专利名称：：培育微量增加植物细胞分裂素的转基因植物的方法及专用转录融合双基因片段的制作方法
技术领域：
：本发明涉及培育微量增加植物细胞分裂素的转基因植物的方法及专用转录融合双基因片段。技术背景植物细胞分裂素(Cytokinins)在植物的生长发育过程中起着非常重要的作用。它能促进细胞分裂;茎的分化；促进光合作用；加强植物营养代谢；增强植物抗衰老能力和对环境的抵抗力。例如，当植物受高温胁迫时，植物细胞分裂素能使植物迅速产生自身调控，使植物恢复正常生长状态。植物细胞分裂素还能迅速传送到感病部位以增加植物的抵抗力。植物细胞分裂素还具有抗虫和促进伤口愈合的功能。植物细胞分裂素对植物体内能量的吸收和储藏代谢有显著的促进作用，有利于提高农作物产量(Mok等Cytokinins:Chemistryactivityandfunction.BocaRaton,FL:CRCpress(1994);Dewitte等Dynamicsofcytokininsinapicalshootmeristemsofaday-neutraltobaccoduringfloraltransitionandflowerformation.PlantPhysiol.119，111-121，1999;Kerstetter等Shootmeristemformationinvegetativedevelopment,PlantCell9，1001-1010.1997)。植物细胞分裂素Cytokinins同所有激素一样，属于微量调节，故此，生物调节反应必须在细胞体内允许的植物激素浓度范围内进行。调节反应的速度和强度在细胞允许的生理浓度范围内，激素含量越高，作用越大。农杆菌中细胞分裂素合成关键酶基因—异戊烯基转移酶基因(&0转入植物，已经证明在植物体内能合成植物激素Cytokinins(SmigockiAC等Cytokinin-to-auxinratiosandmorphologyofshootsandtissuestransformedbyachimericisopentyltransferasegene-PlantPhysiol91:808-811，1989;vanderGraaffEE等Altereddevelopmentofiira/^'c/c!AS7'51^^aJiaoacarryingthe4§^o/scfe_rii//fftUffle/3Cie/51genepartiallyduetoethyleneeffects.PlantGrowRegul34:305-315，2001)。同时也证明Cytokinins在植物体内大量增加，导致植物生长严重不正常，甚至死亡(GengS等Effectsof_z'/^geneexpressiononthephysiologicalandchemicalcharacteristicsofylrfe肌'57'as朋朋L..PlantSci160:691-698，2001)，古戈此，Cytokinins的应用必须控制在植物正常生长的有效范围内。用强启动子在转基因植物中表达ipf基因，Cytokinins过量产生，严重影响植物的生长，所以研究i/^基因弱表达的方式是运用植物细胞分裂素对植物生长发育产生积极作用的有效途径。基因是生物体染色体上的一段DNA序列。基因的表达，表达的模式，时空的调控，量的变化是一个复杂的调控过程，它的表达受启动子和转录因子的调控。包括.-基因表达在染色体结构水平上的调控；转录水平上的调控；转录后调控；翻译及翻译后加工的调控。在同一转录单位内的双基因融合表达有两种方式，即转录融合(transcriptionalfusion)禾口番羽i畢融合(translationalfusion)。转录融合是指融合的双基因各自拥有一个完整的阅读框架，各自保留其翻译的启始密码子和终止密码子，双基因之间以短核甘酸片段连接，融合的双基因在转录过程中被转录成一条mRNA分子，但raRNA分子被核糖体翻译成两种独立的蛋白质；而翻译融合是指融合的双基因的第一基因去除终止密码子，第二基因去除启始密码子，融合的双基因在转录过程中被转录成一条mRNA分子，但mRNA被核糖体翻译成一个包括两个基因的蛋白质(RogersSG等EvidenceforribosomescanningduringtranslationinitiationofmRNAsintransformedplantcells.PlantMol.Biol.Rep.3:111-116，1985;PeabodyDS等EffectofupstreamreadingframesontranslatedefficiencyinSimianVirus40recombinants.Mol.CellBio.6:2704—2711，1986)。根据Kozak核糖体转录翻译原则，受控于同一启动子的转录融合基因，由于核糖体在翻译的过程中，受到第一基因终止密码子和双基因之间短核甘酸片段的影响，有一些核糖体不能跨越这两种障碍，启动子将就近优先启动，既相对独立的双基因如果受控于同一启动子，距离启动子近的基因的表达量将大大的高于距离启动子远的基因的表达量(KozakM，HowdoeucaryoticribosomeselectinitiationregioninmessengerRNA.Cell15:1109-1123，1986;VanDuijnLP等SecondarystructureandexpressioninvivoandinvitroofmessengerRNAintowhichupstreamAUGcodonhavebeeninserted.Eur.J.Biochem.172:59-66，1988)。图i表示双基因转录融合表达核糖体的翻译过程。
