专利名称：一个与耐旱相关的水稻wrky基因的克隆及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物中与胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源 于水稻的与耐旱性相关的WRKY转录因子及其编码基因与其在培育提高耐旱性植物中的 应用。
背景技术：
植物在生长发育过程中经常遭受生物胁迫和非生物胁迫的危害，为了应对这些胁迫， 植物体在长期的进化过程中进化出了一系列应对机制，以抵御各种生物和非生物胁迫环 境。在众多的应对机制中，基因表达的转录调节在植物应答环境信号刺激反应过程中起着 非常重要的作用。在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞 和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。很多基 因由于受到逆境胁迫诱导表达(Shinozaki， K. and Yamaguchi-Shinozaki， K.(1994). Molecular responses to drought and cold stress. Cw/r 6>j^.历c^ec/zwo/ 7， 161-167; Thomashow， M.F. (1999). Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Wew尸to"/P/^/o/Pto^Mo/50， 571-599)，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁 迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少 伤害，增强对胁迫环境的抗性。在受到逆境胁迫诱导表达过程中，转录因子对基因的转录 和表达起着调控作用，是植物体中一种非常重要的调节蛋白。转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件特异结 合并相互作用从而激活或抑制转录的DNA结合蛋白。从蛋白质结构分析，转录因子通常由 DNA结合区、转录调控区(包括激活区或抑制区)、寡聚化位点(用于识别)和核定位信号组 成(Liu L, White M J， MacRae T H. Transcription factors and their genes in higher plants functional domains, evolution and regulation. ￡wr J Swc/ em, 1999,262(2)， 247-257)。转录因 子通过这些功能区域与基因启动子中的顺式元件作用或与其它转录因子的功能区域相互 作用来调控基因的转录和表达。在植物的整个基因组中，编码转录因子的基因占了很大一部分，比如，拟南芥中编码 转录因子的基因至少有1500个(Riechmann, J丄.，Heard, J.， Martin, G., Reuber， L., Jiang, C.-Z., Keddie, J.: Adam， L., Pineda, O., Ratcliffe, O.J,, Samaha, R.R., Creelman， R.， Pilgrim, M., Broun, P.， Zhang, J.-Z.， Ghandehari, D., Sherman, B.K., and Yu, G.-L. (2000).爿ra磁Oj^transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes. S"'ewce 2卯，2110》 占整个基因组的5%以上。这些转录因子大多属于大的基因家族，有的基因家族又可包括 许多亚族，而且有些转录因子家族是植物所特有的。目前已知在植物中与胁迫相关的转录 因子主要有具有AP2结构域的AP2 (APETALA2)/ EREBP (ethylene responsive element binding protein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP (basic region /leucine zipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转 录因子家族、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇 (Tip cluster)的MYB家族。AP2 (APETALA2)/EREBP、 bZIP、 MYC、 MYB这四个家 族均参与调节植物对干早、高盐和低温等的逆境胁迫反应。WRKY蛋白是只存在于植物中的一类转录因子，含有保守的60个氨基酸的WRKY结 构域，因这个结构域中N端含有极为保守的氨基酸序列WRKYGQG而得名。结构域中还 含有一种新的锌指模体，是一类锌指蛋白。几乎所有的WRKY蛋白对W框 [(C/T)TGAC(C/T)]都具有结合特性，是DNA结合蛋白。根据WRKY结构域的系统发生关系及锌指结构的特征，将该家族因子分为三个大组八 个亚组第I组(包括Ia和Ib两个亚组)通常含有两个WRKY结构域，位于C端的WRKY域具有 DNA结合活性，N端的WRKY域不能单独与DNA结合，其功能目前尚不清楚，该组的锌 指结构为C2H2;第II组(包括IIa、 IIb、 IIc和IId四个亚组)通常含有一个WRKY结构域，锌指结构同第 I组相同，为C2H2;第m组(包括IIIa和IIIb两个亚组)也是含有一个WRKY结构域，但其锌指结构为 C2HC。WRKY蛋白与W框作用，各种W框中均含有不变的TGAC核心序列，这对于行使W框 的功能及WRKY的结合是必需的(Yu D Q, Chen C H, Chen Z X. Evidence for an important role of WRKY DNA binding proteins in the regulation of JVPi 7 gene expression.尸/aw/ CW/， 2001, 13(7): 1527-1540; Sun C， Palmqvist S， Olsson H, " a/. A novel WRKY transcription factor, SUSIBA2, participates in sugar signaling in barley by binding to the sugar腳reponsive elements of the /卵7 promoter.Ce〃, 2003， 15(9): 2076-2092; Turck F, Zhou A, Somssich I E. Stimulus-dependent, promoter-specific binding of transcription factor WRKY1 toits native promoter and the defense-related gene PcPRl扁l inparsley. CW/， 2004, 16(10):2573-2585) 。 