专利名称：一种生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法
技术领域：
本发明属于环境修复技术，特别涉及一种生物质强化石油污染土壤的原位生 物修复方法。
背景技术：
石油污染土壤的生物修复技术根据具体操作以及菌种的来源可以分为自然 衰减法、生物剌激法和生物强化法。自然衰减和生物刺激对污染物降解效率低， 且易产生迁移性能更强的中间代谢产物，因此应用越来越少。通过微生物操作筛 选能够高效降解石油烃污染物的微生物，并作为外源高效菌种添加到污染土壤 中，降解转化石油烃污染物的方法，即为生物强化法。
理论上生物强化修复技术可以通过添加外来高效石油烃降解菌来实现石油 烃的高效去除。但由于石油烃组成复杂，毒性强，且其生物可利用度较低等原因， 使得原位生物强化修复的效率低。同时，外加菌种受生态系统中环境因素的复杂 性和波动性的冲击，接种微生物生物数量和活性迅速降低至无法达到预期目标； 换言之，外源微生物的生存能力、活性和迁移能力与环境因素之间的关系直接决 定着生物强化修复的治理效果。制约生物强化修复技术发展的主要生态原因有生 物因素和非生物因素两种。多数非生物因素可通过工程措施，如调控土壤含水量、 .PH，添加有机碳源和无机营养物等进行调控；在生物强化修复过程中，受土壤多 相复杂结构的限制，外源微生物在土壤中迁移困难，造成微生物无法与污染物有 效接触并摄取污染物，微生物对污染物摄取困难是原位生物修复的一个瓶颈。
Drake EN公开了一种石油烃污染治理过程中的营养物质可控释放技术，其营 养物质的释放速率等于满足石油烃降解菌的生长底物的消耗速率(EP748304-A; W09508523-A; W09508523-Al)，通过该技术可以保证石油烃降解菌在污染土壤中 的持续积累，抵抗污染环境中由于营养限制造成的微生物活性不足。但该方法造 价较高，而且过程复杂。同时，有研究利用化学合成表面活性剂来活化污染土壤 中的石油烃，促进微生物对石油烃的摄取，但化学合成表面活性剂破坏土壤团粒
结构，容易对环境造成二次污染。
发明内容
本发明的目的是针对制约原位生物修复的主要生态原因而提供一种利用生 物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法。其特征在于
1. 通过生物质在土壤中转化形成的中间代谢产物，可以促进石油烃降解菌在 污染土壤中的快速生长；所述中间代谢产物是生物质经过生物质降解菌转化得到 的部分糖类物质。利用糖类物质可以促进石油烃降解复合菌剂的生长， 一是积累 足够的微生物活性，另外可以产生生物表面活性剂活化土壤中的污染物，从而克 服由于非生物因素造成的制约原位生物修复的生态原因。这也是石油烃降解复合 菌剂中含有可高效产生生物表面活性剂菌株的原因。
2. 向污染土壤中添加石油烃降解复合菌剂，该石油烃降解复合菌剂中含有高 效产生生物表面活性剂的菌属，糖类物质促进该类菌属生长的同时，产生大量的 生物表面活性剂，活化污染土壤中的石油烃污染物，促进微生物对石油烃污染物 的接触以及摄取，抵抗由于生物因素造成的制约原位生物修复的生态原因。
该方法实施步骤包括
1) 向生物质中施加生物质降解菌；
2) 在污染土壤表面均匀施洒生物质；
3) 机械翻耕，翻耕深度为25 50cm，使生物质与污染土壤充分混匀；
4) 向污染土壤中施加水分，保持土壤含水量为15 25%左右；
5) 在机械翻耕后20 40天，施加石油烃降解复合菌剂进行石油烃的生物降
解；
6) 当污染土壤石油烃浓度低于1.0%时，种植植物进一步进行原位生物修复。 所述生物质主要包括农业生产产生的废弃秸秆以及含有木质素和纤维素的
生物质的木屑，其生物质添加量占污染土壤体积的3% 20%。