发明内容本发明的目的是提供一种用^f基因转录融合其他功能基因在转基因植物中微量增加植物细胞分裂素，对植物生长发育产生积极作用的方法及其^t基因转录融合双基因片段，含有i;^基因转录融合双基因片段的表达盒、重组植物表达载体和细胞系。本发明所提供的可微量增加植物中植物细胞分裂素的转录融合双基因片段，其自5'—3'方向的排列顺序依次为除异戊烯基转移酶基因(&t)外的功能基因、2-60bp其排列中不具有ATG组合的脱氧核糖核苷酸片段和异戊烯基转移酶基因。所述异戊烯基转移酶基因编码的氨基酸序列如序列表中的序列1所示，由240个氨基酸残基组成。所述异戊烯基转移酶基因是具有完整阅读框架的基因，来源于农杆菌。它的核苷酸序列具体可为自GenBankAccessionNumberAF242881的5'末端第7864-8586位脱氧核糖核苷酸。所述除异戊烯基转移酶基因外的功能基因是任何具有功能的基因。所述双基因中间的插入片段由排列中不具有ATG组合的四种脱氧核糖核苷酸组成，具体长度可为2-60bp。含有任何功能基因与^^基因转录融合双基因的表达盒也属于本发明的保护范围。所述表达盒自5'—3'方向的排列顺序依次为组成型强启动子、除异戊烯基转移酶基因外的任何功能基因、2-60bp其排列中不具有ATG组合的四种脱氧核糖核苷酸序列、异戊烯基转移酶基因和多聚A尾。其中，所述启动子具体可为组成型启动子，可来源于微生物或植物，如CaMV35S启动子(序列表中的序列2)。本发明的转录融合双基因由于同受一个启动子和polyA的控制，是一个完整的转录单位。在转录过程中被转录成一条包括两个基因的mRNA。该转录融合双基因mRNA被翻译为独立的两个蛋白质。第一个功能基因由于距离启动子近，其mRNA受到强启动子作用，过量表达，合成的蛋白质含量高；而第二个基因，异戊烯基转移酶基因由于受到其前面第一个基因的终止子和双基因之间插入的核苷酸碱基影响了核糖体对它的翻译，合成的蛋白质含量低。含有上述任一种转录融合双基因片段，或上述任一种表达盒的任何重组植物表达载体也属于本发明的保护范围。含有上述任一种转录融合双基因片段，或上述任一种表达盒，或上述任一种重组植物表达载体的转基因细胞系也属于本发明的保护范围。本发明所提供的培育微量增加植物细胞分裂素的转基因植物的方法，是将上述任一种转录融合双基因片段，或上述任一种表达盒，或上述任一种重组植物表达载体导入植物中，得到微量增加植物细胞分裂素的转基因植物。本发明的方法适合于单子叶植物和双子叶植物。实验证明，本发明方法获得的微量增加植物细胞分裂素的转基因植物表现为生长快，侧枝多，叶绿素含量高，延期衰老。本发明将植物细胞分裂素合成酶关键酶基因i;^与其他基因进行转录融合，并将^^基因置于转录融合双基因的第二位置，两基因之间插入一段核苷酸序列。由于ipt基因的翻译受到第一基因和两基因之间插入核苷酸序列的影响，将大大降低它的表达，使植物细胞分裂素(Cytokinins)在转基因植物中微量增加，使其对植物生长发育产生积极作用转入该转录融合双基因的转基因植物植物生长快，侧枝多，叶绿素含量高，延期衰老。另外第一基因过量表达，所以在生产实践中需要大量生产的蛋白均可以放于此处表达。本发明可用于植物的品质改良中，特别是可用于要转入对植物生长有阻碍作用基因的转基因植物的品质改良中，如抗逆植物的品质改良。抗逆基因对植物的生长有阻碍作用，将它与异戊烯基转移酶基因^t转录融合，^^基因的弱表达，可改善转基因植物的生长。本发明将植物细胞分裂激素合成关键酶-异戊烯基转移酶基因ipt与其他基因以转录融合表达的方式转入到植物中，使植物中微量增加植物细胞分裂激素，在植物(如粮食作物，经济作物)的分子育种中，特别是转基因育种中具有广阔的应用前图1为双基因转录融合表达的核糖体翻译示意图。图2为pVKH-35S-pA植物表达载体的物理图谱，其中35S为CaMV35S启动子(见序列2)图3为ipf和^^组成的转录融合双基因的植物表达载体的物理图谱A:pVKH-ipt-GUS转录融合表达载体。B:pVKH-GUS-ipt转录融合表达载体。图4为ipt基因转录检测、GUS染色检测和cytokinins含量测定。图A:pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt转基因植物GUS蛋白的生物化学染色。图B:pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt转基因植物植物细胞分裂素cytokinins图C:用RT-PCR的方法检测pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt转基因植物中基因的mRNA水平。图5为转基因植物的生长发育，对照为野生型拟南芥。图5-A:pVKH-ipt-GUS转基因拟南芥在培养基中培养3周。1为对照；2为转pVKH-ipt-GUS植物。图5-B:pVKH-ipt-GUS转基因拟南芥在培养基中培养形成边沿波浪型叶片。1为转pVKH-ipt-GUS植物；2为对照。图5-C:pVKH-ipt-GUS转基因拟南芥在土壤中培养60天。1为对照；2禾n3为转pVKH-ipt-GUS植物。图5-G:pVKH-GUS-ipt转基因拟南芥在培养基中培养3周。1和4为对照；2和3为转pVKH-GUS-ipt植物。图5-H，I:pVKH-GUS-ipt转基因拟南芥在土壤中培养30天和45天。l和4为对照；2和3为转pVKH-GUS-ipt植物。图6为i;^或i/^和JWW5^基因转录融合表达载体的物理图谱。图6-A:pVKH-AtGolS2-ipt转录融合表达载体。图6-B:pVKH-AtGolS2植物表达载体。图7为ipf转录融合^Wo75^基因的转基因烟草的生长发育状况。图7-A:转pVKH-AtGolS2-ipt烟草和转pVKH-AtGolS2烟草转基因烟草在培养基中培养3周。1为转pVKH-AtGolS2-ipt烟草；2为转pVKH-AtGolS2烟草；3为对照非转基因烟草。图7-B和图7-D:转pVKH-AtGolS2-ipt烟草和转pVKH-AtGolS2烟草在培养基中培养3周后，然后移栽到沙中培养3周；图7-D示7-B的根的发育。l为转pVKH-AtGolS2-ipt烟草;2为转pVKH-AtGolS2烟草;3为对照:非转基因烟草。图7-C:转pVKH-AtGolS2-ipt烟草和转pVKH-AtGolS2烟草在MS基本培养基中培养3周后，然后移栽到沙中培养3周，最后移栽到土壤培养3周。l为转pVKH-AtGolS2-ipt烟草；2为转pVKH-AtGolS2烟草。图8为转基因植物在盐，干旱和低温胁迫的条件下的生长情况。图8-A:转pVKH-AtGolS2烟草在正常、盐胁迫和干旱胁迫的条件下65天。