W框介导了对病源物来源的激发子诱导的转录反应，存在于许多与植物防卫反应相关基因的启动子中。有功能的W框常成簇存在于启动子序列中，很多WRKY基因自 身也都带有W-box ，暗示着WRKY蛋白可能与其他WRKY蛋白或其他类转录因子共同作 用。WRKY蛋白是植物中特有的一类转录因子家族，在拟南芥中，WRKY家族有72-74个 成员(Eulgem T, Rushton P J， Robatzek S， " a/. The WRKY superfamily of plant transcription factors. 7Ve"A Sc" 2000, 5(5): 199-206; Dong J X， Chen C H, Chen Z X. Expression profiles of the y4ra6/c/c^w^ PF7 ATgene suerfamily during plant defense response. ZVa"f j/o/ 5/o/, 2003, 51(1): 21-37)，水稻中有100余个成员，主要分布在l号和5号染色体上(Wu K L, Guo Z J, Wang H H， " a/. The WRKY family of transcription factors in rice and爿ra脇o/wis and their origins. Z)7V」2005， 12(1): 9-26; Zhang Y J, Wang L J. The WRKY transcription factor superfamily: its origin in eukaryotes and expansion in plants.万MC ^fiVo/说o/， 2005, 5(1): 1-12)。WRKY家族基因功能主要是参与植物的抗病反应、调控损伤诱导基因、影响植物的衰 老、参与植物生长和发育过程、抵抗逆境胁迫等。WRKY基因家族参与植物防卫抗病反应。有报道指出，植物被病毒、细菌、真菌激发子等物质感染后，体内WRKY基因的mRNA、蛋白质及其DNA结合活性的水平都有提高(Wang Z P, Yang P Z, Fan B F, W a/. An oligo selectionprocedure for identification ofsequence-specific DNA-binding activities associated with plant defense. 1998， 16 (4):515~522; Eulgem T， Rushton P J, Schmelzer E, et al. Early nuclear events in plant defensesignalling: rapid gene activation by WRKY transcription factors. ^EMBO >/, 1999,18(17):4689 4699; Rushton P J， Torres J T, Parniske M， " a/. Interaction of elicitor-inducedDNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley尸i 7 genes.五M501996， 15(20): 5690~5700; Fukuda Y. Interaction of tobacco nuclear protein with anelicitor-responsive element in the promoter of a basic class I chitinase gene. P/a / jWb/ 5/o/，1997,34(1): 81~87)。拟南芥『i 《nS中度水平表达会引起PR基因表达及对丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)的抗'性增弓虽(Chen C H, Chen Z X. Potentiation of developmentallyregulated plant defense response by AtWRKY18, a pathogen induced Arabidopsis transcriptionfactor. P/flWP/ywol, 2002,129(2): 706~716)。WRKY基因调控损伤诱导基因的表达,拟南芥中AtWRKY6在损伤1小时后被诱导表达并随时间延长而增加，在6小时内保持较高的表达水平(Robatzek S.， and Somssich I.E., 2001, A new member of the A rabidopsis WRKY transcription factor family, AtWRKY6， is associated with both senescence-and defense-related processes, P/a"", 28:123-133)。烟草叶片
WIPK的表达在损伤处理3分钟后即有明显增加，5分钟达到最大值，30分钟回落到起始 值。WRKY基因家族还参与植物发育与物质代谢过程，拟南芥WRKY类转录因子TTG2 基因至少控制三个不同的形态发生过程毛状体发育、外层种皮中植物黏液的产生和内种 皮中单宁酸的生成，还可能与根发育有关(Johnson C S, Kolevski B, Smyth D R. 7TL4A^尸J7 57Vr 71￡57^ (7L45iM2， a trichome and seed coat development gene of 乂ra^/do/w/i1, encodes a WRKY transcription factor.Ce〃， 2002， 14(6): 1359~1375) 。 OsWRKY71是 糊粉层细胞内GA信号转导途径的转录抑制因子(Zhang Z L, Xie Z, Zou X， et al. A rice WRKY gene encodes a transcriptional repressor of the gibberellin signaling pathway in aleurone cells.尸/flW尸/^fo/, 2004， 134(4): 1500~1513)。WRKY类转录因子参与植物的衰老过程，拟南芥PF/ ii:n3基因参与叶片衰老早期发 生。Robatzek等对多个拟南芥『i /:y基因进行比较表达分析，结果显示，某些WRKY类 因子参与植物衰老过程的调控，他们以6个拟南芥ESTs克隆为探针对拟南芥三个不同发育 阶段叶片中的『i 《F基因的表达进行研究，结果发现，在幼叶和完全成熟的绿叶中，除 、 6以外的其他几个基因都有较弱的表达；在衰老叶片中，『及《}^、 6 、 7、 7/有 高水平表达。