苷(ATP)降解酶、操作方便的细菌细胞裂解试剂具有 重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的就是针对上述裂解方法的不足，给三磷酸腺苷(ATP) 生物荧光检测法提供一种裂解速度快、三磷酸腺苷(ATP)产出率高、且 同时可抑止三磷酸腺苷(ATP)降解酶、操作方便，易于配制且成本较低 的细菌细胞裂解试剂，从而大大提高三磷酸腺苷(ATP)生物荧光法检测 速度，建立一种方便快捷的细菌总数现场检测方法，可解决大量的食品卫 生现场检测工作的难题。
本发明的又一目的是提供一种试剂，该试剂可用于三磷酸腺苷(ATP) 生物荧光法中对细菌细胞进行快速裂解；同时可抑止细菌细胞内三磷酸腺 苷(ATP)降解酶；三磷酸腺苷(ATP)产出率高；可进行现场快速检测， 满足食品卫生检测的需要。
为达到以上目的，本发明的技术解决方案是
一种快速细菌细胞裂解试剂配方，用于三磷酸腺苷(ATP)生物荧光 法中对细菌细胞进行快速裂解；其试剂配方包括至少一种酸性细菌细胞裂
解试剂和至少一种碱性中和试剂，并添加至少一种有机营养剂和至少一种
无机盐溶剂；
酸性细菌细胞裂解试剂，是从氯酸、高氯酸、硫酸、硝酸、三氯乙 酸、焦磷酸、氢氟酸、焦硫酸、盐酸、乙酸中至少选取一种组成；
碱性中和试剂，是从碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氨 水、氢氧化钙、氢氧化镁中至少选取一种组成；
有机营养剂，是从蛋白粉、L-2， 6-二氨基己酸盐酸盐、N-羟甲基蛋 氨酸钙、葡萄糖酸内酯、a-氨基-p-羟基丁酸、D-葡萄糖酸钠、邻苯甲 酰磺酰胺钠、氯化-J3-羟乙基-N,N,N-三甲基铵、葡萄糖、乙酸三甲铵内 盐、葡萄糖酸钙、果糖中至少选取一种组成；
无机盐溶剂，是从碳酸钡、碘化钠、二氯氧化锆、氟化钾、六水合 溴化镁、无水钾镁矾、氯化钠、氯化钾、氯化钙、碳酸钾、硝酸钾、硝酸 钠中至少选取一种组成。
所述的试剂配方，其所述酸性细菌细胞裂解试剂浓度在0.01 1.0 mol/L之间选取。
所述的试剂配方，其所述酸性细菌细胞裂解试剂，其细菌细胞裂解 时间在1 10 min之间选取。
所述的试剂配方，其所述碱性中和试剂浓度在0.01 1.0 mol/L之 间选取；其pH值在6. 5 8. 5之间。
所述的试剂配方，其所述碱性中和试剂，其中和时间在1 60 s之 间选取。
所述的试剂配方，其所述有机营养剂浓度在0. 01 0. 50 mol/L之间选取。
所述的试剂配方，其所述无机盐溶剂浓度在0. 01 0. 50 mol/L之间
选取。
本发明的试剂配方，用于三磷酸腺苷(ATP)生物荧光法中对细菌细 胞进行快速裂解，同时可抑止细菌细胞内三磷酸腺苷(ATP)降解酶；三
磷酸腺苷(ATP)产出率高；可进行现场快速检测，满足食品卫生检测的
需要。
图l是利用本细菌细胞裂解试剂配方快速裂解大肠杆菌的测试对比示
意图2是利用本细菌细胞裂解剂进行细菌梯度稀释样品的裂解检测结果图。
具体实施例方式
本发明提出了一种快速细菌细胞裂解试剂配方，该试剂至少包括以下
四种试剂
至少一种酸性细菌细胞裂解试剂，所述酸性细菌细胞裂解试剂从氯 酸、高氯酸、硫酸、硝酸、三氯乙酸、焦磷酸、氢氟酸、焦硫酸、盐酸、