l为转基因烟草对照在盐胁迫的条件下；2转pVKH-AtGolS2烟草在干旱胁迫的条件下；3为转pVKH-AtGolS2烟草在盐胁迫的条件下；4为转pVKH-AtGolS2烟草在非胁迫的条件下。图8-C:转pVKH-AtGolS2-ipt烟草在正常、盐胁迫和干旱胁迫的条件下65天。l为对照，非转基因烟草在盐胁迫的条件下；2转pVKH-AtGolS2-ipt烟草在干旱胁迫的条件下；3为转pVKH-AtGolS2-ipt烟草在盐胁迫的条件下；4为转pVKH-AtGolS2-ipt烟草在非胁迫的条件下。图8-B:转pVKH-AtGolS2烟草和转pVKH-AtGolS2-ipt烟草在8度人工气候培养箱中培养65天。l为对照非转基因烟草；2为转pVKH-AtGolS2-ipt烟草；3为转pVKH-AtGolS2烟草。图8-D:转pVKH-AtGolS2烟草和转pVKH-AtGolS2-ipt烟草在8度人工气候培养箱中培养65天后转移到正常条件下培养45天。l为对照非转基因烟草；2为转pVKH-AtGolS2-ipt烟草；3为转pVKH-AtGolS2烟草。图9为转基因植物叶片叶绿素含量测定结果.图9-A:转pVKH-AtGolS2烟草和转pVKH-AtGolS2-ipt烟草和非转基因烟草对照(CK)在低温胁迫下的叶绿素含量。图9-B:转pVKH-AtGolS2烟草和转pVKH-AtGolS2-ipt烟草和非转基因烟草对照(CK)在非胁迫下的叶绿素含量。图9-C:转pVKH-AtGolS2烟草和转pVKH-AtGolS2-ipt烟草和非转基因烟草对照(CK)在盐胁迫下的叶绿素含量。图9-D:转pVKH-AtGolS2烟草和转pVKH-AtGolS2-ipt烟草和非转基因烟草对照(CK)在干旱胁迫下的叶绿素含量。图10为ipt或jX与J融合表达载体的物理图谱图10-A:转pVKH-AOC烟草转录融合表达载体。图10-B:转pVKH-A0C-ipt烟草转录融合表达载体。图ll为^t转录融合基因的转基因烟草在自然条件下生长发育图11-A:转pVKH-A0C-ipt烟草、转pVKH-AOC烟草和非转基因烟草对照在培养基中培养3周。CK表示对照非转基因烟草，A0C-ipt表示转pVKH-A0C-ipt烟草，A0C表示转pVKH-A0C烟草。图11-B:转pVKH-A0C-ipt烟草和转pVKH-A0C烟草在培养基中培养3周后，然后移栽到沙中培养3周。A0C-ipt表示转pVKH-AOC-ipt烟草，A0C表示转pVKH-A0C烟草。图ll-C:转pVKH-AOC-ipt烟草和转pVKH-A0C烟草在MS基本培养基中培养3周后，然后移栽到沙中培养3周，最后移栽到土壤培养5周。A0C-ipt表示转pVKH-AOC-ipt烟草，A0C表示转pVKH-A0C烟草。右侧两盆为转pVKH-A0C-ipt烟草。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例1、异戊烯基转移酶基因i;^与报告基因^^转录融合在拟南芥中的表达一、植物表达载体pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt的构建及转基因拟南芥的获得农杆菌C^ro&cteri咖t鹏e/"acj'e/sC58)中异戊烯基转移酶基因ipt(自GenBankAccessionAF242881的5'末端第7864-8586位与大肠杆菌G^c力en'c力ia6bh'W3110)中的6^报告基因(GenBankAccessionNumberAC—000091.1(1695971-1697785位)以ipt-GUS和GUS-ipt两种排列方式转录融合。在ipt-GUS转录融合双基因之间插入24个核苷酸(AGATCCGTCGAGTGGCCAAATTCC);而在GUS-ipt转录融合双基因之间插入6个核苷酸(TCTAGA)。然后与CaMV35S组成型强启动子(序列表中的序列2)连接，可置于任何植物表达载体中，本实施将它们放在带有CaMV35S启动子的pVKH-35S-PA(图2)植物表达载体中，得到pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt(图3)。具体方法如下pVKH-ipt-GUS植物表达载体的构建如下&t基因是从农杆菌中分离得到的。&f基因的分离用引物GGCGAATTCACTGCAAAAAACTTATGGAC(带下划线碱基为限制性内切酶fcoWI识别位点)和TAAGAGCTCGGGCTGGCGTAACCTAAT(带下划线碱基为限制性内切酶&cI识别位点)，农杆菌DNA为模板进行PCR，然后将PCR产物用fco7I和SacI酶切，连接到pBluescriprII(购自Takara公司)中间载体的和feeI位点上，得到重组载体pBS-ipt。^^基因用GUS-1:GCGGAGCTCATGTTACGTCCTGTAGAAA(带下划线碱基为限制性内切酶&cI识别位点)和GUS-2:ATTGTCGACTCATTGTTTGCCTCCCTGC(带下划线碱基为限制性内切酶5"aJI识别位点)为引物，大肠杆菌(fsc力en'c力W3110)DNA为模板进行PCR反应。PCR产物用&cI和I酶切，连接到pBluescriprII&cI和5k/I酶切位点的中间载体上，得到pBS-GUS。j'/^基因和a^基因的转录融合，首先用feei和5"wi酶切pBS-GUS，得到带&cI和5^7I粘性末端的^^基因片段；用同样5"acI和&〗I酶切pBS-ipt，获得带有&cI和5"aJI粘性末端的pBS-ipt线型载体；然后将它们连接，得到ipf基因和6^5"基因的转录融合中间载体pBS-ipt-GUS。用^boTI酶切pBS-ipt-GUS质粒，Klenow酶补平，然后用6kZI酶切，得到5'端是平末端、3'端带有5"WI的ipt-GUS转录融合双基因片段。用5朋WI酶切植物表达载体pVKH-35S-pA，Klenow酶补平，然后用I酶切，获得5，端是平末端、3，端带有&7I的pVKH35线型植物表达载体，然后与5'端是平末端、3'端带有&〗I的ipt-GUS转录融合双基因片段连接，得到pVKH-ipt-GUS植物表达载体。