专利名称：：一种利用kdr基因多态性预测冠心病易感性的方法及试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用KDR基因多态性预测冠心病易感性的方法及试剂，更具体地说是通过测定人KDR基因多态性预测受试者对于冠心病的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物
技术领域：
。技术背景心血管病已经成为全球严重危胁生命和健康的重要疾病，每年为此消耗了大量人力、物力和财力。能够找到这类疾病的早期预测标记意义非常明显。冠心病的发生是基因遗传倾向和一系列环境危险因素长期作用的结果所导致的，正常血管内的维护修复能够对抗环境危险因素所造成的血管损伤。目前进行冠心病的遗传病因研究，多采用单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism)作为基因组标志的关联分析方法，是有效的。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1%，SNP是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1%为同型碱基之间的转换如G/A或T/C，29.1%为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺啼啶)，SNP包含了己知多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNP在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个(BrookesAJ.TheessenceofSNP.Gene,1999;234:177-186.)。SNP以其密度高，平均每lkb就有l个；代表性强，位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平；遗传稳定性好，同微卫星多态性比较而言；易于自动化分析，因SNP在人群中为双等位基因标记，可简单以"+/-或1/0"直接分型，成为很好的遗传标志。(CollinsFS,BrooksLD，ChakravartiA.ADNApolymorphismdiscoveryresourceforresearchonhumangeneticvariation.GenomeRes，1998;8:1229-1231)。位于染色体4qll-ql2的KDR(kinaseinsertdomainreceptor(atypeIIIreceptortyrosinekinase))基因编码血管内皮生长因子(VEGF)的II型受体，是个1536个氨基酸的跨膜蛋白，且KDR是内皮祖细胞EPC(endothelialprogenitorcells)的重要表面抗原。有限研究指出，VEGF/KDR通路在血管生成，血管修复方面发挥重要作用，且EPC的活性和数量与冠心病的发病风险密切相关。因此，KDR的基因多态性一定与冠心病的易感性有着重要的关系。经过现有国内外文献检索，未见有KDR基因多态性与冠心病相关联的报道。
发明内容本发明的主要目的是提供一种预测冠心病易感性的方法。本发明的第二个目的是提供一种预测冠心病的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案-一种预测冠心病易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的KDR基因启动子区-604位点，编码区1192、1719位点的(对应NCBI的SNP库中标准编号分别是rs2071559、rs2305948、和rsl870377)基因型，预测受试者对冠心病的易感性三个位点的危险等位基因-604C，1192A，1719A，分别增加冠心病的风险为1.24，1.32，1.38倍。同时具有的时候采用相乘的系数，此时受试者的易感性最高。本发明提供了两种分离核酸，具有SEQIDNO.l和SEQIDNo.2所示的碱基序列，SEQIDNO.l为KDR的启动子区部分序列，其第177位是C，SNP-604的位点；SEQIDN0.2为KDR的mRNA序列，其1192和1719位是A和A，分别是SNP1192和SNP1719位点。图1为位于多态性变异位点的示意图，SNP1192位于第7个外显子上，SNP1719位于第11个外显子上。本发明提供了三组等位基因特异性的引物，具有SEQIDN0.3至EQIDN0.8所示的碱基序列，长度为19-22bp，而且可以特异性地扩增出SEQIDNO.l和SEQIDN0.2所示序列中SNP-604、SNP1192和SNP1719扩增产物。本发明提供了一种检测冠心病易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增KDR基因的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。检测扩增产物与正常KDR基因相互对比是否存在变异时，所需的化学试剂还包括特异性内切酶等。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下本发明试剂盒供IO人份检测应用，保存于-20'C，其组分、含量和来源如下60ul10XPCR缓冲液(Takara)，50ul10mMdNTP混合液(Takara)，lOul(2unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各12ul(50pmol/ul)Fl和Rl引物(奥科合成)1.5ml纯水(自制)，20ul10X限制酶反应缓冲液(NewEnglandBiolabs),1Oul(1Ounit/ul)限制酶(NewEnglandBiolabs)。