专利名称：：一种转化烟曲霉的方法及其专用表达载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种转化烟曲霉的方法及其专用表达载体。技术背景侵袭性曲霉病(Invasiveaspergillosis,IA)IA主要由烟曲霉感染引起。近年来，IA的发生呈现出上升趋势，而且病情十分严重，在白血病和骨髓移植受者等重症免疫受损(immunocompromised)机体中IA的死亡率常超过90%，已经成为这群患者发生死亡的主要原因之一。要明确侵袭性曲霉病发病机制，首先要了解烟曲霉的基因功能，基因的功能决定了该菌的致病性、发病机制、耐药性等性状。烟曲霉基因组测序工作已于2005年底结束，这使得对烟曲霉基因功能的研究速度加快。基因敲除是研究基因功能的一种重要的手段。基因敲除(geneknockout)是利用细胞染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质，通过同源重组使特定基因失活，以研究该基因的功能；基因敲除的生物学原理是DNA同源重组。基因敲除工作中最重要的一步是将带有筛选标记的外源DNA转化到烟曲霉细胞内，使其与宿主细胞染色体DNA发生同源重组。然而现有的曲霉基因敲除时的转化方法均存在转化的同源重组率低或转化效率低的问题，这严重阻碍了烟曲霉基因功能研究的进程。目前，曲霉基因敲除时的转化方法有①原生质体方法(protoplast)。通过制备原生质体来转化烟曲霉是最常用的方法，这种方法工作量大、消耗时间多，而且同源重组率非常低，通常lDNA转化后能得到1-100个转化子。②电转化法(electroporation)。与原生质体方法相比，优点是比原生质体法得到的转化子多2-10倍；但这些方法的非同源重组率高、多位点重组现象高，同源重组率更低。以上两种方法得到的转化子中发生单位点同源重组的几率〈1-3%，这就意味着转化后的筛选工作量非常繁重。③农杆菌介导的转化(^gro力acferiw/fftMze/acj'eTnnediatedtrasformation，ATMT)。农杆菌介导的转化已在植物基因工程中广泛应用。农杆菌内Ti质粒(双元载体)上含有T-DNA(transferredDNA)，T-DNA能被转移到植物细胞并整合到其染色体上。利用农杆菌和双元载体的这些生物学特性，把任意外源性DNA插入到T-DNA区，该外源DNA也能转化到植物细胞内并与其染色体整合。后来的研究发现，农杆菌不但能介导植物细胞转化，而且还能介导真菌、哺乳动物细胞等的转化。作为一种新的转化方法，农杆菌介导的转化己成功用于曲霉属的一些真菌的转化，如烟曲霉、土曲霉、Aa附;^w'，」.^>朋"^等。农杆菌介导的转化得到的转化子多数为单拷贝的同源重组。目前，农杆菌介导的真菌转化中，学者们使用的筛选标记是显性标记潮霉素磷酸转移酶(力p力)基因。潮霉素抑制真菌蛋白合成。野生株烟曲霉对潮霉素敏感，所以在含有该药的培养基上筛选转化子。使用这种筛选标记的缺点是筛选转化子的培养基上要加潮霉素；转化和筛选过程是分开的，而且需要两种培养基基础培养基和筛选培养基；转化过程中还需要尼龙膜；另外，在根癌农杆菌介导的一种人类致病真菌——组织胞浆菌的实验中发现，得到的转化子中有的是假性克隆(SullivanTD，RooneyP丄KleinBS.^ro力a"eri咖t咖e/acie"51integratestransferDNAintosinglechromosomalsitesofdimorphicfungiandyieldshomokaryoticprogenyfrommultinucleateyeast.EukaryotCell.2002，1(6):895-905.)，原因是在含潮霉素的筛选培养基上，部分烟曲霉会被诱导产生耐药，形成假性克隆。嘧啶是真菌生命必需的物质。乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶(orotidine-5'-raonophosphatedecarboxylase,p/r60基因是真菌嘧啶生物合成必需的基因，pyr6"基因功能缺失株烟曲霉在不含尿嘧啶和尿苷的培养基上不能生长。