同时他们在对植株不同发育阶段不同组织中『i /^6表达情况进行分析时注意 到该基因在各种组织中都有很弱的表达，但在根和花中相对较强，在衰老叶片中表达最 强，暗示At^ /iT6参与叶片的衰老过程(Hinderhofer K, Zentgraf U. Identification of a transcription factor specifically expressed at the onset of leaf senescence.尸/慮a， 2001， 213(3》 469~473; Robatzek S., and Somssich I.E., 2002, Targets of AtWRKY6 regulation during plant senescence and pathogen defense, Gewes Dev., 16:1139-1149)。WRKY家族基因参与抵抗逆境胁迫，仇玉萍等从低温(4'C)诱导的水稻叶片cDNA文库中克隆获得了13个『i 《r基因，其中有10个『i AT基因的表达受到NaCl、 PEG、低温(4'C)和高温(42'C)等非生物逆境因子的影响，并且不论在逆境因子种类还是在诱导时间上，它们的诱导表达模式均存在很大差异。其中水稻『i^:ra0基因只受PEG诱导，可能在水稻抵抗干旱逆境因子的信号转导途径建立和抗旱性状形成等方面发挥重要调控作用。水稻『wxn6基因的分子生物学功能可能主要体现在调控水稻抵抗盐害和干旱逆境因子胁迫等方面的生物学性状形成和相应的信号转导途径建立上(仇玉萍，荆邵娟，付坚，等.13个水稻『i AT基因的克隆及其表达谱分析.科学通报，2004, 49(18): 1860-1869)。另外，植物激素类信号分子对WRKY基因的表达有诱导作用，植物体在受到病源物侵染时，会合成植物抗毒素和病程相关的PR蛋白，使植物获得系统抗性(SAR)。研究表 明，水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及其类似物等都与SAR密切相关。WRKY蛋白TDBA12 在病原菌侵染或SA处理后被诱导，TDBA12可识别烟草几丁质酶启动子中的激发子反应 元件(Yang P Z, Chen C H, Wang Z P, a/. A pathogen- and salicylic acid-induced WRKY DNA-binding activity recognizes the elicitor response element of tobacco class I chitinase gene promoter. P/a"/乂 1999, 18(2): 141~149) 。 Du等发现四个被病原菌侵染或SA诱导的受体 类蛋白激酶(RLK)可被SA处理后诱导的WRKY类蛋白识别，这四个激酶的N端有一个 信号序列、 一个胞外受体域和一个单跨膜域，C端有一个丝/苏氨酸激酶域，揭示WRKY 类蛋白在抗病信号转导中的作用(Du L Q, Chen Z X. Identification of genes encoding receptor- like protein kinases as possible targets of pathogen-and salicylic acid-induced WRKY DNA-binding proteins in Arabidopsis.>/， 2000， 24(6): 837 847 )。『/^:堪因对自身的表达有调节作用，v4^7 AT/S基因启动子中的W- box是负调控元 件，它可能抑制防卫反应中AtWRKY18的过表达，从而将此基因在植物生长过程中的有 害作用降到最小，但拟南芥WRKY转录因子不都是抑制子。AtWRKY6对其自身和 AtWRKY42的表达起抑制作用，用AtWRKY6的启动子驱动GUS报告基因在超表达的 CaMV35S:WRKY6原生质体中检测不到GUS活性，而在基因敲除的WRKY突变体中则发现 了报告基因的表达。综上所述，WRKY对基因转录的调节功能可总结如图l所示(高国庆、储成才等植 物WRKY转录因子家族研究进展，植物科学通报，2005， 22 (1): 11~18)。发明内容本发明的目的是提供一种与耐旱性相关的WRKY基因。本发明所提供的与耐旱性相关的WRKY基因，来源于水稻，编码下述蛋白质(i)或(ii):(i) 具有序列表中SEQIDNO: 1的氨基酸序列(ii) 在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有调控 植物耐旱性功能的由(i)衍生的蛋白质。序列表中的SEQIDNO: l氨基酸序列由674个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第 493-496位氨基酸残基为DNA结合结构域，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为 OsWRKY30。所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非该结构域中的氨基酸 残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。本发明来源于水稻的与耐旱性相关的WRKY基因，可具有下述核苷酸序列序列表 中SEQ ID NO: 2的DNA序列。 序列表中的SEQIDNO: 2由2025个碱基组成，其开放阅读框架为自5'端第1-2025 位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO: 1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5'端 第1477-1488位碱基编码DNA结合结构域，将具有该核苷酸序列的基因命名为OyFW iH^0。 含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均在本发明的保护范围之内。 扩增a^『i /a^ 中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐旱性的方法。本发明所提供的提高植物耐旱性的方法，是将本发明与耐旱性相关的WRKY基因(如 QyfF/ iiTJO或与该基因具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列)导入植物 组织、细胞或器官，植物耐旱性获得提高。在上述提高植物耐旱性的方法中，本发明与耐旱性相关的水稻WRKY基因(Oy『及尺K50) 既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90% 以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用 已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定 基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些 应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。 