专利名称：牛肠道病毒中国分离株及其感染性cDNA克隆的构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及牛肠道病毒株及其感染性cDNA克隆，尤其涉及牛肠道病毒中国分离株，本发明还涉及该牛肠道病毒中国分离株的感染性cDNA克隆的构建及其应用，属于牛肠道病毒领域。
背景技术：
牛肠道病毒(Bovine Enterovirus, BEV)是小RNA病毒科肠道病毒属的成员。病毒粒子呈球形，二十面体，无囊膜，完整病毒粒子直径约为25 30nm。基因组是单股正链RNA，约由7500个核苷酸(nt)组成，可直接作为mRNA，编码并翻译出一个多聚蛋白，然后经过一系列降解，产生4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和7种非结蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。BEV的衣壳是二十面体，病毒粒子由四种结构蛋白(VP1，VP2，VP3，VP4)组成的60个不对称原粒和单股正链RNA基因组构成。早期的研究将BEV分为两个血清型，即BEV-I和BEV-2 ;后来随着分子生物学的发展，2006年Roland Zell等人对目前已经分离的牛肠道病毒进行系统的基因序列比较分析，又将牛肠道病毒分为A和B两个族，即BEV-A和BEV-B,在BEV-A和BEV-B之内又分别包含2个和3个基因型。1988年Earle等首次发表了BEV的全基因组序列，目前登录在GenBank数据库中的全基因组序列已有12条。1993年，Smyth等获得了 BEV粒子的晶体,并且展示了它的三维立体结构。1999年,McCarthy F M等构建了 BEV的感染性cDNA克隆。肠道病毒是脊椎动物肠道中原有的栖居者，牛肠道病毒可以从患肠道疾病、肺炎及呼吸系统疾病和生殖障碍疾病的病牛分泌物或排泄物中分离获得，也可以从正常牛的粪便样品中分离，还可以从牛粪便污染的环境或水体中分离获得。牛肠道病毒的这种高分离率使得其具有重要的研究价值首先，尽管在试验条件下牛肠道病毒单独感染一般不会引起临床疾病，但是这种病毒是否具有协同致病作用还有待进一步研究；其次，牛肠道病毒的检出可以作为水体被牛排泄物污染的指标；第三，由于牛肠道病毒具有体外高滴度生长和耐强酸强碱的特性，所以病毒可以作为疫苗的载体；第四，BEV具有融瘤作用，Sedmak等人已经在小鼠身上发现BEV-I能够成功减少肿瘤的数量(Sedmak et al. 1972)，所以该病毒具有用于人类癌症治疗的潜力。1959年Moll和Davis首次分离到BEV，随后其它国家也相继有BEV的分离报道，但目前牛肠道病毒还未在中国获得分离。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株牛肠道病毒中国分离株；本发明的目的之二是提供所述牛肠道病毒中国分离株的全长感染性cDNA克隆及其所拯救的病毒；本发明目的之三是将所述的牛肠道病毒中国分离株应用于预防、治疗或检测由牛肠道病毒所致疾病的药物或试剂；本发明目的之四是将所述的牛肠道病毒中国分离株的全长感染性cDNA克隆及其所拯救的病毒应用于预防、治疗或检测由牛肠道病毒所致疾病的药物或试剂；本发明是通过以下技术方案来实现上述的目的本发明应用MA104细胞在牛腹泻粪便样品中分离出2株能够在MA104细胞上稳定产生CPE的牛肠道病毒，命名为BHM26和BJ50。本发明将BHM26提交到专利认可的机构保藏，其微生物保藏号是=CGMCC No. 4782;分类命名牛肠道病毒(BovineEnterovirus);保藏时间是2011年4月15日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明所分离的BHM26株和BJ50株病毒在有MgCl2存在的时候对热稳定，在pH值为3 10的环境中稳定存在，能够耐受氯仿等脂溶剂的处理。用感染病毒的单层细胞制备超薄切片，透射电子显微镜进行观察，细胞浆中可见结晶状排列的病毒粒子，单一病毒粒子 直径约25 30nm，无囊膜，呈现典型的小RNA病毒粒子形态。序列比对及遗传进化分析结果显示，这2株病毒均属于B族基因2型牛肠道病毒。包含poly(A)尾结构在内，BHM26和BJ50株的全长基因组序列分别为7433和7416nt。病毒基因组具有小RNA病毒基因组的结构特征，全长基因组包含VPg-5' UTR-结构蛋白(VP4，VP2, VP3，VPl)编码区-非结构蛋白(2A-2C，3A-3D)编码区-3' UTR-poly(A)尾。对2株病毒的高变基因(VPl和VP3蛋白编码区)进行核苷酸遗传进化分析，2株病毒均与B族基因2型牛肠道病毒在同一进化分支上。