发明内容本发明的目的是提供一种转化烟曲霉的方法及其专用表达载体。本发明所提供的表达载体，是在Ti质粒的多克隆位点插入p/i^基因得到的重组表达质粒。其中，所述Ti质粒可为现有的双元载体，或按照现有方法制备的双元载体，如图l所示的pDHt/sk。本发明所提供的转化烟曲霉的方法，是将外源DNA插入上述任一种表达载体，得到含有外源DNA的重组表达载体，将该含有外源DNA的重组表达载体通过根癌农杆菌的介导转入外TG功能缺陷的烟曲霉菌株中，得到转化子。所述根癌农杆菌的介导方法具体可为将所述含有外源DNA的重组表达载体导入根癌农杆菌中得到重组根癌农杆菌，将该重组根癌农杆菌和所述烟曲霉菌株的孢子共培养，将所述含有外源DNA的重组表达载体导入所述烟曲霉菌株中。本发明的转化烟曲霉的方法，适合于乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因功能缺陷的烟曲霉菌株，如烟曲霉AF293.1。本发明在转化中采取P/i^作为筛选标记，使农杆菌介导的烟曲霉转化更加简化和优化，即直接将曲霉孢子和农杆菌混悬液涂布在不含尿嘧啶和尿甘的诱导培养基上，转化子能够在这种培养基上生长，而非转化子则不能生长，也就是说这种诱导培养基同时也起到了筛选培养基的作用。这样的筛选方法与传统的转化方法相比，优点是转化子的同源重组率高。与以前用潮霉素抗性基因力P力作为筛选标记相比，①节省了筛选用药物潮霉素，②省去了一次转膜，节省了尼龙膜，③更重要的是这种筛选标记下得到的克隆均为转化子，不像用潮霉素抗性基因力P力作筛选标记时会出现假阳性的转化子。总之，以互补营养缺陷做筛选标记、农杆菌介导的烟曲霉转化的方法，同源重组率很高，降低了转化后筛选的工作量，节省了实验材料(尼龙膜、培养基、潮霉素)。本发明的转化烟曲霉的方法及其专用表达载体可广泛用于烟曲霉基因敲除，以研究目的基因的功能。图1为双元载体pDHt/sk的物理图谱图2为口0111://邵六;3//的物理图谱图3为平皿中筛选的烟曲霉AF293.1转化子图4为烟曲霉AF293.1和/。7基因敲除株zl/邵7的//7基因座位示意图图5为引物(pl、p2)扩增烟曲霉AF293.1和转化子的基因的结果图6A为引物(p3、p4)扩增烟曲霉AF293.1和转化子的基因的结果图6B为引物(p5、p6)扩增烟曲霉AF293.1和转化子的M尸7基因的结果具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例l、转化乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因功能缺陷的烟曲霉菌株1、构建转化乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因功能缺陷的烟曲霉的表达载体1)双元质粒pDHt/sk构建用处al和5^1从Ti质粒pGreenII(GIBC0/BRL公司)切下片段pal/6YwI(0.8kb)，再把该片段的粘性末端补平，该片段的构成如下中间是多克隆位点，其两侧分别是Ti质粒所共有的左、右T-borders序列。把该片段插入到质粒pCAMBIA1300(Australia,CAMBIA)两个Prall位点间，得到双元载体pDHt/sk。如果将pDHt/sk转化到根癌农杆菌，农杆菌则能把T-borders间的DNA序列转化到真菌。2)/P7基因及其侧翼序列的克隆发明人利用生物信息学方法从烟曲霉基因组(www.tigr.org/tdb/e2kl/afu1/)中检索出了与白色念珠菌、酿酒酵母、裂殖酵母的』尸-7基因同源的烟曲霉可能的AP-/基因，发现烟曲霉可能的力,-7基因(即FAP1基因)位于5号染色体上，其核苷酸序列是序列表中的序列1，编码的氨基酸序列是序列表中的序列2。以烟曲霉AF293.1(#1137，购自美国FungalGeneticsStockCenter)基因组DNA为模板，PCR扩增M尸73，侧翼序列(1348bp)、M尸7基因(1989bp)、5，侧翼序列(1475bp)，总长度为4812bp，上下游引物均引入^aI酶切位点(下划线处)。引物序列如下FAPlu-F:5，-GTCAGGGCCCGAGGACGTGGTGGTTTCAGT-3，FAPlu-R:5，-TGAGGGGCCCGCTGCTGAAGCTATCCCAAC-3，PCR产物大小约为4812bp。质粒pDHt/sk和以上PCR产物分别用进行酶切，酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶进行连接，并转化感受态大肠杆菌DH10B(Stratgene)，转化子进行蓝白筛选。提取转化子质粒DNA，用^sl酶切、T7通用引物测序证实上述PCR产物克隆到了pDHt/sk的力pal位点上(图1)，该PCR产物的核苷酸序列是序列3。将含有该PCR产物序列的重组质粒命名为pDHt//3/7。3)构巢曲霉；/2^基因替换双元载体？0肚//邵7上的/^尸7基因以构巢曲霉(美国FungalGeneticsStockCenter)的基因组DNA为模板，PCR扩增核苷酸序列是序列表中序列4的PJt6;双侧引物均引入Wcol酶切位点(下划线处)。