将pVKH35S-ipt-GUS用0&2+诱导化学法转入农杆菌GV3101，用真空抽滤法通过GV3101将pVKH35S-ipt-GUS转入到拟南芥(Arabidopsis6b7咖Ws)。通过在25Pg/ml潮霉素的MS培养基筛选，获得125株转基因植物。pVKH-GUS-ipt植物表达载体的构建用GUS-1:GCGGAGCTCATGTTACGTCCTGTAGAAA(带下划线碱基为限制性内切酶5"scI识别位点)和GUS-3:ATTTCTAGATCATTGTTTGCCTCCCTGC(带下划线碱基为限制性内切酶I识别位点)为引物)，pBS-GUS为模板进行PCR反应，PCR产物用&cI和IsI进行酶切，与用同样I和屈aI进行酶切的pBluescriprII中间载体连接，得到pBS-GUS(b)。用ipt-l:GTGAGATCTATGGACCTGCATCTAATTT(带下划线碱基为限制性内切酶I识别位点)和ipt-2:CAGGTCGACGGCTGGCGTAACCTAATAC(带下划线碱基为限制性内切酶I识别位点)为引物，pBS-ipt为模板进行PCR反应。PCR产物用屈sl和5^1进行酶切，然后与用同样JteI和5"WI进行酶切的pBS-GUS(b)载体连接，得到中间载体pBS-GUS-ipt。然后用i5WM6II和I酶切pBS-GUS-ipt，得到5，端是平末端，3'端带有5"WI的GUS-ipt转录融合双基因片段。用A朋WI酶切植物表达载体pVKH-35S-pA，Klenow酶补平，然后用I酶切，获得5，端是平末端，3，端带有5"WI的pVKH35线型植物表达载体，然后与5'端是平末端，3'端带有5"WI的GUS-ipt转录融合双基因片段连接，得到pVKH-GUS-ipt植物表达载体。将pVKH-GUS-ipt用C诱导化学法转入农杆菌GV3101，用真空抽滤法通过GV3101将pVKH35S-GUS-ipt转入到拟南芥(ArabidopsisCa/腿Z;i3)。通过在25Pg/ral潮霉素的MS培养基筛选得到115转基因植物，通过在25Pg/ml潮霉素的MS培养基上重复3代筛选，获得20个基因单一插入的转基因植物株系(Lines)。二、pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt转基因拟南芥的鉴定，同时以野生型的拟南芥作为对照，进行以下实验。1:按照如下方法检测ipf基因在ipt-GUS转录融合双基因和GUS-ipt转录融合双基因的raRNA水平将pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt抗性转基因苗移栽到MS+25Pg/ml潮霉素培养基中培养14天，然后收集100mg左右的转基因植物幼苗，用TRIi(大连宝生物公司)方法提取总RNA。逆转录反应在40(！1的反应体系中进行，其中包括5叫上述提取的总RNA,2(il(5pmol/pl)OligodT，8|al5XRTbuffer,4DTT(10mM),2(ildNTP(10raM)，2(il逆转录酶。反应条件为42°C，50分钟，然后在7(TC，15分钟停止反应。PCR反应以ipt基因特异引物(从基因的108-407bp片断)ipt-3:TTTCGCTTGATCGGGTCC和ipt-4:GGTCTCTTGGTCGGGTAACTTG为引物，上述逆转录产物为模板进行PCR。结果如图4-C所示，表明在pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt转基因植物中，i/^基因在ipt-GUS转录融合双基因和GUS-ipt转录融合双基因的mRNA水平相同。图4中，对照是野生型的拟南芥，ipt-GUS表示转pVKH-ipt-GUS拟南芥，GUS-ipt表示转pVKH-GUS-ipt拟南芥。2:按照如下方法检测植物激素cytokinins在ipt-GUS转录融合双基因和GUS-ipt转录融合双基因转基因植物中的含量用化学方法分析pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt转基因苗在MS+25Pg/ml潮霉素培养基中培养12天和30天的转基因幼苗中的植物激素cytokinins的含量。植物激素的提取和定量分析参照(GuoJianchun等Interactiveeffectsofcytokinins,lightandsucroseonthephenotypesandthesynthesesofanthocyanins，ligninsincytokininover-producingtransgenicAn3/^V0p57's，Journalofplantgrowthregulation24(2):93-101，2005)所描述的方法进行。每种类型的植物分析了lg新鲜材料被分成两组。实验设2次重复，每次重复pVKH-ipt-GUS、pVKH-GUS-ipt转基因苗和对照各500mg新鲜材料，200株(苗龄为12天)；50株(苗龄为30天)。由于pVKH-ipt-GUS转基因拟南芥不能开花结籽，所用的苗是TO代的抗性转基因苗，而pVKH-GUS-ipt是单拷贝插入的转基因纯合子第三代苗。在pVKH-ipt-GUS转基因植物中，苗龄为12天时，其植物细胞分裂素分别是正常植株的20-15倍；苗龄为30天时，其植物细胞分裂素分别是正常植物10-15倍；而在pVKH-GUS-ipt转基因植物中，在苗龄为12天时，其植物细胞分裂素是正常植物的l-2倍(图4-B，图中两个柱分别代表两组分析)。对照是非转基因的拟南芥。3:按照如下方法检测GUS酶活性在ipt-GUS转录融合双基因和GUS-ipt转录融合双基因转基因植物中活性化学染色的方法参照(GuoJianchun等Interactiveeffectsofcytokinins,lightandsucroseonthephenotypesandthesynthesesof肌thocyanins,ligninsincytokininover-producingtransgenic^n3力i(yc"psis，Journalofplantgrowthregulation24(2):93-101，2005)所描述的方法进行。