专利名称：一种提取杂交酸模超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及提取植物超氧化物歧化酶(SOD)的方法，特别是涉及一种提取杂交 酸模S0D的方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(SOD)是生物重要保护酶之一，能增强机体抗逆能力，防衰老。 杂交酸模是采用不同地区野生酸模通过基因工程培育而成的多年生物种。它具有优 质、高产、速生、耐寒、耐旱、'耐盐碱等生物学特性，适于盐渍、风沙、荒漠化土地 生长，在我国南北方大部分地区都有种植。杂交酸模的茎叶在抽茎期所含叶蛋白高达 30%以上，仅次于大豆籽粒，还含有丰富的氨基酸、维生素和微量元素。经过测定， 杂交酸模中含有较高的SOD。
现有的杂交酸模SOD提取技术一般是将杂交酸模处理后离心得到的粗提液，经 25—35%硫酸铵沉淀、85—95%硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100 柱层析等步骤，可以得到SOD粗酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单方便的提取杂交酸模SOD的方法。 本发明所提供的提取杂交酸模SOD的方法，是以截留分子量为6万道尔顿的超滤
膜翹滤处理杂交酸模粗提液得到超滤液，再以截留分子量为1万道尔顿的超滤膜浓缩
超滤液，浓縮液脱水得到杂交酸模S0D;所述杂交酸模粗提液是将杂交酸模捣碎、匀
浆离心得到的上清液。
所述将杂交酸模捣碎、匀浆离心是将杂交酸模用组织捣碎机捣碎，捣碎组织经匀
浆后，离心的条件是8000/分钟。
在生产中， 一般使浓縮液脱水的方^;是冷冻干燥。
在本发明中，应用截留分子量为6万道尔顿的超滤膜超滤处理粗提液，超滤时工 作压力为0.l5MPa,得到超滤液，超滤膜的截留分子量选择6万道尔顿。超滤膜的组 件形式可以有各种形式，常用的有中空纤维膜。
应用截留分子量为1万道尔顿的超滤膜对超滤液进行处理时，工作压力为 0.15MPa，得到浓縮。液超滤膜的截留分子量一般选择1万道尔顿，其组件形式可以 为中空纤维膜。
提取杂交酸模S0D的工艺流程如图1所示，本发明巧妙地采用超滤技术来分离、
浓縮杂交酸模SOD粗提液，不仅可以节约现有提取杂交酸模SOD工艺中所用的硫酸铵, 而且提取过程无相变，有利于保持SOD酶活的稳定，得到的产品酶活性较高。同时本 发明的工艺不需经过柱层析分离过程，具有操作过程简单，对环境无污染等优点。
图1为本发明的提取工艺流程图。
具体实施例方式
实施例l、 SOD的酶活测定
SOD的酶活测定方法采用NBT光化学法，具体如下
(1) 设备752型分光光度计；台式离心机；光照培养箱；冰箱；10ml小烧杯等。
(2) 试剂氯化硝基氮蓝四唑(NBT)，上海前进制剂厂
L-甲硫氨酸(L-Met)，上海康达氨基酸厂 乙二胺四乙酸(EDTA)，北京化工厂 核黄素(VB2),北京西中化工厂
(3) 反应液的配制
NBT反应液的制备配制pH7.8，50mmol/L的磷酸缓冲液1000ml，加入L933mg 的L-Met,待完全溶解后，放入45.8mgNBT, 0.47mg核黄素(配成0.47mg/ml溶液， 吸取lml加入)和29.0mgEDTA，溶液终浓度Met为13mmol/L; NBT为6.3 X l(T3mmoI/L;核黄素为1.3X l(T3mmol/L; EDTA为0.1 mmol/L，置于棕色试剂瓶中，
用黑布罩遮光，于4t:冰箱中可保存i个月。
(4) 材料的预处理
杂交酸模鲜体用研钵研碎，按照杂交酸模50mM磷酸缓冲液-l: 2的比例加入 缓冲液，10000rpm离心10分钟，取上清液进行SOD酶活测定。
(5) 测定方法
吸取3(Htl样品，放入10ml透明玻璃小烧杯中，加入3mlNBT反应液，混匀，在 28°CSOD光化反应室中,2X 15W日光灯光照20分钟(光照为4000勒克司)，在560mn 处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设3次重复，整个测定过程除光化反 应外，均在避光或弱光条件下进行。同时测试过程中以美国"Sigma"公司、上海宝安公 司的标准酶和贵州老来福药业公司生产的SOD 口服液作为测试对照。
(6) 计算
CK—A 60 1000 SOD酶活性-- X -X -X
CK/2 30 30