引物序列如下pyrGu-F:5，-ACTCCATGGGTCAATACCGTTACACATTTCCA-3，，pyrGu-R:5，-TCACCATGGCCGCAGACAATGCTCTCTATC-3，用Ycol酶切该PCR产物和质粒pDHt//ap7，酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶进行连接，并转化感受态大肠杆菌DH10B。转化子在含卡那霉素(50ug/ml)的LB(Invitrogen)平皿上筛选；挑选阳性转化子，酶切、PCR扩增及测序证实PCR产物克隆到了口0^//<3;7的;化0[位点上(PCR产物序列如序列表中的序列5，其序列为pryG的序列加上引物的酶切位点)。重组的质粒命名为pDHt/Z^7:Ar/^(图2)。2、化学法将质粒口0肚//邵7.7^/^转化到农杆菌采用化学法将质粒pDHt//ap7:AF/^转化到根癌农杆菌EHA105(Clontech公司)中。挑取根癌农杆菌EHA105单菌落于28。C振荡培养至OD6。。为0.4;用预冷的CaCl2悬浮细胞，液氮中速冻lmin，制备农杆菌的感受态细胞。将质粒pDHt/A;六py7^加入上述感受态细胞，37°C，5min,热休克，待细胞复苏后，涂布于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上筛选。以转化子质粒DNA为模板PCR扩增构巢曲霉的；^r"以及M/V敲除盒。扩增V^尸7敲除盒的引物如下FAPlu-F:5，-GTCAGGGCCCGAGGACGTGGTGGTTTCAGT-3，(带下划线的碱基为^aI位点)，和FAPlu-R:5，-TGAGGGGCCCGCTGCTGAAGCTATCCCAAC-3,(带下划线的碱基为^dsI位点)。扩增/yTC的引物如下pyrGu-F:5，-ACTCCATGGGTCAATACCGTTACACATTTCCA-3，(带下划线的碱基为loI位点)，和pyrGu-R:5，-TCACCATGGCCGCAGACAATGCTCTCTATC-3，(带下划线的碱基为I位点)。结果在添加卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上筛选到，用FAPlu-F和FAPlu-R扩增得到4346bpM尸7敲除盒片段、pyrGu-F和pyrGu-R扩增得到1388bppyrf片段的阳性转化子。将含有质粒？0肚//^;^:;7_>^;的阳性转化子命名为A.t-pDHt/Z"一:/7《3、农杆菌介导的烟曲霉基因敲除1)农杆菌与烟曲霉共培养将嘧啶营养缺陷株烟曲霉AF293.1(#1137，购自美国FungalGeneticsStockCenter)接种在含尿嘧啶和尿苷的YAG培养基(5g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖，lmMMgS04,5mM尿嘧啶，5mM尿苷，20g/L琼脂)上活化4天。用土温20-生理盐水(组成生理盐水、0.1%土温)冲孢子；离心后，以含0.2uM乙酰丁香酮的诱导培养基IMAS(3.625g/LKH2P04，5.125g/LK2HP04，0.375g/LNaCl,1.250g/LMgS04.7H20，0.165g/LCaCl2.2H20，6.2mg/LFeS04.7H20，1.250g/L(NH4)2S04,10mM葡萄糖,0.5%甘油)重悬，调整孢子浓度到108、107、106个孢子/1111。农杆菌A.t-pDHt//^7:AK_rG在含卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基，振荡培养过夜。收集菌液，用IMAS重悬，调整0D6。。至0.15。再继续振荡培养6h，调整0D,至0.5。取等体积的孢子(108、107、106CFU/ral)和细菌悬液(各100u1)，均匀涂在IMAS琼脂[IMAS+琼脂(2g/L)]平皿。将平皿置于24。C，使孢子和农杆菌共孵育48h。2)转化子的筛选将平皿转移至37'C，孵育2天。每个平皿上均生长出十余个转化子(图3)。挑取IMAS平皿上的转化子单菌落，接种在含头孢噻肟钠(200ug/ml)的醒培养基(IOg/L葡萄糖，3.625g/LKH2P04，5.125g/LK異，0.375g/LNaCl，1.250g/LMgS04.7H20，0.165g/LCaCl2.2H20，6.2mg/LFeS04.7H20，1.250g/L(NH4)2S04，20g/L琼脂)上，连续分离单孢子、传代2次，以杀灭农杆菌并得到转化子的纯培养。3)烟曲霉转化子的鉴定将烟曲霉转化子接种在YG液体培养基(5g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖，lmMMgS04)，37t孵育过夜，收集转化子菌丝体，提取基因组DNA。