所述生物质降解菌由真菌和细菌构成。细菌为具有纤维素降解能力的细菌-如热厌氧杆菌属(r/ er膨朋serofe"er)(胡国全等，2004);生孢噬纤维菌 (5^rocWoMs卵)(于珊珊等，2006);假单胞菌属(/^ewofe膨/ as印.)(JoC等，2004)等，细菌添加量为10S 1(TCFU/Kg生物质；真菌为白腐真菌、木霉属、曲 霉属等，如来自白腐真菌的黄孢原毛平革菌(外朋eroc力犯te c力2TS0砂0T7'鹏)， 来自木霉属的绿色木霉(7Wc/ c^6Lrm3 w'77'ofe)、里氏木霉(7Wc力c)ofer鹏reeae力、 康氏木霉(r—ric力oc/erffls Ao/7//^h')等，来自曲霉属的灰绿曲霉U印ei^777〃s ^ZswciAS)、 黑曲霉C^jOerg7'2〗ws ;i/ger)、米曲霉G45peiX27〗i/s terrew51)等(上 述菌种均可购自中国普通微生物菌种保藏中心)。添加量为20 100mgbiomass/Kg 生物质。
所述石油烃降解复合菌剂为至少含具有石油烃降解能力的细菌或真菌。 所述具有石油经降解能力的细菌选自假单胞菌属(NewcombeDA， 1999)、 红球菌属(Yu B， 2006)、微球菌属(Torres LG, 2005)、肠杆菌属(Katsivela E， 2005)、棒状杆菌属(Rahman KSM， 2002)、黄质菌属(Rahman KSM， 2002) 和芽孢杆菌属(DasK， 2007)(以上相关菌种均可购于中国普通微生物菌种保藏 中心)。
所述具有石油烃降解能力的真菌为黄孢原毛平革菌(/^朋erocAade c力JT6"os，oz7'腦)和刺孢小克银汉霉菌(Oy/7mV^Ag膨Ws)中的一种(以上菌种 均可购自中国普通微生物菌种保藏中心购得)。
所述石油烃降解复合菌剂至少含有一种可以高效产生生物表面活性剂的微 生物，该微生物来源于假单胞菌属(Raza ZA， 2007; Das K， 2007)、红球菌属 (Pizzul L， 2006)、微球菌属(Das M, 1998)、黄质菌属(Bodour AA， 2004)、 肠杆菌属(Haba E， 2003)、棒状杆菌属(Crosman JT, 2002)和芽孢杆菌(Das K， 2007〉(以上相关菌种均可从中国普通微生物菌种保藏中心获得)。
所述生物质降解菌，细菌添加量优选为108 10|2个/&生物质，真菌添加量 优选为20 100mg/Kg生物质;所述石油烃降解复合菌剂中细菌施加量为108 10'2 个/m，井地，真菌施加量为20 150mg/m，井地。
本发明的有益效果是所使用的添加剂为廉价的生物质类物质，主要包括农 业生产废弃的秸秆等以及含有木质素和纤维素的生物质，如木屑等。生物质添加 后，可以作为石油烃降解菌生长的载体促进微生物的快速积累。同时利用生物质
在土壤中转化形成的少量糖类物质，可以作为石油烃降解菌的优先碳源，进一歩
促进石油烃降解复合菌剂的生物积累；石油降解复合菌剂中含有的高效生物表面 活性剂产生菌，可以产生大量的生物表面活性剂，活化土壤中的污染物，促进微 生物对污染物的摄取。本方法可以有效克服制约原位生物修复技术的生态原因， 促进石油烃的原位生物修复。本方法在大面积的石油烃污染土壤的原位生物修复 过程中具有很好的应用前景。
图1为添加5X麦秸40h后污染土壤中的细菌生物量。 图2为添加5%麦秸40h后污染土壤中的真菌生物量。 图3为添加5%麦秸40h后污染土壤中的石油烃降解率。
具体实施例方式
以下通过实施例进一步描述本发明的应用效果，但不限制本发明。
实施例
实施例中石油污染土壤含油3. 75%。实施过程如下
1) 首先将麦秸与预培养的黄孢原毛平革菌和铜绿假单胞菌混合均匀，黄孢 原毛平革菌的添加量为50mg/Kg麦秸，铜绿假单胞菌添加量为10"'CFU/Kg麦秸；
2) 石油污染土壤盛在盆中，深约25cni。将混有黄孢原毛平革菌的麦秸与石 油污染土壤充分混匀，麦秸添加量为土壤体积的5%;保持含水量15 25% 30 天；