基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技 术人员熟知的。本发明与耐旱性相关的7K稻WRKY基因(<%『AATM)或其同源序列可通过植物表达 载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可 用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如 pBin系列载体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)、Gateway系列载体(如pH2GW7 等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA3301等)、per8、 pX6或其它衍生植物表达载体， 所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pUC系列载体或pBluescript系列载 体等。使用本发明与耐旱性相关的水稻WRKY基因(6^『7 《rJ0)或其同源序列构建植物表达 载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型 (ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子；所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒 (CAMV) 35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actinl启动子等；所述组织特异性表达 启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子 特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2Sl启动子(GenBank 号NM一118848.2， GI:30687489)和NapinA (GenBank号:M64633.1, GI:349405)启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子 上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植 物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以包 含ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整 个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也 可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加 工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物[新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、 潮霉素磷酸转移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标 记物等]或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTI1) 基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮 霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由 潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境 筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、 PCR或点杂交等分子检测手段 对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。其中，以pH2GW7 ( Invi加gen公司的GatewayTw vector载体)为出发载体，构建的含 有本发明与耐旱性相关的水稻WRKY基因的植物表达载体为pH2GW7-Oy^7 i:nO。携带有 本发明与耐旱性相关的7]C稻WRKY基因(Oy『/ /:K 0)或其同源序列的植物表达载体可通过 使用原生质体-化学介导法(C^+、 PEG)、 Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、 花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种 方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株； 所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。此外，通过将转化含有本发明与耐旱性相关的7jC稻WRKY基因(Oy『及ii:K^)或与所 述基因具有卯^以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养 后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁， 可使转基因植物的耐旱性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种 子繁殖。本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组 织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，
也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。本发明提供了一个与耐旱性相关的WRKY蛋白及其编码基因。实验证明，将本发明 的基因转化水稻可显著提高水稻对干旱胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没 有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐旱机制的研究，以及提高植物的耐 旱性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是未谷类作物)的耐 旱基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