两种PCR扩增方法筛选发生同源重组的转化子。其中，野生株(烟曲霉AF293.1)和M尸7基因敲除株(Zl的/^^基因座位示意图如图4所示。//邵7株染色体上/^尸7基因大部分被敲除，被构巢曲霉的AF/^基因替代。图中，N:Vca[。箭头为验证基因敲除的引物所在处(pl、p2是初筛引物对，p3、p4，p5、p6是验证引物对)。pl、p2不能扩增出产物，说明/^尸7基因被敲除，p3、p4，p5、p6能扩增出产物，说明/^2^在/^W座位发生了同源重组，进一步证实/^尸7基因被敲除。具体方法如下①根据/^尸7基因的编码序列设计一对引物(pl、p2)，分别以野生株(烟曲霉AF293.1)和16个转化子的基因组DNA为模板，扩增M尸7基因上的一段547bp的DNA片段，如果M尸7基因被敲除，该DNA片段则不能被扩增出。验证/^/7敲除的引物序列fapl-F(Pl):5,-GGACGATGGAGAGTCTGAGC-3，fapl-R(P2):5,-CCAAGAGAACGGACTTCTGC-3，PCR产物大小547bp。结果如图5所示，泳道5、6、7、9、13、16、17的转化子无扩增产物，说明M尸7基因被敲除，而泳道2、3、4、8、10、11、12、14、15的转化子能扩增出预计大小的产物，说明/^尸7基因未被敲除。图5中，泳道1为marker(100bpladdermarker)，泳道18为以野生株烟曲霉AF293.1基因组DNA为模板的扩增结果，扩增得到547bp的PCR产物。②设计2对引物(p3、p4，p5、p6)，每个引物对中分别有一个引物在/^尸7基因敲除盒子以外的染色体序列上退火，另一个引物在筛选标记仍T^上退火(图4)。如M/7基因敲除掉，则2对引物均应能扩增出产物。验证FAP1敲除用引物p3:5，-AGCCCTCCTACCCCTACAAA-3，p4:5，-CGAGGTGCGGACTTTATCAT-3，产物大小1855bp。p5:5，-TCAACTCTCCCCTCTGTGCT-3，p6:5，-CAGCTTCTCCAGCCACTACC-3，产物大小2407bp。分别以野生株(烟曲霉AF293.1)和步骤①的16个转化子的基因组DNA为模板，用引物对p3和p4，或引物对p5和p6进行PCR扩增，结果表明用引物对pl和p2PCR扩增无产物的转化子(图5中泳道5、6、7、9、13、16、17的转化子)，无论是引物对p3和p4，还是引物对p5和p6均有扩增产物(图6A和图6B中泳道11-17);用引物对pl和p2PCR扩增有产物的转化子(图5中泳道2、3、4、8、10、11、12、14、15的转化子)，无论是引物对p3和p4，还是引物对p5和p6均无扩增产物(图6A和图6B中泳道2-10)。图6A和图6B中，泳道1为以烟曲霉AF293.1基因组DNA为模板的扩增结果，没有PCR扩增产物。结果表明16个转化子中，PCR验证有7个的/^尸7基因被敲除，同源重组率为43.8%。序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>atcaataatcccattccagctgtcagacaagcgcgtcaaacacccctagc1380catgcc肪tagttccgacaaagctcttggtctggattttttcgcccaacagaatggaggt1440cagttcgaccctgtcctgttcggtgattggcgtgagcctc犯g3tgCt3ttttgtcacaa1500gactttggtacatttttcgatgatgcgttccctctccccgacttgggaagcccatcccac156033tttt3gCgaggegaccaagC犯CC3gC3gcgcc3朋gaiaggatcttatcgctgaaatt1620tggatg鄉atg8gg郷ttgtgcctggcgaggacaagtcgeaaatgetc16803cctgca^ta卿tstggg3tegtctgeaatccatggagaagttccgtaatggcgaggLtc1740gacgtggacaatctctgttcagaattgegeacc肌3gcc3gatgetctgaaggcggtgta1800gtegtcaateagaaagatgtcgaggacatcatgggtcgcgtcaaatag1848<210>2<211>615〈212〉PRT〈213〉烟曲霉(力印e2^77J〃s/咖i卵<400〉2MetAlaAsp1TyrAsnThrLeuTyrGinGinGly510LeuTyrLeuSerPro15AspGinGinAspLeuLeuLeuAlaAlaLeuSerSerAsnAsnProThr202530GinLysGinGinThrValThrHisAsnSerGluAlaAsnGinAsnLeu354045AsnHisThrProGlyHisAlaSerSerGlySerPheSerValSerPro505560ProSerGlyLeuAspGlySerValAsnGinSerThrThrPheGlyTyr65707580GluAspSerProTyrLeuAspLeuAsnProAspPheAspLeuAspPhe859095LeuGlyAsnGluSerLeulieGlyAspLeuProProSerLeuProSer100105110ThrGluAspTyrGluProGlyAspLysArgLysAsplieAspGlyGin115120125ValAsnAspLysGluAspSerGlyLysLysArgArgGluSerAspGlu130135140LysAlaAlaLysLysProGlyArgLysProLeuThrSerGluProThr145150155160SerLysArgLysAlaGinAsnArgAlaAlaGinArgAlaPheArgGlu165170175ArgLysGluLysHisLeuLysAspLeuGluAlaLysValGluGluLeu180185190GinLysAlaSerAspAsnAlaAsnGinGluAsnGlyLeuLeuArgAla195200205GinValGluArgLeuGinLeuGluLeuLysGluTyrArgLysArgLeu210215220SerTrpValThrSerThrSerGlyLeuSerProValAsnAlaliePro225230235240GlyAlaTyrSerLysGlyMetTyrGlyLeuAsnAsnAsnGluPheMet245250255PheAspPheProLysPheGlyAspLeuProGlySerHisLeuPheThr260265270AsnThrGinThrSerLysSerAsnGinAsnLysAlaLysAspAsnPro275280285ThrAlaThrProArgSerGluAlaGinValProGlyValLeuAsnArg290295300AsnAspLeuLyslieSerSerProAsnGlyLeuSerAsnGlyProSer305310315320ProAlaLysSerThrProSerGlyGinThrProAsnSerGinThrSer325330335ThrArgProGlySerGlyThrLeuAsnGlyAlaValAspAsnAsnGly340345350AlaAlaArgGlyTyrGinValAsnSerSerTyrSerAlaSerThrLys355360365GinAlaThrHisAspThrProSerSerAspSerProSerSerSerSer370375380AspSerHisGinSerGinLeuLeuSerSerAsnGlyThrSerProGlu385390395400ProSerLeuHisSerProAlaValLysAlaThrGluSerSerThrPro405410415HisAlaCysThrTyrThrThrlieAsnGlyGluGluSerPheCysAla420425430GinLeuSerMetAlaCysGlyAsnlieAsnAsnProlieProAlaVal435440445ArgGinAsnSerGluSerAlaSerAsnThrProSerHisAlaAsnSer450455460SerAspLysAlaLeuGlyLeuAspPhePheAlaGinGinAsnGlyGly465470475480GinPheAspProValLeuPheGlyAspTrpArgGluProGinAspAla485490495lieLeuSerGinAspPheGlyThrPhePheAspAspAlaPheProLeu500505510ProAspLeuGlySerProSerHisAsnPheSerGluAlaThrLysGin515520525ProAlaAlaProLysLysAspLeulieAlaGlulieAspSerLysLeu530535540AspGluAspGluGluValValProGlyGluAspLysSerGinMetLeu545550555560ThrCysAsnLyslieTrpAspArgLeuGinSerMetGluLysPheArg565570575AsnGlyGlulieAspValAspAsnLeuCysSerGluLeuArgThrLys580585590AlaArgCysSerGluGlyGlyValValValAsnGinLysAspValGlu595600605AsplieMetGlyArgValLys610615〈210〉3〈211〉4812<212〉DNA〈213〉烟曲霉U，，77"s/,'卵zto)〈400>3gctgctg鄉ctatcccaactatccctccagagcaggtagt3gat3C3g3acaacgccct60caacgggcax:ccccacgctgcagtgactgccatattctaggccat鄉cgsttgcaatgt120ccgcagcgcaag肌t^ctagatttagt3ataa^tca^tgttttaggggttc犯aatsgc180ctccaatttcggccgcggcc犯3ttct已tggtatggtgatccgctcggttgcgtgatccg240ctcgcttaccgattacgttaattagtaactgtttaatttcccccggttga300a卿gggaccattgcacggaagtagc肌gtcagcttctgactgagcatttctatggctgg360a^cta^taatatggcgcgtgg犯cttcgtcggcacggaggLgaaccaatatccggcca_a_a420tgtgatttct肌gcaccgggtcactcaaaatttccgctctaaagcagcgggagccatcag480atacaaccattggcttccatctatctactggcccttgttxagctatcgac5403attgacgctgcctttctgcacccaatttgccccccatgatCCt3tgg333CaCCC3tCC600taagactggcctaaggcgttgattgattgccttgtgaaccgctcceitcgccgcccccgtx660ttcttggaaaagtggaaaatgatggccttcggtttcatccttgtaccacctcccctctca720gccacgtctctctcacttcacctattctcatcagtaga^tcccctgtctcaattcccact780tcgaatctcttcatctccgcaggcttcttcctggcctgaaaatcaatcactcatatccaa840cgacctattctcaatcggaccctgatttgccgctttcggcagcccctcatcgccagctat■caagcggtaccgctgcgccattccactctatacgacatctttccatctgaC3Ct3ggCC6L960ctaggccacactxtggcatcagctcttggccgctgcaaccttttatcttaatctcaccac1020cttttttttgaccctttcgctgccactgtacttctcatxgactctcctccgtcatcaatt1080ctttcgctcateittgtgsta^tctcattcgactcgcttggag恥cctgg肌tccgcttgac1140tgtatcttttctgattgtcccacattcccttttgtcttcacaitca_a_cgggattgatgcct1200tgttg鄉cggggtgg碰cataagagctttagtggcctttccgtcttcatcagcattta1260caaactcagcactttgacacatttcttgggctctccatcgaaaagataaacgggctcaaa1320gcccggccttttccggttgaggacaccgataagccgax:aacctaaacattgcattgtatt1380cgaacaagccgacagcgggttaaacaatcactctcagttgacccgaatcatcctactgtt1440attceLca^gcgataccccgcttcgttttcagttgccatggcggactacaatactctttatc1500aacaaggtctttatctctcccccgatcaacaggacctcctcctcgcagctctttcatcga1560ac^icccgactcaga犯caacaaacagtgacgcacaactccgaagccaaccagaacctca1620cggccatgcttcttccggtagcttcagtgtttctccccccagtggtttgg1680acggctcggtgaatcagtcaactactttcggctacga^gatagtccttacctggatctga1740atcccgacttcgaccttgattttctgggcaacgagagcttgattggtgatctgcccccga1800gcttgccttcgactgaagactatgagcctggtgat犯gcgaaaggatatcgatggacaag18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