GUS酶活性在pVKH-GUS-ipt转基因植物中，酶活性很高，在整个植物中均能检测到蓝色，且颜色深，说明ftt基因表达的强度大(图4-A)。在20个单一插入的pVKH-GUS-ipt转基因株系中(lines)，有18个株系被检测到高的GUS酶活性，有2个株系没有被检测到GUS酶活性。而GUS酶活性在pVKH-ipt-GUS转基因植物中，酶活性很弱，只有在茎的顶端检测得到蓝色(图4-A)，pVKH-ipt-GUS转基因株系中，只有45%的株系被检测到弱的GUS酶活性(图4-A)。对照是非转基因的拟南芥。4:ipt-GUS和GUS-ipt转录融合双基因转基因植物生长的形态学观察将转入pVKH-ipt-GUS和pVKH-GUS-ipt植物表达载体通过抗性筛选的转基因苗各10株移栽到MS+25Pg/ral潮霉素MS培养基中培养，各10株移栽到土壤，在光周期为16h光照/8h黑暗，22。C，光强度为20000LX的人工气候箱中培养。在pVKH-ipt-GUS转基因拟南芥植物中，由于过量增加植物细胞分裂素，植物生长表现为严重抑制，如在培养基中根发育停止(表1)，茎干和茎的顶端增大，叶的边缘发育成波浪型(图5-A，B);在土壤栽培的条件下，植物生长发育很慢，且发育严重不正常，花不能正常发育，没有种子形成(图5-C)。但是在pVKH-GUS-ipt转基因拟南芥植物中，植物细胞分裂素微量增加，所以植物无论在培养基中还是在土壤生长的条件下都表现为比野生型的拟南芥生长快，开花早，侧枝多(图5-G，H，I)。_表l:在培养基中转基因植物根的发育_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例2、异戊烯基转移酶基因ipt与肌醇半乳糖苷合成酶基因JWA^转录融合在烟草中的表达一、植物表达载体pVKH-AGolS2-ipt和pVKH-AtGolS2的构建及转基因烟草的获得低分子量的渗透调节物质，可溶性棉子糖(Raffnose)和肌醇半乳糖苷在植物抗寒及抗旱方面起了重要作用。而肌醇半乳糖苷酶(GolS)是催化UDP-半乳糖生化合成棉子糖家族反应的第一步。拟南芥中共有七种^^S基因，分别命名为AtGolSl-7,它们的同源性很高，其中J^b^5^是由冷胁迫诱导的，力Wo/5^(AB:062849)受高盐禾卩干旱诱导(Taji等，importantrolesofdrought-andcold-induciblegenesforgalactinolsynthaseinstresstoleranceinArabidopsisthalia亂TheplantJournal,2002，29(4):417-426，2002)。在植物表达载体pVKH-GUS-ipt中，将^6W5^基因取代f〃5"基因，构建pVKH-AGolS2-ipt表达载体，并同时构建pVKH-AtGolS2表达载体(图6)转入烟草。在AGolS2-ipt转录融合中，J6W5^基因和^^基因之间插入了4个核苷酸(TAAG)具体方法如下pVKH-AtGolS2植物表达载体的构建A6W5^基因(AB062849)是从拟南芥中分离得到。用TRI皿(大连宝生物公司)方法提取拟南芥总RNA，然后用大连宝生物公司提供的反转录试剂合进行逆转录，逆转录在42r60inin，99°C10min条件下进行。^foZ5^基因的分离用上述逆转录产物为模板，以AT-3:GTAGGATCCACAAAGAAGATGGCACCTGA(带下划线碱基为限制性内切酶识别位点)和AT-4:GCAGTCGACTATTGTCGGGAGCATTGTT(带下划线碱基为限制性内切酶I识别位点)为引物进行PCR扩增。PCR反应条件为94°C30min，55°C30min，72°C70min，30个循环。得到约1100bp的^6W5^基因片段。PCR产物连接到pMD-18-T-载体上(大连宝生物公司)，然后送到上海生工进行测序，将测序正确的重组表达载体命名为pMD-18-AtGolS2。由于^C基因5'端引物加有I酶切位点，3'引物加有I酶切位点，用核酸内切酶As/b〃I和5k7I对PMD-18-AtGolS2进行酶切，得到带有5柳#I和5"WI粘性末端的JWd5^基因片段；用同样I和5^/I酶对pVKH-35S-pA进行酶切，获得带有5棚#I和I粘性末端的pVKH35线型植物表达载体，然后与带有A朋WI和5"WI粘性末端的Jf&Z^基因片段连接，获得pVKH-AtGolS2植物表达载体。用pVKH-AtGolS2作为模板，AT-3和AT-4为引物进行PCR，结果获得约1100bp大小的^6b76^基因片段。将pVKH-AtGolS2用Ca"诱导化学法转入农杆菌GV3101，用叶盘法通过GV3101将pVKH-AtGolS2转入到烟草(船c"&朋^&c咖L)(中国热带农业科学院热带生物技术研究所)。通过在40^g/ml潮霉素的MS培养基筛选，获得12株转基因烟草植物(T0)。pVKH-AtGolS2-ipt植物表达载体构建以pMD-18-AtGolS2质粒为模板，以AT-1:GTAGTCGACACAAAGAAGATGGCACCTGA(带下划线碱基为限制性内切酶I识别位点)和AT-2:GCAGAATTCTATTGTCGGGAGCATTGTT(带下划线碱基为限制性内切酶fco7I识别位点)为引物，PCR反应在94r30min，55°C45min，72°C70min，30个循环条件下进行，获得约1100bp的力Wo75^基因片段，然后用6^7I和v^o7I双酶切力WoZ5^基因片段的PCR产物和pBS-ipt(中间载体)，获得带有I和fcMI粘性末端的A6b7W基因和带同样酶切位点的pBS-ipt线性载体，T4DNA连接酶连接，构建pBS-AtGolS2-ipt(中间载体)。以pBS-AtGolS2-ipt为模板，以AT-3:GTAGGATCCACAAAGAAGATGGCACCTGA(带下划线碱基为限制性内切酶识别位点)和ipt-2:GCAGTCGACACATTCCGAACGGATG(带下划线碱基为限制性内切酶I识别位点)为引物，PCR反应在94"30min，52°C45min，72°C2min，30个循环条件下进行，得到约1800bp的AtGolS2-ipt转录融合双基因的片段，连接pMD-18-T载体，得到了pMD-18-T-AtGolS2-ipt中间表达载体。