专利名称:Asia1型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及单股正链RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法，本发明还涉及由该Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA和表达T7RNA聚合酶的真核表达载体所组成的江苏谱系Asial型ロ蹄疫病毒的反向遗传操作系统；本发 明还进一歩涉及该感染性cDNA通过体外转录以及该反向遗传操作系统通过体内转录的方式在拯救ロ蹄疫病毒中的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
ロ蹄疫病韋(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)属于小 RNA病韋科ロ蹄疫病毒属的成员，为单股正链RNA，其基因组RNA全长约8. 5kb。ロ蹄疫是严重危害偶蹄动物的重要传染病之一，该病引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食減少、肉品下降、动物的生产性能降低，导致巨大的经济损失。此外，由于贸易的限制和禁止而引起的损失更大，全世界毎年由此造成的直接经济损失可达数百亿美元。2005年以来在我国江苏、山东、甘肃、北京、河北等地爆发了 Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05，GenBank登录号EF149009)，由于在我国江苏省首先分离，被称作Asial型江苏谱系。该谱系ロ蹄疫病毒在我国牛群中ー经流行，传播趋势迅猛，造成的损失极为严重。因此，积极开展Asial型FMD江苏谱系毒株的研究，对我国FMD的防控具有重要的意义。
反向遗传操作系统是在分子水平研究病毒的重要工具之一。通过对病毒基因组进行定点突变、缺失、替换基因组的任意部分以产生突变体，借此在分子水平上研究病毒基因的结构与功能、了解决定病毒毒力的分子基础、宿主嗜性与跨种传播的机制。感染性克隆还可用于抗原表位的研究，特别是构象表位的研究。为研究病毒减毒奠定了实验基础，为研制新型疫苗提供了有力的工具。
目前已经有报道成功构建了牛源毒株OlK株(Zibert A, Maass G, Strebel K, etal.Infectious loot-and—mouth disease viruses derived from acloned full-lengthcDNA[J], J Virol，1990,64 :2467-2473)、牛源毒株 A12 株(Rieder E, Bunch T, Brown F,et al. Genetically engineeredfoot-and-mouth disease viruses with poly (C) tractsof two nucleotide arevirulent in mice[J]. J Virol, 1993,67 :5139-5145)、猪源毒株0H/99 株(Guanqing liu, et al. Generation of an infectious cDNA clone of anFMDVstrain isolated from swine. Virus Research, 2004,104 :157-164)以及兔化弱毒疫苗株ZB/CHA/58 (att)(中国专利公开号CN101225395A，发明名称亚洲ー型ロ蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法。)ロ蹄疫病毒的感染性cDNA，并在此基础上对FMDV进行了探索性的研究。但上述感染性克隆与我国近年来流行的江苏谱系Asial型ロ蹄疫病毒有着很大的遗传偏离，因此构建符合我国流行情况的江苏谱系Asial型ロ蹄疫病毒的反向遗传操作平台，对开展Asial型ロ蹄疫病毒结构与功能研究以及新型疫苗的研制具有重要的意义。
发明内容
[0005]本发明的首要目的是提供ー种Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA，该全长感染性cDNA包含了保证所合成的转录本具有感染性所要求的poIy(A)序列和poly (C)序列；
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA克隆5’末端具有T7RNA聚合酶启动子序列，3’末端具有単一的限制性酶切位点；其中，所述的3’末端限制性酶切位点是EcoRV酶切位点或NotI酶切位点；5’末端上游具有SphI酶切位点。