其中Fl禾BRl为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4时且限制酶为5顶I用于检测SNP-604位点；为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6时且限制酶为用于检测SNP1192位点；为SEQIDNO.7和SEQIDNO.8时且限制酶为用于检测SNP1719位点。本发明可以同时含有以上三个引物对。试剂盒的使用方法1)通过PCR扩增所检测的SNP位点包括-604、1192、1719的部分片段加入基因组DNA溶液100ng、5ulIOXPCR缓冲液、4uI10mMdNTP、1.25单位TaqDNA聚合酶和50pmolFl和Rl分别为正向引物和反向引物；加入纯水，使总体积为50ul。按常规PCR反应条件操作。反应在变性30秒，退火30秒(退火温度根据不同的仪器及体系可能变化)，72i:延伸30秒，进行30个循环。反应完成后，取3ulPCR产物琼脂糖凝胶电泳检测(浓度分别为3%、4%、和3%针对-604、1192和1719位点)，如-604位点扩增了290bp、1192位点扩增了262bp、1719位点扩增了404bp的片段，获得了单一条带，即为扩增成功。2)通过用限制酶处理PCR反应产物测定KDR基因的这三个多态性向10ul上述扩增的PCR反应产物中加入lul限制酶反应缓冲液、0.2ul限制酶，并在适当温度水浴中消化过夜。之后，琼脂糖凝胶电泳检测(浓度分别为3%、4%、禾卩3%针对-604、1192和1719位点)。(注SNP-604位点限制酶为fowI，消化温度为65。C;SNP1192位点限制酶为SWZ/71，消化温度为37"C;SNP1719位点限制酶为^M，消化温度为37。C)3)多态性定型SNP-604:174bp+116bp两个条带为CC基因型，单一条带为TT基因型，174bp+116bp+2卯bp3个条带为杂合型CT。SNP1192:30bp+232bp两个条带为AA基因型，单一条带为GG基因型，30bp+232bp+262bp3个条带为杂合型AG。SNP1719:191bp+213bp两个条带为AA基因型，单一条带为TT基因型，191bp+213bp+404bp3个条带为杂合型AT。本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制如，体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。在进行本发明的基因诊断时，优选使用用于测定根据KDR基因的突变类型存在的诊断试剂，诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定KDR基因突变类型的方法。特定的试剂按采用的测定方法来适当地选择。试剂的特征是，组成测定由KDR基因定义的突变类型的手段是必要的，如，DNA片段/和/或作为用于测定的特异限制酶。试剂，例如特定制备的用于PCR扩增步骤的引物，该步骤用于包含KDR基因的突变点的特定扩增片段，不被认为是本发明诊断试剂的必要成分，它们也包含于本发明的诊断试剂之中。本发明的优点是本发明首次阐明了KDR基因多态性位点与冠心病的相关性，提供了一种预测冠心病易感性的方法，该方法可用于冠心病的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为KDR基因的3个单核苷酸多态性(SNP)位点的示意图。具体实施方式用于下列实施例中表示试剂的英文縮写如下。需要时，用高压锅(12(TC，20分钟)灭菌EDTA:乙二胺四乙酸二钠SDS:十二烷基硫酸钠TE:10mMTris—HCl(pH7.5)，lmMEDTA(pH8.0)10XPCR缓冲液100mMTris—HCl(pH8.3)，500mMKC1，15mM氯化镁(MgC12)0.01%(W/V)白明胶dNTP:脱氧核苷三磷酸琼脂糖实施例l:血液样本收集和基因组DNA的提取从中国医学科学院阜外心血管病医院收集19至83岁的无血缘关系的病例。入选标准是经冠脉造影分析，冠状动脉主干支至少有一支存在》50%的狭窄。而作为对照的须<20%的狭窄。共计收集冠心病患者665例，平均年龄57.9岁±9.5岁，其中男性占84.4%，对照1015例，平均年龄57.7岁±8.7岁，其中男性占82.6%。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了本单位伦理委员会批准。根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的10ml人外周血在2500rpm,离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2%NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2%的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗漆。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10%SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16ul和20ul，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37'C过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离IO分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000卬m离心分离IO分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10,3MNaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70X的乙醇洗涤以获得基因组DNA。使这样获得的DNA，基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至30ng/ul，置-20'C冰箱保存。实施例2:SNP的识别确定本发明采用PCR-RFLP禾nPCR测序技术同时对KDR基因的三个位点SNP-604、SNP1192、禾BSNP1719进行检测。采用特异性引物SEQIDN0.3至SEQIDN0.8分别进行扩增分型。1.通过PCR扩增所检测的SNP位点包括-604、1192、1719的部分片段加入基因组DNA溶液100ng、5ul10XPCR缓冲液、4ul10mMdNTP、1.25单位TaqDNA聚合酶和5Opmo1Fl和Rl分别为正向引物和反向引物；加入纯水，使总体积为50ul。按常规PCR反应条件操作。反应在变性30秒，退火30秒(退火温度根据不同的仪器及体系可能变化)，72'C延伸30秒，进行30个循环。反应完成后，取3ulPCR产物琼脂糖凝胶电泳检测(浓度分别为3%、4%、和3%针对-604、1192和1719位点)，如-604位点扩增了290bp、1192位点扩增了262bp、1719位点扩增了404bp的片段，获得了单一条带，即为扩增成功。2.通过用限制酶处理PCR反应产物测定KDR基因的这三个多态性向10ul上述扩增的PCR反应产物中加入lul限制酶反应缓冲液、0.2ul限制酶，并在适当温度水浴中消化过夜。之后，琼脂糖凝胶电泳检测(浓度分别为3%、4%、和3%针对-604、1192和1719位点)。(注SNP-604位点限制酶为S^Ml，消化温度为65'C;SNP1192位点限制酶为&"/71，消化温度为37'C;SNP1719位点限制酶为^M，消化温度为37°03.多态性定型SNP-604:174bp+116bp两个条带为CC基因型，单一条带为TT基因型，174bp+116bp+2卯bp3个条带为杂合型CT。SNP1192:30bp+232bp两个条带为AA基因型，单一条带为GG基因型，30bp+232bp+262bp3个条带为杂合型AG。SNP1719:191bp+213bp两个条带为AA基因型，单一条带为TT基因型，191bp+213bp+404bp3个条带为杂合型AT。实施例3:KDR基因SNP与冠心病的相关一.方法利用SPSS13.0软件进行分析，检验Hardy-Weinberg平衡检测，数量变量采用t检验，质量变量采用卡方检验。双侧P<0.05认为统计学的差异显著。采用单因素Logistic回归分析计算冠心病的患病风险OR值及其95%可信区间(CI)。二.结果1.病例和对照的基本临床资料见表1。_表1_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>TG，mmol/L吸烟％高血压史，％糖尿病史，％1.45(15.10)1.60(13.11)*37.458.0*24.947.4*4.614.9*<0.012.KDR基因这三个SNP显著与冠心病相关联，详见表2。表2:KDR基因的基因多态性与冠心病的相关性基因型，n(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>原始OR根据2x2四格表计算，经过年龄、性另U、吸烟、BMI，HDL,non-HDL，TC,TG,和高血压史，糖尿病史的校正logistic回归分析得出校正的OR值,M-T,m-C对于SNP-604;M=G，m=A对于SNP1192;M=T，m=A对于SNP1719.可见，KDR的三个基因多态性显著与冠心病的易感性相关。实施例4:检测试剂盒制备检测冠心病相关风险的试剂盒，包含有可扩增出KDR基因3个SNP位点的引物对，及其PCR-RFLP相应试剂，成分和含量如下，于一2(TC保存60ul10XPCR缓冲液(Takara),50ul10mMdNTP混合液(Takara)，10ul(2unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各12ul(50pmol/ul)Fl和Rl引物(奥科合成)，1.5ml纯水(自制)，20ul10X限制酶反应缓冲液(NewEnglandBiolabs)，10u(10unit/ul)限制酶(NewEnglandBiolabs)。其中Fl和Rl为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4时且限制酶为^wl用于检测SNP-604位点；为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6时且限制酶为用于检测SNP1192位点；为SEQIDNO.7和SEQIDNO.8时且限制酶为J/wI用于检测SNP1719位点。