图1是WRKY对基因转录的调节作用示意图。图2示意了 OsWRKY30在水稻中受ABA诱导的表达模式。图3是PCR检测OsWRKY30转基因T0代植株潮霉素磷酸转移酶基因的电泳图。图4是经干旱胁迫后的OsWRKY30转基因Tl代植株与野生型植株的照片。图5是OsWRKY30转基因Tl代植株耐旱苗百分比柱形图。图6是经干旱胁迫后的OsWRKY30转基因T2代植株与野生型植株的照片。图7是OsWRKY30转基因T2代植株耐旱苗百分比柱形图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》(Sambrook, J.， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3""d edition, 2001, NY， Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。实施例1、 OsWRKY30在水稻中受ABA诱导的表达模式ABA诱导，用100 |aM的ABA处理野生型水稻中花11 (Or少za S加'ra Z.)，分别在0、 1、 2、 6、 12、 24小时取材料，抽提RNA反转录，以5'-ATGCCGCAAATGGACACCT-3' 为正向引物、以5' -AACGCGAGGCTCCCGGATAG -3'为反向引物，水稻Actin内源参照， 进行PCR。结果l小时已有表达，随诱导时间的增加表达量增加，在12小时达到最大， 以后表达量下降(见图2)。实施例2、水稻与耐旱性相关Os『及Jn^ 基因的获得 离及功能研究检索NCBI数据库及文献，获得W7^Z 0的序列(Gene bank Accession NOAK065518)' 设计正向引物5， >CACCACAAAATGGACGGGACCAACAACCATGGA>3，和反向引物 5' > CATCTGAGGATGCTGCTTTGGCAA >3'，提取PEG6000处理的中花11水稻苗的 RNA，通过反转录得到cDNA, RT-PCR方法将该基因克隆出来，采用TOPO克隆的方法 导入pENTER-TOPO Vector,构成pENTER-TOPO- ay『及尺nO，通过CaCl2法转化大肠杆 菌(E. coli) TOP10菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基 中，37°C、 220 rpm的摇床中培养12—16小时，提取质粒，PCR和酶切法鉴定后，进行 序列测定分析。实施例3、与耐旱性相关的WRKY30转基因水稻的获得用农杆菌介导法将实施例2获得的与耐旱性C^ffi 〖K30基因转化水稻，具体方法如下1) 转化农杆菌通过LR反应将实施例2中构建的重组质粒pENTER-T0P0-0sff/ i030导入植物表达 载体pH2GW7 (Invitrogen公司的GatewayTW vector载体)中，LR反应体系为0.5 pi LR酶， 1 ^ 5X缓冲液，2 pENTER-TOPO-Os『i^n0, 1.5 (il pH2GW7，补水5 pi, LR反应条 件为25t水浴1到3个小时。然后通过热激法将上述重组载体转化大肠杆菌(E.cdi)TOP10。 用 5，-CACCACAAAATGGACGGGACCAACAACCATGGA-3，为正向引物，5，-CATCTGAGGATGCTGCTTTGGCAA-3，为反向引物，PCR筛选阳性克隆，挑选阳性单菌 落加入到5 mL含50 mg/L的壮观霉素的LB液体培养基中，在37°C 、 220 rpm下培养12 一16小时，提取质粒，用限制性内切酶EcorRV进行酶切鉴定，经酶切获得了 1300 bp和 800 bp的酶切产物，与预期结果相符，鉴定结果表明获得了含有Oyff狀nO的重组植物表 达载体，命名为pH2GW7-Oy『i /Q30，随后将上述重组载体pH2GW7-OsfJ^fiT卯转化农 杆菌AGL0菌株(中国科学院遗传所赠送)。用正向引物 5'-CACCACAAAATGGACGGGACCAACAACCATGGA隱3， 禾Q 反 向 弓| 物 5'-TTACATCTGAGGATGCTGCTTTGGCAA-3， PCR进行阳性重组农杆菌的鉴定，获得 AGL0 (pH2GW7-tty^ iT卯)重组农杆菌株。2) 侵染水稻愈伤组织挑取步骤1)获得的阳性重组农杆菌的单菌落接种于含壮观霉素50mg/L和利福平 50mg/L的20mL YEB液体培养基中，在28'C、 150rpm下振荡培养2-3天，再于4°C 、5000rpm 离心3分钟，去上清，将菌体沉淀重悬于含0.1mmol/L乙酰丁香酮的AA培养基 (Co(N03)2 '6H20 0.15mg/L， CaCl2 110mg/L， MgS04 I22mg/L， KI 3.75mg/L， NaH2P04 '1120 150mg/L, Na2-EDTA0.01mM, FeS04 .7H20 139mg/L， KC1 2.95g/L， MnS04 4H20 84.5mg/L， ZnS04'7H20 6.25mg/L, H3B03 5mg/L， Gly 37.5mg/L, CuS04 0.005mg/L, Na2Mo04'2H20 1.25mg/L，盐酸硫胺素VB, 5mg/L,烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇VB6 5mg/L，肌酸0.1g/L， 酪蛋白水解物0.3g/L, L-Gln87.6mg/L， L-Asp 26.6mg/L，蔗糖20g/L)中，在28。C下避光 振荡培养l一2小时至OD6(X)=0.6—0.9。挑选按常规植物组织培养方法获得的水稻中花11 的生长状态良好、颗粒状愈伤组织浸入上述转化有Oy『i^:Z^的重组农杆菌培养液中摇动 20分钟后，静置30分钟，取出用无菌滤纸吸千多余菌液，将愈伤组织接种于N6共培养基(N6培养基+10g/L葡萄糖+lmg/L乙酰丁香酮+2,4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D) 2mg/L)上 培养，其中N6基本培养基的配方为(NH4)2S04 0.46g/L， KN03 2.83g/L， CaCl2 0.2g/L， MgSO40.092g/L， KH2P04 0.4g/L， Na2-EDTA0.15g/L， FeS04 '7H20 0.11g/L， MnS04 '41120 0.44g/L， ZnS04 7H20 0.17g/L, H3B03 0.14g/L， CoCl2 . 6H20 0.0005g/L， CuS04 . 5H20 0.0005g/L， Na2Mo04 2H20 0.005g/L，盐酸硫胺素VB! 0.01g/L，烟酸O.OOlg/L,盐酸吡 哆醇VB6 0.001 g/L,肌酸O.lg/L,酪蛋白水解物0.3g/L, L-Pro 0.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂 10g/L， pH5.8。 2-3天后，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次， 直到水中不见丝状菌体，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中浸泡30-60分钟，最后再 用无菌水冲洗l遍，置于无菌滤纸上凉干，最后转入Ns共培养基中共培养。 