上述生物学定性和序列分析结果显示，本发明所分离的2株病毒为牛肠道病毒，分类上属于B族基因2型牛肠道病毒。本发明进一步的构建了用于拯救B族基因2型牛肠道病毒的全长感染性cDNA克隆。优选的，所述的牛肠道病毒全长感染性cDNA的构建方法，包括(I)、提取所分离的BHM26株的总RNA ；(2)、以所述总RNA为模板，用oligo (dT)引物反转录合成cDNA ；(3)、用根据牛肠道病毒RNA设计带有酶切位点的特异性引物，分段扩增所述cDNA各片段，并分别克隆入质粒载体；(4)、将上述cDNA各片段连接构成带有基因组全长cDNA的质粒载体，即得。其中，步骤(3)中所述的特异性引物的核苷酸分别为SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9 或 SEQ ID No. 10 所
/Jn o将所构建的全长感染性cDNA克隆通过体外转录方法获得的RNA转染细胞，获到B族基因2型牛肠道病毒拯救病毒。本发明将所购建得到的B族基因2型牛肠道病毒全长感染性cDNA克隆提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏号是CGMCCNo. 4781 ;分类命名牛肠道病毒(Bovine Enterovirus);保藏时间是2011年4月15日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。牛肠道病毒作为疫苗载体具有独特的优点，首先，病毒对环境具有强耐受作用，所以易于保存；其次，因为牛肠道病毒是消化道常在病毒，能够诱导粘膜免疫。所以本发明分离的牛肠道病毒毒株、所构建的全长感染性cDNA克隆及其拯救病毒可应用于牛肠道病毒基因结构与功能的研究、作为牛肠道病毒疫苗载体或制备成预防或治疗牛肠道病毒的疫苗或试剂。
图I牛肠道病毒BHM26基因组拼接策略示意图。图2牛粪便样品接种MA104细胞；A.牛粪便样品接种的MA104细胞(200X)；B.正常 MA104 细胞(200 X)。图3病毒粒子的形态学观察。图4BEV保守区段的RT-PCR扩增。
图5BHM26和BJ50毒株IC和ID蛋白编码区遗传进化分析。图6全基因组cDNA的酶切鉴定图A DL15000Ladder ；B Nde I和Bgl II双酶切(7. 4+2. I kb)鉴定；C DL15000Ladder ；D Bgl II 单酶切鉴定(9. 5kb)。图7 (A)拯救病毒感染的MA104细胞；⑶正常MA104细胞。图8摇救病毒分子标签的鉴定；(A) Lanel DL2000DNA Ladder ；Lane2 :摇救病毒PCR产物PvuII酶切鉴定；Lane3 :亲本病毒PCR产物PvuII酶切鉴定；(B)亲本毒株基因组PvuII位点区的序列分析；(C)拯救病毒PvuII位点消除的序列分析验证。图9拯救病毒感染细胞的IFA检测；A :拯救病毒感染的MA104细胞；B :亲本病毒感染的MA104细胞；A:正常MA104细胞对照。图10拯救病毒和亲本病毒的一步生长曲线；BHM026为亲本病毒，C34-2为拯救病毒。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。材料和仪器I.试验材料MA104细胞为本发明人研究室保存，培养液为含8%胎牛血清的DMEM。牛粪便样品系2008年采自北京、内蒙古、黑龙江及安徽等地奶牛场，-70°C冻存。PrimeSTAR DNA聚合酶、Primescript 反转录酶、oligo (dT)引物、各种限制性内切酶、dNTPs、DNALadder Marker>5’FULL-RACE Kit 均购自 TaKaRa 公司；碱性磷酸酶、T4DNA连接酶(New England Biolabs 公司)、Trizol 购自 GibcoBRL公司；体外转录米用 Promega公司的 RiboMAX Large Scale RNAProduction Systems-17 试剂盒；转染试剂采用 QIAGEN 公司的Effectene TransfectionReagent转染试剂盒；羊抗兔突光二抗购自Sigma公司；SDS、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物、Tris、EDTA、焦碳酸二乙酯(DEPC)等试剂均为国外产品国内公司分装；氯化钠、氯仿、异丙醇、乙醇、异戊醇、NaCUMgCl2、磷酸二氢钠、饱和酚等均为国产分析纯试剂。2.主要仪器设备