本发明具有实用性的例证1)本发明的KDR基因多态性的检测方法可用于分析KDR基因上的SNP-604、SNP1192、SNP1719三个位点的多态性，应用在对冠心病的辅助性诊断和对个体是否有多大的冠心病患病风险进行评估。以利于开展冠心病的早期干预和治疗。2)利用本发明阐述冠心病基因的三个多态性，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节KDR表达的活性分子，促进KDR新药开发。3)本发明建立的检测KDR基因多态性的核酸序列和冠心病相关位点，可高灵敏度，特异性地应用于冠心病基因诊断用的试剂盒。如上所述，得出结论，KDR基因的三个多态性与冠心病具显著相关性。因此，根据本发明，测定这些多态性可用于进行基因诊断。本发明叙述了KDR基因冠心病相关的新突变点，并提供了一种测定KDR基因这三个多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定KDR基因的多态性。结果，本发明提供了一种测定冠心病相关基因多态性的基因诊断方法。序列表〈110〉中国医学科学院阜外心血管病医院〈120〉一种预测冠心病易感性的方法及试剂〈130〉<160>8<170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211〉781<212〉腿<213〉人属，人种〈400〉1cctccttcccctgggcctaaggatatcttggccaaactttcactagggctcttcgttgggtaggcaggtcacttcaaacttggagccgcccg獄tgggcaagtgcgttttctgattaagttstactggcacccttatacccagcttgcgacccggcatacttggctgagctgcagattctcggccacttcagacgcgcgcgcctggtgaggg3gCggtgctcttcgcaggaccggcaagcgattaaatcttggagttgccaaagttgttgctctgggatcagtccagttgtgtggggaaatggggagatgccgggtaccCgggtg3ggggcggggctggccccgccccgcatggccccgcctccgcgctgctggaagctctgctctgaaaaggggcatg60gagcacgatggacaaaagccttcttggggc1203犯tattttgggaaatagcgggaatgctgg180agcaacc3ggittcagctttttaasctEicaa240actactggcaggagtcgctg300tatccgcttctcccttgtggctccaaactg360cgatggcg犯gsgggtcctgcactttgacg420cgctcctggtgatgctccccaaatttcggg480tcagcgcccgttaccgagtactttttattt540gttctctcctgggcgacttggggcccagcg600gtaaatgggcttggggagctggagatcccc660ccgcacgggagagcccctcctccgccccgg720ctagagtttcggctccagctcccaccctgc780781<210〉2<211>5830〈212〉腿〈213〉人属，人种<400>2actgagtcccgggaccccgggagagcggtcagtgtgtggtcgctgcgtttcctctgcctgcgccgggcatcacttgcgcgccgcagaaagtccgtctggcagcctggatatcctctcctaccggcacccgcagacgcccctgcagccgccggtcggcgcccgggctccctagccctgtgcgctcaactgtcctgcgctgcggggtgccgcgagttccacctccgcgcctccttctctagacaggcgctgggagaaagaaccggctcccgagttctgggcatttcgcccggctcgaggtgc;|atg|cagagcaaggtgctgctggccgtcgccctgtggctctgcgtggagacccgggccgcctctgtgggtttgcctagtgtttctcttgatctgcccaggctcagcatacaaaaagacatacttacaattaaggctaatacaactcttcaaattacttgcaggggacagagggacttggactggctttggcccaataatcagagtggcagtgagcaaagggtggaggtgactgagtgcagcgatggcctcttctgtaagacactcacaattccaaaagtgatcgga犯tgacactggagcctacaagtgcttctaccgggaaactgacttggcctcggtcatttatgtctatgttcaagattacagatctccatttattgcttctgttagtgaccaacatggagtcgtgtacattactgagaacaaaaacaaaactgtggtgattccatgtctcgggtccatttcaaatctcaacgtgtcactttgtgcaagatacccagaaaagagatttgttcctgatggtaacagaatttcctgggacagcaagaagggctttactattcccagctacatgatcagctatgctggcatggtcttctgtgaagcaaaaattaatgatgaaagttaccagtctattatgtacatagttgtcgttgtagggtataggatttatgatgtggttctgagtccgtctcatggaattgaactatctgttggagaaaagcttgtcttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacccttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatgaagaaatttttgagcaccttaactatagatggt互taacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgcagcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaaaccttttgttgcttttggaagtggcatggaatctctggtggaagccacggtgggggagcgtgtcagaatccctgcgaagtaccttggttacccacccccagaaataaaatggtataaaaatggaataccccttgagtccaatcacacaattaaagcg60120180240300360420480540600660720780840卯O96010201080114012001260132013801440gggcatgtactgacgattatgg犯gtgsgtg犯3gagacacactgtcatc1500cttaccaatcccatttcaaagg卿agcagagccatgtggtctctctggttgtgtatgtc1560cc3cccc3ga_ttggtgsg犯atctctaatctctcctgtggattcctaccagtacggcacc1620actcaaacgctgacatgtacggtctatgccattcctcccccgcatcacatccactggtat1680tggcagttggaggaagagtgcgccaacgagcccagccaggctgtctcagt1740tacccttgtg犯gtgtggaiggacttccagggsgga犯ta^aattgaagtt1800aatttgctctaattgaaggsctgtaagtacccttgttatc1860caagcggca^atgtgtcagctttgtaca犯tgtg犯gcggtc犯c犯agtcggg卿gga1920gagagggtgstctccttccaCgtg3CC3ggggtcctgaaattactttgcaacctgacatg1980C￡LgCCC￡LCtgagc鄉agagcgtgtctttgtggtgcactgcagEicagatctacgtttgag2040aacctcacatggtac犯gcttggcccacagcctctgccaatccatgtgggagagttgccc2100acacctgtttgc犯g犯cttggstactctttgga犯ttgaatgccaccatgttctctaat2160agcaca33tgacattttgatcstggagcttccttgcaggaCC犯gg3g3C2220tatgtctgccttgctc犯gaattgcgtggtcaggcagctc2280acagtcctagagcgtgtggc￡LCCC￡LCgatCacaggaagLCctggagaatcag￡LCg￡LC￡l3gt2340attggggaaagcatcg33gtctcatgcacggcatctgggaatccccctccacagatcatg2400tggttt犯agat犯tgagacccttgtagaagactcsggc已ttgtattgaaggstggg犯c2460cggaacctcactatccgc已g3gtg3gg犯ggaggaxg^ggcctctacacctgccaggca2520tgcagtgttcttggctgtgc犯犯gtggaggcatttttcataatagaaggtgcccaggaa2580tattctagtaggcacggcggtgattgccatgttcttctgg2640ctacttcttgtcatcatcctacggaccgtt犯gCgggCC3stgg鄉gga3ctg犯gac32700ggctacttgtccatcgtcatgg3tCC3g3tg犯ctcccattggatg犯cattgtg3acg32760ctgccttatgatgccagcaaatgggaattcCCC3g3g3CCggctgaagctaggt犯gcct2820cttggccgtggtgcctttggccaagtgattg犯gc柳tgcctttgg犯ttgacaag3ca>2880gcascttgcaggacagtagcagtcaaaatgttga^gatagg￡tgC￡LaC￡LC￡Lcagtgagcat2940cgagctctcatgtctgaatctcaagatcctcattcatattggtcaccatctcaatgtggtc3000犯ccttctsggtgcctgtacC犯gCC3gg3gggccactcatggtgattgtggaattctgc3060aaatttggaaacctgtccacttacctgagg3tg犯tttgtcccctac犯g3120acc犯aggggcacgattccgtcaagggaaagactacgttggagc犯tccctgtgg3tCtg3180aaacggcgcttggacagcatcaccagtagccagagctcagccagctctggatttgtggag3240gagaagtccctcagtgatgtagaagaagaggaagctcctgaagatctgtat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