3)阳性转基因水稻的获得将侵染后的水稻愈伤组织于N6共培养基中共培养3-5天后，转至含30mg/L潮霉素和 400mg/L头饱霉素的N6固体培养基(N6大量元素+B5微量元素+B5有机成分+300mg/L水 解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，pH 5.8)上筛选3周，再转入含50mg/L 潮霉素和200mg/L头饱霉素的N6固体培养基上筛选4周，随后将抗性愈伤组织转入预分 化培养基(N6培养基+lmg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤+5mg/L脱落酸)，光照培养3 周，再转入分化培养基(N6培养基十lrng/L奈乙酸+2mg/L6-苄基氨基嘌呤)上进行分化， 将生长出的再生植株在壮苗培养基(1/2 MS无机盐+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上 进行生根培养后移至温室中，在28'C、 15小时/天的光照下培养个月后取植株叶片，按 常规方法提取总DNA，以5，-ACT CAC CGC GAC GTC TGT -3，和5' -TTC CTT TGC CCT CGGACG-3，为正向和反向引物，PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得约1100bp 大小DNA片段的为阳性转基因植株，检测结果如图3所示，l-8为转基因苗，M是DNA Marker ,WT是野生型。表明用上述方法获得了转化有Os『i iH30的转基因水稻。
实施例4、 OsWRKY30转基因水稻Tl代植株的耐旱性鉴定收获TO代OsWRKY30转基因水稻种子，选取10个不同的转基因株系，每个株系选 取100粒饱满的种子进行浸种，发芽出苗后，用25mg/L的潮霉素进行筛选5天，选取具 有单位点插入的株系，经过筛选得到7个具有单位点插入的阳性转基因株系。将经过潮霉素筛选后的具有单位点插入的阳性转基因水稻苗种入含水量在55%—65% 的营养土中，从处理即日起不再浇水，直至野生型CK植株叶片干枯发黄、萎蔫、死亡， 根系变细，开始发褐，OsWRKY30转基因植株仍然正常生长，苗叶片仍然为绿色，且根系 受损程度较小。OsWRKY30 Tl代转基因株系经千旱处理后的苗如图4所示，每张照片中 左边的三株苗为野生型植株，右边的三株苗为OsWRKY30转基因Tl代植株。除去胁迫条 件，复水使苗恢复正常生长，2周后统计成活苗数，计算各株系的耐旱苗百分比，以野生 型植株为对照(CK), OsWRKY30转基因水稻苗的耐旱性明显提高(见图5)。实施例5、 OsWRKY30转基因水稻T2代植株的耐旱性鉴定收获Tl代OsWRKY30转基因水稻种子，对Tl代进行干旱筛选后的5个不同的具有 单位点插入的转基因株系进行T2代植株耐旱鉴定，每个株系选取3个不同的T2代植株进 行筛选，每个植株选取100粒饱满的种子进行浸种，发芽出苗后，用25mg/L的潮霉素进 行筛选5天，选取纯合体植株进行耐旱筛选。耐旱筛选条件和Tl代时进行的耐旱筛选条 件一样，将经过潮霉素筛选后的阳性转基因水稻苗种入含水量在55°/。一65%的营养土中， 从处理即日起不再浇水，直到对照未转基因水稻干枯死亡为止。OsWRKY30 T2代转基因 株系经干旱处理后的苗如图6所示，每张照片中左边的三株苗为野生型植株，右边的三株 苗为OsWRKY30转基因T2代植株。除去胁迫条件，复水使苗恢复正常生长，2周后统计 成活苗数，计算各株系3个植株的耐旱苗百分比，OsWRKY30转基因植株的耐旱性比未转 基因植株(CK)的耐旱性有所提高(见图7)。序列表(SEQUENCE LISTING)<110>北京未名凯拓农业生物技术有限公司<120> —个与耐旱相关的水稻WRKY基因的克隆及应用<130> JSP070141<160> 2< 170> Patentln version 3.1<210〉 1 <211> 674 <212> PRT<213> 水稻中花11 (丄.) <400> 1Met Asp Gly Thr Asn Asn His Gly Ala Leu Met Asp Asp Trp Met Leu15 10 15Pro Ser Pro Ser Pro Arg Thr Leu Met Ser Ser Phe Leu Asn Glu Glu20 25 30Phe Ser Ser Gly Pro Phe Ser Asp lie Phe Cys Asp Asn Gly Ser Asn35 40 45Lys His Gin Asp Gly Leu Gly Lys Ser Lys Ala Phe lie Asp Ser Ser50 55 60Arg Glu Glu Thr Ala Gin Leu Ala Lys Lys Phe Glu Ser Asn Leu Phe 65 70 75 80Gly Ala Asn Gin Lys Ser Ser Ser Asn Gly Cys Leu Ser Glu Arg Met85 90 95Ala Ala Arg Thr Gly Phe Gly Val Leu Lys lie Asp Thr Ser Arg Val100 105 110Gly Tyr Ser Thr Pro lie Arg Ser Pro Val Thr lie Pro Pro Gly Val 115 120 125 Ser Pro Arg Glu Leu Leu Glu Ser Pro Val130 135 Ala Gin Pro Ser Pro Thr Thr Gly !Lys Leu 145 150 Asn Val Lys Pro Ser 工leCysPhe 180 AlaSer 165 PheProLys Lys Thr 170Asp Arg Val Phe Phe Phe Gin Pro lie Leu Gly Ser Lys185Glu Lys Gly Phe Ser Val Asn His 200Glu Leu SerPhe Leu Pro Asn Ala lie 140Pro Phe Leu Met His Ser155 160Glu Asp Glu Thr Arcf HisArg 175 ProThrPro 190Asn Gin ProSerPro Val 195Val Thr Asp Asn His Gin 210 215Ala Lys Asp Phe Thr Ser Ala Thr lie Val Lys Pro Lys ThrAla 225Asp Ser Met LeuGlu Glu Asn Ala 260lie Thr Pro AlaThr 230 AsnAspAsp 245Thr Asn LysLeu Gin 220 Val Lys 235Ser ProGin 205Ser Ser Ser ThrAla AsnAsp 270 GlyAsp 255 LeuSei: 240 GinAsp His Pro 250Asn Glu Glu Tyr Ser Ser 