各种规格移液器及5415R、5810R高速台式低温离心机(德国印pendorf公司)；MC0-15AC 二氧化碳培养箱、MDF-U32V超低温冰箱(日本SANYO公司)；1X51倒置显微镜(OLYMPUS公司)；生物二级安全柜(美国LABC0NC0公司)；DK-8D电热恒温水槽(上海精宏)；空气浴恒温摇床(KYC 100B，上海福玛实验设备有限公司)；旋涡混合器(QL-901，江苏海门麒麟医用仪器厂)；PCR仪(MyCycl er 型，美国Bio-Rad公司)；GIS-2020全自动凝胶成像系统(上海天能)；YDS60/210液氮罐(新乡豫新航空低温容器)；ASTACUS小型超纯水仪(德国MEMBRAPURE公司)。实施例I牛肠道病毒中国分离株BHM26的分离及鉴定I实验方法I. I病料处理新鲜采集的粪便样品，用PBS制成I : 10(W/V)粪便悬液，漩涡振荡器震荡，反复冻融三次，3000r/min，4°C离心lOmin，取上清，用0. 22 y m的微孔滤膜过滤除菌后，于_70°C冰箱保存备用。I. 2病毒分离培养用PBS将已长成单层的MA104细胞洗3遍，处理好的粪便样品接种到MA104单层细胞，37°C吸附lh，加入无血清的DMEM，在含5% CO2条件下于37°C培养，每天观察细胞病变(CPE)。如果细胞培养I周后仍无CPE，或者接种后细胞呈现50% -80% CPE时，将细胞培养物反复冻融3次，并收获。用同样方法将0. Iml上一代细胞培养物接种MA104细胞进行传代。I. 3病毒半数组织感染量(TCID5tl)的测定病毒的接种方法与方法4相同。将病毒作10倍连续倍比稀释即10' 1(T2，1(T3......
10_n，每孔加病毒悬液量为100 yl，每个稀释度作8孔，每块板的最后一列设8孔细胞对照。把培养板置5% CO2温箱37°C培养，逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed-Muench氏法计算 TCID500举例说明TCID50 计算(接种剂量 100 U I)
权利要求
1.一株牛肠道病毒(Bovine Enterovirus)中国分离株,其特征在于,其微生物保藏号是CGMCC No. 4782。
2.权利要求I所述的牛肠道病毒中国分离株在制备预防或治疗由牛肠道病毒所致疾病的药物中的用途。
3.权利要求I所述的牛肠道病毒中国分离株在制备诊断或检测由牛肠道病毒所致疾病的试剂中的用途。
4.牛肠道病毒(BovineEnterovirus)中国分离株的全基因,其特征在于其核苷酸为SEQ ID No. I 所示。
5.权利要求4所述全基因所编码的蛋白，其特征在干其氨基酸为SEQID No. 2所示。
6.权利要求4所述的全基因在制备预防或治疗由牛肠道病毒所致疾病的药物中的用途。
7.权利要求I所述的牛肠道病毒(BovineEnterovirus)中国分离株的全长感染性cDNA克隆的构建方法，包括 (1)、提取权利要求I所述牛肠道病毒中国分离株的总RNA； (2)、以所述总RNA为模板，用oligo(dT)引物反转录合成cDNA ； (3)、用根据牛肠道病毒RNA设计带有酶切位点的特异性引物，分段扩增所述cDNA各片段，并分别克隆入质粒载体；所述的特异性引物的核苷酸分别为SEQ ID No. 3、SEQ IDNo. 4,SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9或SEQ ID No. 10所示。
(4)、将上述cDNA各片段连接构成带有基因组全长cDNA的质粒载体，即得。
8.B族基因2型牛肠道病毒的全长感染性cDNA克隆，其特征在于其微生物保藏号是CGMCC No. 4781。
9.权利要求8所述的全长感染性cDNA克隆在拯救B族基因2型牛肠道病毒中的应用。
10.权利要求8所述的全长感染性cDNA克隆在作为疫苗载体中的用途。
全文摘要
牛肠道病毒中国分离株及其感染性cDNA克隆的构建和应用。本发明在牛腹泻粪便样品中分离出能够在MA104细胞上稳定产生CPE的牛肠道病毒分离株，其微生物保藏号是CGMCC No.4782。本发明用该分离株构建了全长感染性cDNA克隆，将其体外转录后转染细胞获得B族基因2型牛肠道拯救病毒。本发明分离的牛肠道病毒毒株、所构建的全长感染性cDNA克隆及其拯救病毒可应用于牛肠道病毒基因结构与功能的研究、作为牛肠道病毒疫苗载体或制备成预防或治疗牛肠道病毒的疫苗或试剂。
文档编号A61P31/14GK102776155SQ201110120089
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月10日 优先权日2011年5月10日
发明者于力, 常继涛 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所