用I和5"WI酶切pMD-18-T-AtGolS2-ipt中间表达载体，得到带JZ^I和5^I粘性末端的AtGo12-ipt片段，同时用IaI和Sa7I酶切pVKH-A0C-ipt(图10-B)，切除A0C-ipt转录融合双基因，得到带I和I粘性末端的pVKH-35S线性载体骨架，然后用T4DNA连接酶连接，构建pVKH-AtGolS2-ipt转录融合表达载体。将pVKHS-AtGolS2-ipt用Ca2+诱导化学法转入农杆菌GV3101，用叶盘法通过GV3101将pVKH-At2-ipt转入到烟草。通过在40Pg/ml潮霉素的MS培养基筛选，获得10株转基因烟草(T0)。同时以非转基因烟草作为转基因烟草对照，进行以下实验。将转pVKH-AtGolS2-ipt烟草、转pVKH-AtGolS2烟草T0代抗性植株，用CTAB化提取基因组DNA(王关林等，植物基因工程，2002)作为模板，AT-1和AT-2或ipt-3和ipt-4为引物进行PCR检测。结果在转pVKH-AtGolS2-ipt烟草中得到大小为1100bp和300bp两条带；在转pVKH-AtGolS2烟草中只得到一条1100bp的带。将转pVKH-AtGolS2-ipt烟草、转pVKH-AtGolS2烟草T0代抗性植株，且经过PCR检测为阳性的苗和非转基因烟草对照在MS基本培养基中培养3周，观察其生长情况。每种烟草各种10株。将转pVKH-AtGolS2-ipt烟草、转pVKH-AtGolS2烟草T0代抗性植株，且经过PCR检测为阳性的苗和非转基因烟草对照在MS基本培养基中培养3周后，然后移栽到沙中培养3周，观察其生长情况。每种烟草各种10株。将转pVKH-AtGolS2-ipt烟草、转pVKH-AtGolS2烟草T0代抗性植株，且经过PCR检测为阳性的苗和非转基因烟草对照在MS基本培养基中培养3周后，然后移栽到沙中培养3周，最后移栽到土壤培养3周，观察其生长情况。每种烟草各种10株。结果表明在无诱导的自然条件下，pVKH-AtGolS2-ipt转基因烟草无论是在培养基中还是在土壤中都比pVKH-AtGolS2转基因烟草和非转基因烟草对照生长快些，并且根系发达(图7-A，B，C)，非转基因烟草对照和pVKH-AtGolS2转基因烟草的生长情况相近。2)将转pVKH-AtGolS2-ipt烟草、转pVKH-AtGolS2烟草T0代抗性植株，且经过PCR检测为阳性的苗和非转基因烟草对照在MS基本培养基中培养3周后，然后移栽到土壤培养3周后，让其置于胁迫的条件下。只用150mM的盐水浇灌，4天浇一次，每次200ml，让植物处于盐胁迫的状态；或用自来水浇灌，但减少一半的浇水次数，8天浇水一次，每次200ml,让其处于干旱胁迫的状态；或用自来水浇灌，但放置于8度人工气候培养箱中，4天浇一次，每次200ml,让其处于低温胁迫的状态；以上三种胁迫处理连续保持65天。同时设置非胁迫条件对照即正常条件下培养自来水浇灌，4天浇一次，每次200ml。每种烟草各各种10株。pVKH-AtGolS2和pVKH-AtGolS2-ipt转基因烟草表现出一定的耐盐性、耐旱性和耐寒性。其生长状况比非转基因烟草对照生长好。pVKH-AtGolS2在盐胁迫和干旱胁迫条件下植物生长比非胁迫条件下植物的生长稍微慢些(图8-A)。pVKH-AtGolS2-ipt转基因烟草在盐胁迫和干旱胁迫的条件下同非胁迫的条件下，植物的大小没有多大的区别，均表现为生长旺盛，壮而稍矮(图8-C)。在低温胁迫的条件下pVKH-AtGolS2-ipt转基因烟草比pVKH-AtGolS2表现为更大的生长优势，植物叶片大而绿，开花迟，当转移到正常条件下后，开花和结籽多(图8-B，D)。当转基因pVKH-AtGolS2-ipt，pVKH-AtGolS2和对照非转基因苗在以上胁迫条件下65天时测定它们叶片的叶绿素含量。每种烟草各各种10株。200mg去叶脉的叶片用2-3ml95%酒精研磨匀浆过滤，用95%酒精洗研钵及残渣，合并滤液用95。/。酒精定容至25ml。然后在663nm和645nm测定它们的吸收光谱，叶绿素含量的计算按照公式C(mg/L)X提取液总量(L)X稀释倍数Chl=(mg/g叶)材料鲜重(g)其中叶绿素a，叶绿素b，叶绿素a+b含量的计算为叶绿素a(mg/L)=12.7x0D腦-2.69x0D645;叶绿素b(mg/L)=22.9x0D645-4.86x0D663;叶绿素a+b(mg/L)=8.02x0D663+20.2x0D645。结果表明转pVKH-AtGolS2-ipt烟草在无诱导的自然条件下，和低温胁迫的条件下其叶片中叶绿素含量比转pVKH-AtGolS2烟草高，特别是在低温胁迫的条件下，植物叶片持绿期明显比转pVKH-AtGolS2烟草长，叶绿素含量高(图9-A)。但是在干旱胁迫的条件下，植物叶片中叶绿素含量在转pVKH-AtGolS2-ipt烟草和转pVKH-AtGolS2烟草叶片中几乎相同(图9-D);在盐胁迫的条件下，转pVKH-AtGolS2烟草叶片中叶绿素的含量甚至比转pVKH-AtGolS2-ipt烟草叶片叶绿素的含量高(图9-C)。图9中，AtGolS2-ipt表示转pVKH-AtGolS2-ipt烟草，AtGolS2表示转pVKH-AtGolS2烟草。实施例3、异戊烯基转移酶基因i》t与丙二烯环化氧化酶^C转录融合在烟草中的表达丙二烯环化氧化酶A0C能把一种不稳定的具有立体特异性的丙二烯环化物催化氧化成(9S，13S)-12-0-(10，15Z)-植物二烯酸，此植物二烯酸是茉莉酸的最终前体。红树林海莲Ler收wierasexa/7^/2ay>的A0C和西红柿、拟南芥植物中的A0C相比较具有较高的同源性，但西红柿和拟南芥植物中的A0C没有表现出增强耐盐特性，而海莲的A0C(AB037929)具有明显的增强耐盐性，主要是因为海莲植物中的AOC蛋白有一个不寻常的70个氨基酸的序列，它与耐盐特性密切相关。在植物表达载体pVKH-GUS-ipt中，将海莲植物中的^T基因取代^/S基因，构建pVKH-AOC-ipt表达载体，并同时构建pVKH-A0C表达载体(图10)转入烟草。在A0C-ipt转录融合中，^T基因与ipt基因之间插入了6个核苷酸(CTTAAG)。具体方法如下pVKH-AOC植物表达载体构建如下JOC基因(AB037929)是红树林植物海莲(份，收Werasexs/7^^^分离得到。按照文献(曾会才，红树林植物海马齿耐盐相关基因克隆，华南热带农业大学博士论文，2003)中描述的方法提取海莲总RNA。然后用大连宝生物公司的反转录试剂合进行逆转录，逆转录反应在42"C60min，99°C10rain，5。C5min条件下进行。^OC基因(自GenBankAccessionNumberAB037929的5'末端第42至812位)的分离用上述逆转录产物为模板，以引物A0C-3:GTAGGATCCAGAAAATGGCTCTTTC(带下划线碱基为限制性内切酶I识别位点)和A0C-4:GCAGTCGACAATCACTAATCGGTG(带下划线碱基为限制性内切酶5"WI识别位点)为引物进行PCR扩增。PCR反应条件为94°C30min，52°C30rain，72°C45min，30个循环，得到约780bp片段。PCR产物连接到pMD-18-T载体(大连宝生物公司)上，然后送到上海生工进行测序，将测序结果正确的重组载体命名为pMD-18-T-A0C。由于^基因5'端引物加有^3历^I酶切位点，3，引物加有&JI酶切位点，用核酸内切酶I和5"WI对pMD-18-T-A0C进行酶切，得到带有fe/z^I和5"WI粘性末端的^T基因片段；用同样7fe/^I和5^I酶对pVKH-35S-pA进行酶切，获得带有&迈#I和&7I粘性末端的pVKH35线型植物表达载体，然后与带有BamHI和SalI粘性末端的AOC基因片段连接，获得pVKH-A0C植物表达载体。用pVKH-A0C作为模板，引物A0C3-3:GTAGGATCCAGAAAATGGCTCTTTC和A0C-4:GCAGTCGACAATCACTAATCGGTG为引物进行PCR,结果获得约780bp大小的^(9C基因片段。将pVKH-AOC用Ca2+诱导化学法转入农杆菌GV3101，用叶盘法通过GV3101将pVKH-AOC转入到烟草(WcoWa朋fa/^c柳L)(中国热带农业科学院热带生物技术研究所)。通过在40Pg/ml潮霉素的MS培养基筛选，获得10株转基因烟草植物(TO)pVKH-AOC-ipt植物表达载体构建如下以A0C-1:GTAGTCGACAGAAAATGGCTCTTTC(带下划线碱基为限制性内切酶&7I识别位点)，AOC-2:GCAGAATTCAATCACTAATCGGTGA(带下划线碱基为限制性内切酶^bo/I识别位点)为引物，pMD-18-T-AOC质粒为模板，PCR反应条件下为94°C30rain，52°C30min，72°C45min，30个循环，扩增约780bp的力OC基因。用5"WI和fcoTI双酶切力基因PCR产物和pBS-ipt中间载体，获得带有I和fco7I粘性末端的A0C基因和带同样酶切位点的pBS-ipt线性载体，TJ)NA连接酶连接构建pBS-A0C-ipt中间载体。用II和laI酶切pBS-A0C-ipt，获得一端是平端，另一端带有I酶切位点AOC-ipt;用I酶切植物表达载体pVKH-35S-pA，Klenow酶补平，然后用5"WI酶切，获得5'端是平末端，3'端带有&JI的pVKH35线型植物表达载体，然后与5'端是平末端，3，端带有&JI的A0C-ipt转录融合双基因片段连接，得到pVKH-A0C-ipt植物表达载体。该表达载体按照如下方法检测以pVKH-A0C-ipt载体为模板，A0C-3:GTAGGATCCAGAAAATGGCTCTTTC,ipt-5:GCAGTCGACACATTCCGAACGGATG为引物，在94°C45S，54°C30min，72°C90min，30个循环条件下，结果得到和ipf转录融合双基因的联合片段，约1500bp。以A0C-3:GTAGGATCCAGAAAATGGCTCTTTC，A0C-4:GCAGTCGACAATCACTAATCGGTG，为引物在94。C30S，52°C30min，72°C45rain，30个循环条件下，结果得到力OC基因特异片段约780bp。pVKH-A0C-ipt用0&2+诱导化学法转入农杆菌GV3101，用叶盘法通过GV3101将pVKH35S-A0C-ipt转入到烟草(Wc"ia朋L)(中国热带农业科学院热带生物技术研究所)。通过在40Pg/ml潮霉素的MS培养基筛选，获得12株转基因烟草(T0)。同时以非转基因烟草作为转基因烟草对照，进行以下实验。将转pVKH-A0C-ipt烟草、转pVKH-A0C烟草T0代抗性植株，用CTAB化提取DNA(王关林等，植物基因工程，2002)为模板，A0C-1和A0C-2或ipt-3和ipt-4为引物进行PCR检测。结果表明在转pVKH-AOC-ipt烟草中得到大小为780bp和300bp两条带；在转pVKH-A0C烟草中只得到一条7S0bp的带。将转pVKH-AOC-ipt烟草、转pVKH-A0C烟草TO代抗性植株，且经过PCR检测为阳性的苗和非转基因烟草对照在MS基本培养基中培养3周，观察其生长情况。每种烟草各种10株。将转pVKH-AOC-ipt烟草、转pVKH-AOC烟草TO代抗性植株，且经过PCR检测为阳性的苗和非转基因烟草对照在MS基本培养基中培养3周后，然后移栽到沙中培养3周，观察其生长情况。每种烟草各种10株。将转pVKH-AOC-ipt烟草、转pVKH-AOC烟草TO代抗性植株，且经过PCR检测为阳性的苗和非转基因烟草对照在MS基本培养基中培养3周后，然后移栽到沙中培养3周，最后移栽到土壤培养5周，观察其生长情况。结果表明在无诱导的自然条件下，转pVKH-AOC-ipt烟草无论是在培养基中还是在土壤中都比转pVKH-AOC烟草生长快些(图ll)。图ll中，AOC-ipt表示转pVKH-AOC-ipt烟草，AOC表示转pVKH-AOC烟草。每种烟草各种10株。