265Glu Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gin LyslieThr Pro ^ 一275 280Gin Val Lys Asn Ser Glu His Pro Arg Ser290 295Thr Asn Cys Ala Val Lys Lys Val Glu Arg Ser Gin Asp Gly Gin 305 310Thr Glu lie Val Tyr Lys Gly SerTyr 325Asn Arg Arg Pro Asn Val Pro Phe 340Glu Lys Phe GlyAsp His Ser355Ser 360Tyr Tyr 300 Ser Gin 315His Asn His Pro330Ser His Phe Asn 345Lys Ser Gly GinTyr 285Lys Cys Thr Phelie 320 Ser!Leu Pro Pro 335 ArgAspAla365L eu Arg Asp 350Thr Ala Thr Ser Trp Glu Asn Ala Ala Asn Gly370 3"75 Val Leu Thr Lys Leu Ser Ala Ser 385 390 Lys Ser Val Met Asp LysGin Glu匕Asp 405Ser Asn Glu Glu Asp Asp Arg Val 420Ala Asn Asp AspHis Leu Gin Asp Val Gly Ser Glu 380Leu Thr Thr Thr Glu His Ala Glu 395 400 Ala Val Asp lie Ser Ser Thr Leu 410Thr His Arg AlaProThr 415 Ser!LeuGly Phe Asp 435Asp Val Tyr Ala Ala Thr 450Ala Val Ala Ser Arg 465Thr Ser GluTyr 440Ser Thr Ser Thr 455lie Arg Glu Pro425Val Glu His !LysValAla 470工le Leu AspGly Gin Lys Val 500Cys Thr His Pro Gly Cys Ser 515His Asp Leu Lys Ser Val 530Glu Val Pro Ala Ala 545Ala Ala ProAsp Gly 490 Pro Asn 505 Val Arg Lys 520lie Thr Thr Tyr 535Asn Ser Gly His!Leu 430Arg Arg Lys Met 445Asn Ala lie Asp lie Gly 楊Arg Val Val Val Gin 475Tyr Arg Trp ArgAsp 工le Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys 485 490 495Val Lys Gly Asn Pro Asn Pro Arg Ser Tyr TyrThr 480 TyrLysGinArg 550Thr Asn GlyAla Gin Gly Gly 580Ala Gly His Arg Pro Ala Glu 595Ala 565Gly Gly Gly Ser Leu Ala Gin Phe GlyTyr 510His Val Glu Arg Ser Ser 525Glu Gly Lys His Asn His 540Pro Ser Ser Gly Ser Ala 555 560 His Arg Arg Pro Glu ProLeu Leu His Arcr Arq Pro Glu 570 575 Leu Ala Gin Phe Gly Tyr Gly Ser 585 590 Gin Phe Gly Ala Ala Ala Ala Gly Phe 600 605Ser Phe Gly Met Leu Pro Arg Ser lie Ala Thr Pro Ala Pro Ser Pro610 615 620Ala lie Ala Val Pro Ala Met Gin Gly Tyr Pro Gly Leu Val Leu Pro 625 630 635 640Arg Gly Glu Met Lys Val Asn Leu Leu Pro Gin Ser Gly Asn Ala Gly645 650 655Ala Ala Ala Ser Gin Gin Leu Met Gly Arg Leu Pro Lys Gin His Pro 660 665 670Gin Met<210> 2<211> 2025<212> DNA<213> 水稻中花11 ()<400> 2atggacgggatggsgcactg3tggscgaittggatgcttccctc3cccsgt60CC33g33C3Ctcatgtcgagtttcttgascgctccggtcccttttcagac120attttctgtgst33tggc3gcsggaitggscc333gctttc1803tcgsttc33gccgggssg33sctgctcagagtttgaatc333CCttttt240ggtgccsacc3gaLataLtcasLgctc333tggctgtctgtcagagaggatggctgcaaggaca300ggttttggtgtcctgsasattgatacatctcgtgtcggttattctscsccgattcggtct360ccggtgacgatcccgcccggtgtgsgtccs3gggs3cttcttgagtcgccggtttttctt420ccgsacgccattgC3C33CCttCtCCt3CCsctggc333Ctgccstttttgatgcatsgt480cstcgstccccacgccatgatcgtgtsttc540ttctttcsscccattttgggccsscttgtccagttgcagaigaisgggtttc600sgtgtt33tcgccttcagtgacggat33tcaccaggagctcagtcttcag660tctagctcasctgc3gcc33ggatttcacttC3gC33Ct3ttgttaa2LCC720gattccstgttagacaatgatgatcacccttcccctgc33agagaatgca780ttcttcsgaicCtg6LtCStt3cccctgctgsggstgg3t3t840