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA克隆除了启动子，poly (A)序列和PoIy(C)序列之外，其余的核苷酸序列与ロ蹄疫 病毒基因组天然序列相差不超过6个核苷酸序列；
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA克隆的poly (C)结构具有14-20个聚合C，poIy(A)尾具有19-22个A(更优选为具有19个A) ；poIy(C)结构及其侧翼序列是通过RT-PCR直接扩增得到，利用FMDV基因组中自然存在的两个限制性内切酶识别位点，将获得的包含PoIy(C)结构的片段导入全长cDNA中。
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA以pBluescriptSK (+)为载体；
进ー步优选的，所述Asial型ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA，包含SEQ ID NO 1所示的序列。
一种构建上述Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA的方法，包括
(I)以Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒RNA为模板，应用5’RACE方法扩增基因组的5’末端序列片段；
(2)采用RT-PCR获得ロ蹄疫病毒基因组各部分的6个片段，包括poly (C)结构及其侧翼序列；
(3)将所扩增的PCR片段采用限制性内切酶酶切克隆的方法组装克隆到质粒载体中，全长cDNA克隆5’末端具有T7RNA聚合酶启动子序列，3’末端具有単一的限制性酶切位点；
(4)将所述cDNA各片段连接，构成带有基因组全长cDNA的质粒载体；纯化回收包含病毒基因组全长cDNA的质粒，即得。
其中，步骤(I)所用到引物序列为SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16所示；步骤(2)中所用到引物序列为 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQID NO :12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14 所示；
步骤(3)中所述的质粒载体是pBluescript II SK (+)载体；
本发明的另ー目的是提供ー种Asial型ロ蹄疫病毒反向遗传操作系统,该Asial型ロ蹄疫病毒反向遗传操作系统由上述的Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA和表达T7RNA聚合酶的真核表达载体所组成。
所述的表达T7RNA聚合酶的真核表达载体pT7RNAP，其构建方法包括将T7RNA聚合酶基因克隆到真核表达载体PCDNA3. I中，并在该基因的5'端引入Kozak序列，以确保T7RNA聚合酶的高效表达；
同吋，为检测表达载体pT7RNAP是否表达pT7RNAP以及该酶是否具有转录活性，构建了以绿色荧光蛋白为检测信号的检测载体PT7-IRES-EGFP，该载体是利用FMDV的IRES能够介导非帽依赖性表达外源基因的特性，将FMDV的IRES和EGFP顺次克隆到原核表达载体PET-28a中，并使之受控于ロ蹄疫病毒的IRES元件下；
把上述两个重组质粒共转染BHK-21细胞，培养20 48h，在紫外显微镜下观察，能够看到典型的绿色荧光，表明PT7RNAP载体能够表达I7RNA聚合酶并具有转录活性。[0022]本发明的另ー个目的是将所构建的Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA用于拯救ロ蹄疫病毒，包括将所述Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA采用体外转录的方式转染BHK-21细胞；或者是将所述Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA与表达I7RNA聚合酶的真核表达载体共转染(体内转录)BHK-21细胞以拯救ロ蹄疫病毒；
试验证明，利用本发明所构建的Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA不伦是采用体外转录还是采用体内转录(与表达I7RNA聚合酶的真核表达载体共转染)的方式均可以成功的拯救出ロ蹄疫病毒。
本发明ロ蹄疫病毒感染性cDNA不同于国内外ロ蹄疫病毒感染性cDNA的地方主要有以下几点