3) 施加由阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌以及刺孢小克银汉霉菌组成的石油烃 降解复合菌剂，其中铜绿假单胞菌为高效产生物表面活性剂菌种。细菌添加量为 1(TCFU/W土壤，真菌为50mg千重/V土壤。
在实施例中，生物质降解菌由真菌黄孢原貌平革菌和铜绿假单胞菌组成。石
油烃降解菌为细菌和真菌组成的微生物菌剂。
实施例中的生物质为农业生产中废弃的小麦麦秸，添加量为5%。 实施例中，细菌利用LB培养基30°C， 150rpm振荡培养24小时，收集培养物。
真菌利用马铃薯液体培养基振荡培养，30"C， 150rpm振荡培养3天，收集培养物备用。
实施例中细菌生物量通过平板计数法测量，真菌生物量以麦角固醇的含量表
征(Ipsilantis I， 2007)。
本实施例的实验结果如图1、 2、 3所示。
本发明己参照较优实施方案作了描述，熟悉上述详细描述的本领域的技术人 员可以作出许多变动和替换，其均包含在本发明的范围和实质内容中。
权利要求
1.一种利用生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法，其特征在于，该方法包括(1)通过生物质在土壤中转化形成的中间代谢产物，可以促进石油烃降解复合菌剂在污染土壤中的快速生长，克服由于非生物因素造成的制约原位生物修复的生态原因；(2)在污染土壤中添加石油烃降解复合菌剂，该石油降解复合菌剂中含有高效产生生物表面活性剂的菌属，同时(1)中的中间代谢产物是生物质经过生物质降解菌转化得到的部分糖类物质，利用糖类物质可以促进石油烃降解复合菌剂的生长，复合菌剂中所含的高效产生生物表面活性剂的微生物在生长的同时，产生大量的生物表面活性剂，活化污染土壤中的石油烃污染物，促进微生物对石油烃污染物的摄取，抵抗由于生物因素造成的制约原位生物修复的生态原因。
2. 根据权利要求1所述利用生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法，其特征在于，该方法实施步骤包括1) 向生物质中施加生物质降解菌；2) 在污染土壤表面均匀施洒生物质；3) 机械翻耕，使生物质与污染土壤充分混匀；4) 向污染土壤中施加水分，保持土壤含水量为15 25%左右；5) 在机械翻耕后20 40天，施加石油烃降解复合菌剂对石油烃进行生物转化；6) 当污染土壤石油烃浓度低于1. 0%时，种植植物进一步进行原位生物倏复。
3. 根据权利要求1所述利用生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法， 其特征在于，所述的生物质降解菌由细菌和真菌组成，细菌为具有纤维素降解能 力的细菌热厌氧杆菌属(77 e27Z70S77aero^"er)、 生孢噬纤维菌 (5^orocj^opA3^3)、假单胞菌属(/^e"ob历o/ as )，细菌添加量为105 10")CFU/Kg生物质；真菌为白腐真菌、木霉属或曲霉属，来自白腐真菌的黄孢原 毛平革菌(尸力朋e/^c力a"e cAr"c^/ Qrj'鹏)；来自木霉属的绿色木霉(7rj'c力oflfe77Z7s Kin'ofe)、里氏木雾(7>ic/ 。ofezm3 reeaej')、康氏木雾(7>\z'c/ 。Gfe77a3 A(9/7i/7^/j'); 来自曲霉属的灰绿曲霉(Jsperp'Wt/s ^/auc"s)、黑曲霉(y4s/ ei^j'j>er)、 米曲霉(Aspe/^7'"〃s tarrews)，添加量为20 100mgbiomass/Kg生物质；上述 菌种均可购自中国普通微生物菌种保藏中心。
4. 根据权利要求1所述利用生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法， 其特征在于，所述生物质主要包括农业生产产生的废弃秸秆以及含有木质素和纤 维素的生物质的木屑，其生物质添加量占污染土壤体积的3% 20%。