aagaacagtgsgcstccc3g33gCt3Ct3C900S33tgC3Ctttcacgaattgcgctgtcssgasggtggsgcgttctc3sgstggccsaata960ttCtC3C33tcaccctttgccgccttcca3ccgccgacca1020aatgttcctttCtC3C3Cttcaatgatctgactctgagaaistttggttcc108033gtctggtc3ggccscsgc33Cttcatggcaaatggacacctccaagat1140gtcggtagtg3sgttctgac3333CtgtCtgcttctcttscgaLcai3C3g31200tggscasacsag33gctgtggst3tctc3tcgscgctctccaatgaagag1260gatgatsgggtsscgcstcgtgccccgctttctctgggctttgatgcgaacgatgactat1320gttgaacacagatggatgtttatgccgct3ctsgcsctsgC3CC33CgCC1380atcgacataggsgctgtggcgtcaagsgctatccgggagcctcgcgttgttgttcagacc14403C33gtgsggttg3cstccttg3tg3tggttsccgttggcgc3sgtstgg1500sccceiaistcctacaagtgcactc3tccgggttgctcggtg1560cgc33gcstgtggsgcgstcatcgcatgatctgaaatccgtcatcscgscgtatgaagga162033gC3C33CCatgaagttcc3gctgcc3ggaacsgtggccacccaagctcsggctcsgcc1680gctgcaccsc3ggctscc3atggtcttcttcaccggagacctgaaccggc1740ggtggtggt3gccttgctc3gtttggctatggctcagctggtcacagaccsgcagagcag1800tttggtgcagcsgcsgctggtttctcctttgge13tgctgcctcgtagcaittgcaactccg1860gcgccgtctccggcgatcgccgtgccggcgstgcaggggtacccagggcttgtgctgccg19203g3ggtg3g3cttgctgccscagtctgggaatgctggtgcsgcsgctsgc1980csgcagctgstgggcsggttgccaaagcagcatcctcaga202权利要求
1.一种提高植物耐旱性的方法，是将耐旱性相关的WRKY基因导入植物组织、细胞或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐旱性提高的转基因植物，所述耐旱性相关的WRKY基因编码如下蛋白质(i)或(ii)(i)具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸序列；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有提高植物耐旱性功能的由(i)衍生的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于所述耐旱性相关的WRKY基因具有序列表中SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
3. 根据权利要求1或2所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于所述耐旱性相关 的WRKY基因通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官。
4. 根据权利要求3所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于用于构建所述植物 表达载体的出发载体是一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载 体或可用于植物微弹轰击的载体，或者是可在原核生物中复制的载体。
5. 根据权利要求4所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于所述可用于根瘤农 杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体为pBin系 列载体、pBI系列载体、Gateway系列载体、pCAMBIA系列载体、per8或pX6; 所述可在原核生物中复制的载体为pUC系列载体或pBluescript系列载体。
6. 根据权利要求5所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于所述出发载体是 pH2GW7。
7. 根据权利要求3所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于用所述耐旱性相关 的WRKY基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上一种增强型、 组成型、组织特异型或诱导型启动子。
8. 根据权利要求3所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于用戶，耐旱性相关 的WRKY基因构建植物表达载体时添加翻译增强子和/或转录增强子。
9. 根据权利要求3所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于在所述植物表达载体中加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因， 或者加入具有抗性的抗生素标记物或抗化学试剂标记基因。
10. 根据权利要求1所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于所述植物细胞、组织或器官来源于双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物包括烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯和牧草；所述单子叶植物包括水稻、玉米、 小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草。
全文摘要
本发明所提供了一种来源于水稻的与耐旱性相关的WRKY蛋白及其编码基因，将该基因或与之同源的编码相同功能蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐旱性提高的转基因植物。实验证明，将本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对干旱胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐旱机制的研究，以及提高植物的耐旱性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐旱基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/29GK101130785SQ20071011968
公开日2008年2月27日 申请日期2007年7月30日 优先权日2007年7月30日
发明者刘春霞, 吴艳斌, 勉 夏, 孟秀萍, 王喜萍, 莉 辛, 黄晓翠 申请人:北京未名凯拓农业生物技术有限公司