(I)美国的感染性cDNA是以A型ロ蹄疫病毒为材料研制出来的，德国的感染性cDNA是以欧洲流行毒株的代表株OlK为原材料的，分离自牛体。本发明所选用的毒株为我国流行的Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株，分离自牛体，反映了我国ロ蹄疫的流行特点，因此本发明ロ蹄疫病毒感染性cDNA对我国ロ蹄疫的研究更具有针对性，对我国ロ蹄疫的防控具有积极的意义。
(2)研制感染性cDNA的策略不同
美国的A株感染性cDNA是用人工方法合成一系列长度的poly (C) (Cn = 2、6、16、25，35)，并人为的在poly(C)两端加上限制性内切酶识别位点，并在基因组全长cDNA片段下游中加入相应的内切酶识别位点，从而将Poly(C)导入全长cDNA序列中，这种策略会在全长cDNA中造成碱基的改变并引入非基因组的核苷酸。
德国的0IK株感染性cDNA是利用末端转移酶的酶促活性，给全长cDNA加上poly (C)结构，这种方法不能人为控制，可操作性差，而且也需要改变全长cDNA的真实序列。
本发明通过RT-PCR直接扩增获得poly(C)及其侧翼序列，利用FMDV基因组中自然存在的限制性内切酶识别位点，将Poly(C)结构导入全长cDNA中，不需要改变基因组的真实序列，可操作性強。
(3)所包含的poly(A)尾巴序列长度不一样美国的A型感染性cDNA含有15个A,德国的OlK株感染性cDNA含有90个A。本发明感染性cDNA含有19个A这ー长度的poly(A)结构，能够保证病毒感染性的需要。
(4)国内外建立ロ蹄疫病毒的反向遗传操作平台均是使用体外转录的方法拯救病毒，而本发明建立了拯救ロ蹄疫病毒的体内转录和体外转录的双系统。
目前，判断所构建的ロ蹄疫病毒感染性cDNA是否符合要求关键要满足以下几点要求
(I)病毒基因组在分子克隆过程中要确保其真实性因开放阅读框中的一个碱基的变化就有可能会影响整个基因组的结构从而导致整个全长质粒不具备感染性；此外，因为RNA病毒自身的特点，其基因组并不稳定；
(2)要保证所构建的感染性cDNA含有足够长的poly (C)序列和poly (A)尾巴结构；
(3) 3’末端具有合适的限制性酶切位点；
本发明所述的全长感染性cDNA除了启动子、poly (A)序列和poly (C)序列之外，其余的核苷酸序列与ロ蹄疫病毒基因组天然序列相差不超过6个核苷酸序列，poIy(C)结构及其侧翼序列是通过RT-PCR直接扩增得到，所以本发明感染性cDNA在克隆过程中其真实性高；另外，本发明全长感染性cDNA的poIy(A)尾具有19-22个A ;所述poly (C)结构具有14-20个聚合C，含有足够长的poIy(C)序列和poIy(A)尾巴结构；所述感染性cDNA的3’末端具有EcoRV酶切位点或NotI酶切位点。
本发明的感染性cDNA的成功构建将为研究ロ蹄疫提供ー个有力的基因技术操作平台，可以方便人们对ロ蹄疫病毒基因组的操作。具体应用主要有以下几个方面
(I) 了解基因的结构与功能；
(2) 了解病毒的致病机理和基因组的复制、表达调控机制；
(3)研究病毒与宿主细胞的相互作用；
(4)研究病毒的B细胞表位特别是构象型B细胞表位；
(5)通过反向遗传操作系统制备不会发生毒力返祖的减毒疫苗株；
(6)研究开发新型ロ蹄疫疫苗；
本发明的Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA，能够在分子水平上通过突变、插入、缺失和替换来研究ロ蹄疫病毒的复制、毒力的分子决定因素和减毒机制、分子致病机理、基因产物的结构与功能、宿主嗜性改变与跨种传播，以及减毒活疫苗、表位疫苗、核酸疫苗、标记疫苗等新型疫苗的研究开发，是进一歩研究ロ蹄疫病毒和防制ロ蹄疫的极有价值的工具。
图lAsial/YS/CHA/05株FMDV基因组拼接策略示意图。
图2pET_28a(+)载体的结构示意图。
图 3pBluescript II SK(+)。
图4pcDNA3. I (+)。
图5全基因组cDNA的酶切鉴定图A lkb Ladder ；B =Sphl和Notl双酶切鉴定；C Ikb Ladder ；D EcoRl 单酶切鉴定。
图6体外转录的RNA电泳图。
图7 (A)拯救病毒感染的BHK-21细胞⑶正常BHK-21细胞。
图8 ロ蹄疫病毒粒子的免疫电镜观察(bar = IOOnm)。
图9摇救病毒分子标签的鉴定(A) lanel :IOObp DNA Ladder ;lane2 :亲本毒PCR产物PstI酶切鉴定；lane3 :拯救病毒PCR产物PstI酶切鉴定(B)亲本毒株基因组PstI位点区的序列分析(C)拯救病毒PstI位点消除的序列分析验证。
图10拯救感染BHK-21细胞的免疫荧光检测(A)拯救病毒感染的BHK-21细胞(B)亲本病毒感染的BHK-21细胞(C)正常BHK-21细胞对照。
