猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提出了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用，公开了一种重组载体，其是通过反向遗传操作技术构建的我国猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH1R的感染性克隆，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的全长基因cDNA序列。本发明还公开了一种人工克隆弱毒疫苗株，该疫苗株是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性内切酶位点。通过对感染性克隆的基因工程改造，可以研究出更好的疫苗，有利于猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制。
【专利说明】猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】，具体地说，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合症(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus, PRRSV)引起的传染性疾病，该病以妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各年龄猪的呼吸道症状和高死亡率为主要特征。PRRS首先于1987年在美国发现，并于1991年在荷兰首先分离并鉴定了病原，并命名为Lelystad virus (LV)，1992年美国也分离到了 PRRS病原，命名为VR-2332。我国郭宝清等在1996年从4头流产胎儿中分离到PRRSV，此后该病毒一直在我国流行，给我国养猪业造成重大经济损失。
[0003]PRRSV归属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，是一种有囊膜、不分节段、单股、正链RNA病毒，其基因组全长约15kb，含有11个开放阅读框，在5’端有帽子结构，在3’端有poly (A)尾，根据遗传演化分析和血清学差异可以将PRRSV分为两个血清型，分别为以LV株为代表的欧洲型和以VR-2332为代表的美洲型。自从1987年PRRSV被发现以来，人们围绕PRRSV病原生物学特性、免疫学特性、致病机制和疫苗等进行了不懈的探索，取得了一些较好的进展，但由于PRRSV易发生变异、能够造成持续性感染和免疫抑制，而且具有抗体依赖性增强作用(ADE)等特征成为目前控制PRRS的主要障碍。
[0004]目前对PRRSV的控制手段主要依靠疫苗免疫，疫苗免疫可以有效降低该病的传播。PRRS灭活疫苗具有安全、`便于储存等优点，其缺点是抗原性减弱、免疫效率低、使用剂量大等，对异源毒株免疫效果不理想；弱毒疫苗免疫效果好，免疫持续时间长，但其安全性仍然令人担忧，给我国防控猪繁殖与呼吸综合征带来很大的困难。
【发明内容】
[0005]为解决上述现有技术存在的问题，本发明提出了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用，提供了一种重组载体，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的全长基因cDNA序列。本发明还提供了一种人工克隆疫苗株，所述人工克隆弱毒疫苗株是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性的内切酶位点。通过对感染性克隆的基因工程改造，可以研究出更好的疫苗，有利于猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制。
[0006]为达到上述目的，本发明的技术方案为:
[0007]在本发明的一个方面，提供了一种重组载体，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的全长基因cDNA序列，该全长基因cDNA序列的5’端加设有转录启动子，且该全长基因cDNA序列内部引入标记性的限制性酶切位点。[0008]优选的，所述载体为pBAC载体，该载体内部经过了改造，改造后的载体具有SEQ IDN0.2所述的核苷酸序列。
[0009]优选的，所述全长基因cDNA序列的5’端加设有转录启动子，其转录启动子为CMV
启动子。
[0010]优选的，所述全长基因CDNA序列内部引入标记性的限制性酶切位点，其限制性酶切位点为SmaI。
[0011]在本发明的另一方面，提供了一种人工克隆弱毒疫苗株的制备方法，包括以下步骤:将所述的重组载体和转染试剂混合后，转染病毒复制许可的宿主细胞，救获感染性的人工克隆弱毒疫苗株。
[0012]在本发明的另一方面，还提供了一种人工克隆弱毒疫苗株，所述人工克隆弱毒疫苗株是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性的内切酶位点。
[0013]优选的，所述人工克隆弱毒疫苗株具有SEQ ID N0.1所示的全长基因序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0014]在本发明的另一方面，还提供了人工克隆疫苗毒株在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。
[0015]相对于现有技术，本发明的有益效果为:本发明提供了一种重组载体，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的全长基因cDNA序列。本发明还提供了一种人工克隆疫苗株，所述人工克隆弱毒疫苗株是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性的内切酶位点。通过对感染性克隆的基因工程改造，可以研究出更好的疫苗，有利于猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制。`【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是本发明实施例1的PRRSV疫苗株CHlR基因组cDNA连接策略示意图；
[0017]图2是本发明实施例2克隆毒株rCHIR感染Marc-145细胞后的细胞病变图；
[0018]其中A为正常Marc-145细胞，B为克隆毒感染Marc-145细胞48h的CPE ；
[0019]图3是本发明实施例2利用针对PRRSV N蛋白的单克隆抗体的间接免疫荧光实验检测拯救毒株的结果图；其中A正常Marc-145细胞对照，B克隆毒感染Marc-145细胞；
[0020]图4是本发明实施例2中RT-PCR扩增了含基因组标记物的片段的酶切结果图；
[0021]图5是本发明实施例2中人工克隆毒株rCHIR与亲本毒株CHlR生长曲线比较图。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
[0023]实施例1:猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R基因组全长cDNA序列克隆的构
建
[0024]1.材料与方法
[0025]1.1病毒、载体与主要试剂
[0026]PRRSV弱毒疫苗株CH1R，其微生物保藏号:CGMCC N0.1883 ;克隆载体pBeloBACll由本研究所保存；病毒RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购和大提试剂盒自于 QIAGEN 公司；反转录试剂盒 SuperScriptIII First-Strand Synthesis System购自 Invitrogen 公司；高保真 DNA 聚合酶 Phusion High-fidelity DNA Polymerase 购自于NEB公司；pZer0Back载体试剂盒购自于天根公司；所有的限制性内切酶和T4DNA连接酶均购自于NEB公司。
[0027]1.2 引物
[0028]根据PRRSV CHlR株(GenBank登录号:EU807840)全基因组序列，用01igo6.0软件设计了 6对涵盖全基因组大部分序列的引物(由英俊生物工程有限公司合成，序列见表I)。合成了 I对用于对病毒核蛋白基因进行突变的引物，产生一个SmaI酶切位点作为将来鉴定拯救病毒的基因组标记(genomic marker);合成I对扩增N蛋白的引物用于遗传标记的鉴定(由英俊生物工程有限公司合成，序列见表1)。
[0029]表1.PRRSV疫苗株CHlR全基因组cDNA片段扩增及鉴定引物
【权利要求】
1.一种重组载体，其特征在于，包含:猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的全长基因组cDNA序列，该全长基因cDNA序列的5’端加设有转录启动子，且该全长基因cDNA序列内部引入标记性的限制性内切酶位点。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述载体为pBAC载体，具有SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述全长基因cDNA序列的5’端的转录启动子为CMV启动子。
4.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述全长基因cDNA序列内部引入标记性的SmaI限制性酶切位点。
5.—种人工克隆弱毒疫苗株的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组载体和转染试剂混合后，转染病毒复制许可的宿主细胞，救获感染性的人工克隆弱毒疫苗株。
6.一种人工克隆弱毒疫苗株，其特征在于，所述人工克隆弱毒疫苗株是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性的内切酶位点。
7.根据权利要求6所述的人工克隆弱毒疫苗株，其特征在于，所述人工克隆弱毒疫苗株具有SEQ ID N0.1所示的全长基因组序列。
8.权利要求6或7所述的人工克隆疫苗毒株在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。
9.权利要求6或7所述 的人工克隆疫苗毒株在制备区分猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫毒株与自然感染毒株的产品中的应用。
【文档编号】C12R1/93GK103695465SQ201310682463
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】翁长江, 蔡雪辉, 李江南, 王承宝, 刘永刚, 黄丽, 石文达 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所