乙酸中选取，浓度在0.01 1.0 mol/L之间选取，优选浓度0.03 mol/L， 裂解时间在1 10 min之间选取，优选裂解时间5 min。
该试剂与细菌细胞作用，扩大细菌细胞壁的空隙度，增加细菌细胞膜 的通透性，从而释放出胞内三磷酸腺苷(ATP)。
至少一种碱性中和剂，所述碱性中和剂从碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化
钠、氢氧化钾、氨水、氢氧化钙、氢氧化镁中选取，浓度在0.01 1.0mol/L 之间取定，优选浓度O. 03 mol/L，中和时间在1 60 s之间选取，优选中 和时间10 s。
该试剂的引入可对细菌细胞裂解液进行中和，调节试剂pH值在6. 5 8. 5之间，优选pH值7.8。
至少一种有机营养剂，所述有机营养剂从蛋白粉、L-2， 6-二氨基己 酸盐酸盐、N-羟甲基蛋氨酸钙、葡萄糖酸内酯、cx-氨基-e-羟基丁酸、 D-葡萄糖酸钠、邻苯甲酰磺酰胺钠、氯化-6-羟乙基-N，N，N-三甲基铵、 葡萄糖、乙酸三甲铵内盐、葡萄糖酸钙、果糖中选取，浓度在0.01 0.50 mol/L之间选取，优选浓度O. 20 mol/L。
所选用的有机营养剂可使检测样品中细菌能够保持正常的新陈代谢， 从而使细菌细胞内三磷酸腺苷(ATP)水平维持一个较高的水平，增加三 磷酸腺苷(ATP)产出率。
至少一种无机盐溶剂，所述无机盐溶剂从碳酸钡、碘化钠、二氯氧 化锆、氟化钾、六水合溴化镁、无水钾镁矾、氯化钠、氯化钾、氯化钙、 碳酸钾、硝酸钾、硝酸钠中选取，所用浓度在0.01 0.50 mol/L之间选 取，优选浓度O. 20 mol/L。
所选用无机盐溶剂具有调节渗透压的功能，可使样品中细菌细胞处在 一个正常的渗透压范围内，增加细菌细胞的稳定性。
下面结合具体实施例对本发明进行描述
实施例l
从下列化合物所示浓度制备一种试剂
化合物 浓度
高氯酸 0. 10 mol/L
氢氧化钾 0. 10 mol/L
葡萄糖酸钙 0. 15 mol/L
氯化钾 0. 15 mol/L
实施例2
从下列化合物所示浓度制备一种试剂
化合物 浓度
硫酸 0. 10 mol/L
氢氧化钾 0. 20 mol/L
果糖 0. 25 mol/L
碘化钠 0. 25 mol/L
实施例3
从下列化合物所示浓度制备一种试剂
化合物 浓度
三氯乙酸 0.03 mol/L
氢氧化钠 0. 03 mol/L
葡萄糖 0. 20 mol/L
氯化钠 0. 20 mol/L
将以上试剂按所示浓度进行混合，并调节pH在6. 5 8.5之间，从而 制备出细菌细胞裂解剂。利用上述试剂组合的一种，对含有一定量大肠杆 菌样品(lX107CFU/mL)进行有无细菌裂解剂对比实验。实验中首先取细 菌悬浮液30 nL加入检测池中，弓l入30 (iL配好的细菌细胞裂解剂混合均 匀，裂解时间5min，将检测池移入荧光检测仪中(如日本F4500，自主 研发细菌总数检测仪TX2007-1)，启动检测，20 s后利用注射装置注入荧 光反应剂100i^L，记录荧光信号，对比测试结果如图l所示。由图l可 以看出，相对于无细菌细胞裂解试剂引入的样品，利用本细菌细胞裂解试 剂可对细菌细胞进行快速裂解，5min内即可得到较高的三磷酸腺苷(ATP) 产出率。图2是利用本细菌细胞裂解剂进行细菌梯度稀释样品的裂解检测 结果图，由图2可以看出，在细菌总数101 107 CFU/mL的范围内，本细 菌细胞裂解剂均由较高的细菌裂解能力，三磷酸腺苷(ATP)产出率高， 发光强度和细菌总数在对数情况下成线性关系，可检测到10 CFU/mL浓度 的细菌样品，可以满足微生物三磷酸腺苷(ATP)生物荧光检测法中对细 菌细胞快速裂解的需要。