图11拯救病毒和亲本病毒的一步生长曲线。[0056]图12I7RNA聚合酶的表达和活性检测(A)pI7RNAP和pT7_IRES_EGFP载体共转BHK-21细胞后48h EGFP表达情况；(B)pEGFP-Nl载体转染BHK-21细胞作为阳性对照；(C)PT7-IRES-EGFP载体转染BHK-21细胞作为阴性对照。[0057]图13pT7RNAP 载体和 p!7-IRES_EGFP 载体示意图。
具体实施方式
一、试验材料、有关术语和方法
在本发明中，所述的术语“反向遗传操作”指的是相对于经典遗传学而言的，是在获得ロ蹄疫病毒(Asial/YS/CHA/05株)基因组全部序列的基础上，按组成顺序构建全长病毒基因组，让其装配出具有生物活性的病毒粒子，为进ー步对ロ蹄疫病毒病毒基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置換等，从而研究基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对病毒的表型、性状有何种影响等方面的内容奠定实验基础。
本发明所述Asial型ロ蹄疫病毒毒株指的是Asial/YS/CHA/05株。
本发明中所用到的參考文献(I)王海伟，涂亚斌，周国辉，杨德成，张亚科，于力，Asial型ロ蹄疫病毒感染性克隆的建立。中国预防兽医学报，2008年第12期；(2)杨德成，涂亚斌，王海伟，周国辉，于力，0型ロ蹄疫病毒泛亚谱系感染性克隆的建立，中国预防兽医学报，2009 年第 I 期；(3) Zibert A, Maass G, Strebel K, etal. Infectiousloot-and—mouth disease viruses derived irom a clonea lull—length cDNA. J Virol,1990,64 :2467-2473 ； (4)Rieder E, Bunch T, Brown F, et al. Genetically engineeredfoot-and-mouth disease viruseswith poly (C) tracts of two nucleotide are virulentin mice. J Virol, 1993,67 :5139-5145.
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室指南》(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001)中所述的条件进行。
在本发明的实施例中，使用的含ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株完整基因组的质粒PASi(保藏单位中国普通微生物菌种保藏管理中心保存；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；其微生物保藏号为=CGMCC2689 ;其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)) ；T7 RNA聚合酶的真核表达载体质粒PT7RNAP (保藏单位中国普通微生物菌种保藏管理中心保存；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；其微生物保藏号是CGMCC 2688，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli));检测17 RNA聚合酶活性的载体质粒PI7-IRES-EGFP (保藏单位中国普通微生物菌种保藏管理中心保存；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；其微生物保存号是=CGMCC 2690 ;其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli))。
在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株pBluescript II SK(+)载体购自Stratagene公司，DH5a感受态细胞、BHK-21细胞由本实验室保存。