序列表<160>2<210〉1<211〉240<212>PRT〈213〉丰艮癌农杆菌(4§ro6<3Cter/w/Z7tw/ze/scie/750<400〉1MetAspLeuHisLeuliePheGlyProThrCysThrGlyLysThrThr151015ThrAlalieAlaLeuAlaGinGinThrGlyLeuProValLeuSerLeu202530AspArgValGinCysCysProGinLeuSerThrGlySerGlyArgPro354045ThrValGluGluLeuLysGlyThrThrArgLeuTyrLeuAspAspArg505560ProLeuValGluGlylielieAlaAlaLysGinAlaHisHisArgLeu65707580lieGluGluValTyrAsnHisGluAlaAsnGlyGlyLeulieLeuGlu859095GlyGlySerThrSerLeuLeuAsnCysMetAlaArgAsnSerTyrTrp100105110SerAlaAspPheArgTrpHislielieArgHisLysLeuProAspGin115120125GluThrPheMetLysAlaAlaLysAlaArgValLysGinMetLeuHis130135140ProAlaAlaGlyHisSerlielieGinGluLeuValTyrLeuTrpAsn145150155160GluProArgLeuArgProlieLeuLysGlulieAspGlyTyrArgTyr165170175AlaMetLeuPheAlaSerGinAsnGinlieThrAlaAspMetLeuLeu180185190GinLeuAspAlaAsnMetGluGlyLysLeulieAsnGlylieAlaGin195200205GluTyrPhelieHisAlaArgGinGinGluGinLysPheProGinVal210215220AsnAlaAlaAlaPheAspGlyPheGluGlyHisProPheGlyMetTyr225230235240〈210〉2<211〉392<212〉DNA〈213〉花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus)<■〉2actccaagaaacagtctcag^gacc3gagggctattgagacttttcaac60a^gggta^tstcggga^cctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcg1203g3aaagg肌gatggcttcttcattgcgat180ctatcgttcaagaatgcctctaccgacagtggtccca肌gatggacccccacccacgagg24033catcgtggcgttccaaccacgtcttcaa3gcaagtgga"ttgatgtgat300atctccactg3cg他gggatgacgcacaatxccactat:ccttxgcaagacccttcctct360atata^ggaagttcatttca"tUgg卿gg3C39权利要求1、一种转录融合双基因片段，其自5′→3′方向的排列顺序依次为除异戊烯基转移酶基因外的功能基因、2-60bp其排列中不具有ATG组合的脱氧核糖核苷酸序列和异戊烯基转移酶基因。2、根据权利要求1所述的转录融合双基因片段，其特征在于所述异戊烯基转移酶基因编码的氨基酸序列是序列表中的序列1;所述异戊烯基转移酶基因的核苷酸序列优选为自GenBankAccessionNumberAF242881的5'末端第7864-8586位。3、根据权利要求l所述的转录融合双基因片段，其特征在于所述除异戊烯基转移酶基因外的功能基因为所有具有功能的基因；所述除异戊烯基转移酶基因外的功能基因具体可为报告基因或抗逆基因；如GUS基因、A6bJ5^基因或海莲的A0C基因。4、根据权利要求1至3中任一所述的转录融合双基因片段，其特征在于所述2-60bp其排列中不具有ATG组合的脱氧核糖核苷酸序列的核苷酸长度为6J4bp。5、含有权利要求1至4中任一所述的转录融合双基因片段的表达盒。6、根据权利要求5所述的表达盒，其特征在于所述表达盒的自5'—3'方向的排列顺序依次为组成型强启动子、除异戊烯基转移酶基因外的功能基因、2-60bp其排列中不具有ATG组合的脱氧核糖核苷酸序列、异戊烯基转移酶基因和多聚A尾。7、含有权利要求1至4中任一所述的转录融合双基因片段的重组植物表达载体，或含有权利要求1至4中任一所述的转录融合双基因片段的细胞系；或含有权利要求1至4中任一所述的转录融合双基因片段的重组植物表达载体的细胞系。8、根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于所述重组植物表达载体是含有权利要求5或6所述的表达盒的植物表达载体。9、一种培育微量增加植物细胞分裂素的转基因植物的方法，是将权利要求1至4中任一所述的转录融合双基因片段，或权利要求5至6中任一所述的表达盒，或权利要求7至8中任一所述的重组植物表达载体导入植物中，得到微量增加植物细胞分裂素的转基因植物。10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述植物为双子叶植物，具体可为烟草。全文摘要本发明公开了一种培育微量增加植物细胞分裂素的转基因植物的方法及专用转录融合双基因片段。该转录融合双基因片段，自5′→3′方向的排列顺序依次为组成型强启动子、除异戊烯基转移酶基因ipt外的功能基因、2-60bp其排列中不具有ATG组合的脱氧核糖核苷酸序列和异戊烯基转移酶基因。将该转录融合双基因片段导入植物中，可获得微量增加植物细胞分裂素的转基因植物，该转基因植物表现为生长快，侧枝多，叶绿素含量高，延期衰老。本发明可用于植物的品质改良中，特别是可用于要转入对植物生长有阻碍作用基因的转基因植物的品质改良中，如抗逆植物的品质改良。抗逆基因对植物的生长有阻碍作用，将它与ipt转录融合，ipt基因的弱表达，可改善转基因植物的生长。文档编号C12N15/62GK101157932SQ200710119770公开日2008年4月9日申请日期2007年7月31日优先权日2007年7月31日发明者段瑞军,符少萍,胡新文,郭建春申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所