以上实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。在上述说 明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围 内，本发明可以有不同于上述的其它实现方式，选用其它关联试剂、改变 试剂浓度等方法均在本发明专利要求范围之内。
权利要求
1.一种快速细菌细胞裂解试剂配方，用于三磷酸腺苷(ATP)生物荧光法中对细菌细胞进行快速裂解；其特征在于，该试剂配方包括至少一种酸性细菌细胞裂解试剂和至少一种碱性中和试剂，并添加至少一种有机营养剂和至少一种无机盐溶剂；酸性细菌细胞裂解试剂，是从氯酸、高氯酸、硫酸、硝酸、三氯乙酸、焦磷酸、氢氟酸、焦硫酸、盐酸、乙酸中至少选取一种组成；碱性中和试剂，是从碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、氢氧化钙、氢氧化镁中至少选取一种组成；有机营养剂，是从蛋白粉、L-2，6-二氨基己酸盐酸盐、N-羟甲基蛋氨酸钙、葡萄糖酸内酯、α-氨基-β-羟基丁酸、D-葡萄糖酸钠、邻苯甲酰磺酰胺钠、氯化-β-羟乙基-N，N，N-三甲基铵、葡萄糖、乙酸三甲铵内盐、葡萄糖酸钙、果糖中至少选取一种组成；无机盐溶剂，是从碳酸钡、碘化钠、二氯氧化锆、氟化钾、六水合溴化镁、无水钾镁矾、氯化钠、氯化钾、氯化钙、碳酸钾、硝酸钾、硝酸钠中至少选取一种组成。
2. 如权利要求1所述的试剂配方，其特征在于，所述酸性细菌细胞 裂解试剂浓度在0. 01 1. 0 mol/L之间选取。
3. 如权利要求1所述的试剂配方，其特征在于，所述酸性细菌细胞 裂解试剂，其细菌细胞裂解时间在1 10 min之间选取。
4. 如权利要求l所述的试剂配方，其特征在于，所述碱性中和试剂 浓度在O. 01 1.0 mol/L之间选取；其pH值在6. 5 8. 5之间。
5. 如权利要求1所述的试剂配方，其特征在于，所述碱性中和试剂， 其中和时间在1 60 s之间选取。
6. 如权利要求l所述的试剂配方，其特征在于，所述有机营养剂浓 度在0. 01 0. 50 mol/L之间选取。
7. 如权利要求l所述的试剂配方，其特征在于，所述无机盐溶剂浓 度在0. 01 0. 50 mol/L之间选取。
全文摘要
本发明公开了一种快速细菌细胞裂解试剂配方，涉及检测技术领域，该试剂配方包括至少一种酸性细菌细胞裂解试剂和至少一种碱性中和试剂，并添加至少一种有机营养剂和至少一种无机盐溶剂。该试剂具有细菌细胞裂解速度快、三磷酸腺苷(ATP)产出率高、同时可抑止细胞内三磷酸腺苷(ATP)降解酶，操作方便，易于配制，且成本较低等优点，很适合在微生物快速检测领域里对细菌细胞进行快速裂解用。
文档编号C12N1/06GK101368157SQ20071012028
公开日2009年2月18日 申请日期2007年8月15日 优先权日2007年8月15日
发明者何保山, 周爱玉, 岳伟伟, 罗金平, 蔡新霞 申请人:中国科学院电子学研究所