在本发明的实施例中，使用的其他试剂PrimeSTAR DNA聚合酶、各种限制性内切酶、dNTPs、DNA Ladder Marker、5’FULL-RACEKit 购自 TaKaRa 公司；碱性磷酸酶、T4 DNA 连接酶New EnglandBiolabs公司；TRIzol购自GibcoBRL公司，体外转录米用Promega公司的 RiboMAX Large Scale RNA Production Systems_T7 试剂盒。转染试剂米用 QIAGEN公司的Effectene Transfection Reagent转染试剂盒，羊抗鼠突光二抗购自Sigma公司。SDS、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物、Tris、EDTA、焦碳酸ニこ酯(DEPC)等试剂均为国外产品国内公司分装；氯化钠、氯仿、异丙醇、こ醇、异戊醇、NaCl、MgCl2、磷酸ニ氢钠、饱和酚等均为国产分析纯试剂。
实施例I Asial型ロ蹄疫病毒江苏谱系反向遗传操作系统的建立
在本发明的实施例中，BHK-21单层细胞培养条件培养液为含10%胎牛血清的DMEM，在含5% C02的培养箱中37°C培养。Asial型ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株与Asial/JS/CHA/05毒株(GenBank登录号EF149009)的核苷酸序列同源性在98 %以上，属于相同来源，其基因组全长8193bp,包含14nt poly(C)和19nt poly(A)。病毒在含2%胎牛血清的DMEM培养液中繁殖，当80%的细胞出现CPE时收获病毒，反复冻融三次后，2000 Xg (40C )离心 lOmin，上清于-70°C保存。I. I引物设计
根据ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株的全基因组测序結果，设计引物，分别作为PCR扩增的引物；
I. 2 5' RACE
用5’FULL-RACE试剂盒，采用“去帽法原理”，測定病毒基因组5’末端的真实序列。简言之，用Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉mRNA的5’端帽子结构，之后用T4RNA Ligase将5’ RACEAdaptor连接到mRNA的5’端，最后用5’ RACE Adaptor上的引物与已知序列部分的引物进行反转录和PCR扩增5’末端序列，采用的引物见表I。
表I FMDV Asial/YS/CHA/05株基因组PCR扩增的引物
权利要求
1.一种Asial型江苏谱系口蹄疫病毒的全长感染性cDNA，其特征在于所述的全长感染性cDNA序列为SEQ ID NO 1所示的序列。
2.—种Asial型口蹄疫病毒反向遗传操作系统，由权利要求
I所述的Asial型江苏谱系口蹄疫病毒的全长感染性cDNA和表达I7RNA聚合酶的真核表达载体所组成。
3.按照权利要求
2所述的Asial型口蹄疫病毒反向遗传操作系统，其特征在于所述的表达17 RNA聚合酶的真核表达载体是pT7RNAP，其构建方法包括将17 RNA聚合酶基因克隆到真核表达载体p⑶NA3. I中，并在该基因的5'端引入Kozak序列。
4.按照权利要求
2或3所述的Asial型口蹄疫病毒反向遗传操作系统，其特征在于还包括一种检测表达I7RNA聚合酶的真核表达载体是否表达以及所表达的酶是否具有转录活性的检测表达载体。
5.按照权利要求
4所述的Asial型口蹄疫病毒反向遗传操作系统，其特征在于所述的检测表达载体是PI7-IRES-EGFP，其构建方法包括将FMDV的IRES和EGFP顺次克隆到原核表达载体PET-28a中，并使EGFP受控于口蹄疫病毒的IRES元件下，即得。
6.权利要求
I所述全长感染性cDNA在拯救口蹄疫病毒中的应用，包括将所述的全长感染性cDNA和17 RNA聚合酶的真核表达载体共转染哺乳动物细胞，拯救得到口蹄疫病毒。
专利摘要
本发明公开了Asial型江苏谱系口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法和应用。所述感染性cDNA包含了保证合成转录本具有感染性所要求的poIy(A)序列和poIy(C)序列，所述poIy(A)尾具有19-22个A；所述poIy(C)结构具有14-20个聚合C；其5’末端具有T7RNA聚合酶启动子序列，3’末端具有单一的限制性酶切位点。所述感染性cDNA可以和表达T7RNA聚合酶的真核表达载体组成反向遗传操作系统。该感染性cDNA及其反向遗传操作系统可用于拯救口蹄疫病毒，为研究口蹄疫病毒基因的结构与功能、病毒的分子致病机理、开发口蹄疫病毒减毒疫苗株和新型口蹄疫疫苗等奠定了实验基础。
文档编号C12N7/00GKCN101724636 B发布类型授权 专利申请号CN 200810171258
公开日2012年9月5日 申请日期2008年10月30日
发明者于力, 周国辉, 杨德成, 涂亚斌, 王海伟 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (3),