式中CK——空白对照透光度
n—样品稀释倍数 A—样品透光度 -酶活单位IU/g实施例l、提取杂交酸模SOD 实施例2、提取杂交酸模SOD
取新鲜杂交酸模的根、茎和叶100kg，用组织捣碎机捣碎，均浆，8000rpm冷冻 离心10min，去除杂质得上清液70L (粗提液)，酶活为180IU/ml。将粗提液通过截 留分子量为6万道尔顿的中空纤维超滤膜。膜材料聚砜，膜面积0.12m2，直径 10cm,高100cm，内压式。粗提液经0.15MPa超滤50分钟，获得超滤液63L,酶活 173IU/ml;然后，将超滤液通过截留分子量为1万道尔顿的中空纤维超滤膜，膜材料: 聚砜。膜面积0.12m2，直径10cm，高100cm，内压式，超滤液经0.15MPa超滤 l小时，得到浓縮液3L，酶活3584IU/ml。浓缩液冷冻干燥获得360克干粉，酶活 28186IU/g SOD，回收率约80.2%。
实施例3、提取杂交酸模SOD
取新鲜杂交酸模的根、茎和叶100kg，用组织捣碎机捣碎，均浆，8000rpm冷冻 离心10min，去除杂质得上清液70L (粗提液)，酶活为180IU/ml。将粗提液通过截 留分子量为6万道尔顿的平板超滤膜。膜材料聚砜，膜面积0.15m2，长30cm, 宽15cm，高5cm。粗提液经(U7MPa超滤45分钟，获得超滤液67L,酶活为163IU/ml; 然后，将超滤液通过截留分子量为1万道尔顿的平板超滤膜。膜材料聚砜，膜面积 0.15m2。长30cm，宽15cm,高5cm。超滤液经0.17MPa超滤50分钟，得到浓 縮液2.8L，酶活为3682IU/ml。浓縮液冷冻干燥，获得330克SOD干粉，酶活为 32253IU/g，回收率约84. 5%。
实施例4、提取杂交酸模SOD
取新鲜杂交酸模的根、茎和叶100kg，用组织捣碎机捣碎，均浆，6000rpm冷冻 离心10min，去除杂质得上清液70L (粗提液)，酶活为180IU/ml。将粗提液通过截 留分子量为6万道尔顿的巻式超滤膜。膜材料:聚丙烯腈，膜面积:侧面积3200cm2， 横截面积:2. 4 cm、粗提液经0.17MPa超滤48分钟,获得超滤液66L,酶活为1621U/ml; 然后，用截留分子量为1万道尔顿的巻式超滤膜。膜材料:聚丙烯腈，膜面积:侧面积 3200cm 横截面积2. 4 cm2,超滤液经0.17MPa超滤55分钟，得到浓缩液2. 5L,酶 活为4124IU/ml。浓縮液冷冻干燥，获得310克SOD干粉，酶活为34874IU/g,回收 率约85. 8%。
权利要求
1、一种提取杂交酸模SOD的方法，是以截留分子量为6万道尔顿的超滤膜超滤处理杂交酸模粗提液得到超滤液，再以截留分子量为1万道尔顿的超滤膜浓缩超滤液得到浓缩液，浓缩液脱水得到杂交酸模SOD；所述杂交酸模粗提液是将杂交酸模捣碎、匀浆离心得到的上清液。
2、 根据权利要求1所述的提取杂交酸模S0D的方法，其特征在于所述将杂交酸模捣碎、匀浆离心是将杂交酸模用组织捣碎机捣碎，捣碎组织经匀浆后，离心的条 件是8000转/分钟。
3、 根据权利要求1或2所述的提取杂交酸模SOD的方法,'其特征在于所述浓縮液脱水的方式是冷冻干燥。
4、 根据权利要求1或2所述的提取杂交酸模S0D的方法，其特征在于所述截留分子量为6万道尔顿的超滤膜的组件形式为中空纤维膜、平板膜或巻式膜。
5、 根据权利要求1或2所述的提取杂交酸模S0D的方法，其特征在于所述截 留分子量为1万道尔顿的超滤膜的组件形式为中空纤维膜、平板膜或巻式膜。
全文摘要
本发明公开了一种杂交酸模SOD的提取方法。本发明提供的杂交酸模SOD的提取方法，包括将杂交酸模经预处理得到粗提液，以截留分子量为6万道尔顿的超滤膜超滤处理粗提液得到超滤液，和以截留分子量为1万道尔顿的超滤膜浓缩超滤液得到浓缩液；所述将杂交酸模经预处理得到粗提液是将杂交酸模用组织捣碎机捣碎，捣碎组织经匀浆离心，弃去沉淀残渣，保留上清液作为粗提液。本发明引入超滤技术，应用两种不同截留分子量大小的超滤膜来分离、收集粗提液，可以节约硫酸铵，而且提取过程无相变，有利于保持SOD酶活的稳定；不需经过柱层析分离过程，具有操作过程简单，对环境无污染等方面的优点。
文档编号C12N9/08GK101353648SQ20071011936
公开日2009年1月28日 申请日期2007年7月23日 优先权日2007年7月23日
发明者孙元枢, 宁 梅, 梅汝鸿, 琦 王, 王嘉猷, 晋 靳 申请人:北京绿寿康科技发展有限公司