5. 根据权利要求1所述利用生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法， 其特征在于，所述石油烃降解复合菌剂为至少含具有石油烃降解能力的细菌或真 菌。
6. 根据权利要求5所述利用生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法， 其特征在于，所述具有石油烃降解能力的细菌选自假单胞菌属(NewcombeDA， 1999)、红球菌属(YuB， 2006)、微球菌属(Torres LG， 2005)、肠杆菌属(Katsivela E， 2005)、棒状杆菌属(Rahman KSM， 2002)、黄质菌属(Rahman KSM， 2002) 和芽孢杆菌属(DasK， 2007)，以上相关菌种均可购于中国普通微生物菌种保藏 中心。
7. 根据权利要求5所述利用生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法， 其特征在于，所述具有石油烃降解能力的真菌为黄孢原毛平革菌(州a/^7Y^A3e" C力7TS0邵02^//^购自中国普通微生物菌种保藏中心)和刺孢小克银汉霉菌(Cunninghamella) f实验室从中原油田石油污染土壤中筛选得到)中的一种。
8. 根据权利要求1所述利用生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法， 其特征在于，所述石油烃降解复合菌剂至少含有一种可以高效产生生物表面活性 剂的微生物，该微生物来源于假单胞菌属(Raza ZA， 2007; Das K， 2007)、红 球菌属(PizzulL， 2006)、微球菌属(DasM， 1998)、黄质菌属(Bodour AA， 2004)、 肠杆菌属(Haba E， 2003)、棒状杆菌属(Crosman JT， 2002)和芽孢杆菌(Das K, 2007)(以上相关菌种均可从中国普通微生物菌种保藏中心获得)。
9. 根据权利要求1所述利用生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法，其特征在于，所述生物质降解菌，细菌添加量为108 1012个/&生物质，真菌添 加量为20 100mg/Kg生物质;所述石油烃降解复合菌剂中细菌施加量为108 1012 个/m，井地，真菌施加量为20 150mg/V耕地。
10. 按照权利要求1所述的一种生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方 法，其特征在于所述种植植物根据地域不同有所区别，但至少是苜蓿、小麦、 稻谷中的一种。
全文摘要
本发明公开了属于环境修复技术的一种生物质强化石油污染土壤的原位生物修复方法。该方法利用添加了生物质降解菌的生物质来促进污染土壤中生物质的转化。利用生物质在土壤中转化的中间产物作为石油烃降解复合菌剂的优先碳源，促进石油烃降解复合菌剂的生物积累；同时施加的石油烃降解复合菌剂中含有可高效产生生物表面活性剂的菌，该菌在生长的同时产生大量的生物表面活性剂，活化污染土壤中的石油烃污染物，提高其生物可利用度，促进了石油烃降解复合菌剂对污染物的生物转化效率。生物质在土壤中的转化产物腐殖质又可以改善土壤的团粒结构、增加土壤的肥力，使得污染土壤得以修复。方法简便易行，便于操作，易于推广。
文档编号C12N1/14GK101104177SQ200710119860
公开日2008年1月16日 申请日期2007年8月1日 优先权日2007年8月1日
发明者铮 刘, 坤 张, 张敏莲, 徐圆圆, 花秀夫 申请人:中国石油化工股份有限公司;清华大学