一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法。本发明人设计了一种有效的策略，成功地基于黑猩猩型腺病毒AdC7构建成一种新型表达载体。所述的疫苗载体可应用于制备可高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
【专利说明】一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和病毒学领域；更具体地，本发明涉及一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002]重组腺病毒载体具有高转导效率、表达水平高、持续时间长、易于纯化等特点，并且免疫后可诱导外源基因特异性的细胞免疫与体液免疫反应，因此是一种理想的疫苗载体。基于腺病毒人血清型2型(AdHu2)与5型(AdHu5)的表达载体在疫苗研究以及基因治疗中曾被广泛应用，但由于人群中40-60%的个体已经感染相应的腺病毒，存在相应的预存中和抗体，从而限制AdHu2和AdHu5载体的临床应用。为克服预存中和抗体的影响，一种方法是改造AdHu2和AdHu5载体的衣壳蛋白。一些研究显示，可通过交换纤维蛋白基因来实现这一想法。但是这种嵌合病毒仍会被针对hexon表位的抗体所中和，而且一些hexon蛋白经改造后的嵌合病毒不稳定；另一种方法是选择人稀有血清型或来源于其它动物宿主的腺病毒作为表达载体。由于人群中一般不会含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗载体，其 免疫效果显著优于以人血清型腺病毒构建的疫苗载体。目前，基于黑猩猩型腺病毒的新型疫苗载体成为疫苗研发中重要选择。2013年5月，比尔盖兹基金会(Bill&Melinda Gates Foundation)资助美国、英国以及瑞士的研究单位(公司)2900万美元，用于新型黑猩猩腺病毒载体的研发。
[0003]构建重组腺病毒载体的方法有三种。传统的方法是在包装细胞系中进行外源基因和野生型病毒的同源重组，从而获得重组腺病毒，但这种方法操作复杂，费时费力，不容易获得单一的重组腺病毒；第二种方法是基于在大肠杆菌中同源重组，其缺点是相对费时，容易发生突变。第三种方法是将腺病毒基因组直接克隆到质粒载体上，然后线性化转染包装细胞系，拯救出腺病毒。由于腺病毒基因组相对较大，大小约为36kb，对其基因组进行直接克隆存在一定难度。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法。
[0005]在本发明的第一方面，提供一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括:以野生型腺病毒AdC7基因组(较佳地，序列如GenBank登录号AY530878.1)为基础，删除部分El编码区与全部E3编码区，在El删除区增添1-Ceu I与P1-Sce I酶切位点，在E3删除区增添Rsr II酶切位点，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。
[0006]在一个优选例中，所述的删除部分El编码区是指删除野生型AdC7基因组中第458-3026位(基于GenBank登录号AY530878.1的序列计算序列位点)的序列。
[0007]在另一优选例中，所述的删除全部E3编码区是指删除野生型AdC7基因组中第27094-31799位(基于GenBank登录号AY530878.1的序列计算序列位点)的序列。
[0008]在另一优选例中，所述的方法包括:[0009](I)将来源于pNEB193的origin序列、来源于AdC7腺病毒基因组的LITR片段、来源于AdC7腺病毒基因组的Nde 1-Age I片段通过融合PCR融合成片段0LN，用Spe I与Age I酶切片段OLN ;用Nde 1、Age I与Spe I酶切AdC7腺病毒基因组，将切下的片段Age (4028)-SpeI (10610)(基于GenBank登录号AY530878.1的序列计算序列位点)与已酶切过的片段OLN相连接形成质粒pOIN ；
[0010](2)用Hind III和Avr II酶切AdC7基因组，将切下的目的片段Hind
III(7153)-Avr 11 (23363)插入到质粒pOIN的Hind III和Avr II位点中，获得的质粒命名为pOINH(基于GenBank登录号AY530878.1的序列计算序列位点)；
[0011](3)从AdC7腺病毒基因组中扩增位于AdC7腺病毒基因中31800-36535之间的片段，在5’端引入Avr II与Rsr II酶切位点，在3’端引入Pac I与Asis I位点，将扩增的片段插入到POINH的Avr II与Asis I位点中，获得的质粒命名为pOINHR ；
[0012](4)从AdC7腺病毒基因组中扩增位于AdC7腺病毒基因中23165-27093之间的片段，在3’端引入Rsr II位点，将扩增的片段插入到pOINHR的Avr II与Rsr II位点中，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。
[0013]在另一优选例中，所述的origin序列是SEQ ID NO:1 (即后附的pAdC7载体的核苷酸序列)中第1-1882位所示的序列。[0014]在另一优选例中，所述的来源于AdC7腺病毒基因组的LITR片段是SEQID N0:1中第1883-2382位所示的序列。
[0015]在另一优选例中，所述的来源于AdC7腺病毒基因组的Nde1-AgeI片段是SEQ IDNO:1中第2383-3422位所示的序列。
[0016]在另一优选例中，所述的Rsr I1-Asis I之间的片段是SEQ ID N0:1中第26483-31241位所示的序列。
[0017]在另一优选例中，所述的Avr I1-Rsr II之间的片段是SEQ ID N0:1中第22751-26482位所示的序列。
[0018]在本发明的另一方面，提供一种腺病毒表达载体，所述表达载体在野生型腺病毒AdC7基因组基础上删除部分El编码区与全部E3编码区，并且，在El删除区增添1-Ceu I与P1-Sce I酶切位点，在E3删除区增添Rsr II酶切位点。
[0019]在一个优选例中，所述表达载体的酶切位点P1-Sce I和1-Ceu I之间，还包括外源的抗原编码基因。
[0020]在另一优选例中，所述的外源抗原是(但不限于)流感病毒的血凝素抗原(如H5N1HA)。
[0021]在本发明的另一方面，提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括:
[0022](I)提供所述的腺病毒表达载体；
[0023](2)将外源的抗原编码基因插入到(I)表达载体的酶切位点P1-Sce I和1-Ceu I之间；
[0024](3)将(2)的重组表达载体感染病毒生产细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的疫苗。
[0025]在本发明的另一方面，提供一种用于制备疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括:前面任一所述的腺病毒表达载体。[0026]在一个优选例中，所述试剂盒还包括:病毒生产细胞；和/或抗原编码基因。
[0027]在另一优选例中，所述的病毒生产细胞是HEK293细胞。
[0028]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1、AdC7基因组DNA的酶切鉴定。
[0030]Ulkb ladder (NEB) ;2、Bgl II 酶切。
[0031]图2、重组腺病毒载体pAdC7(即pAdC7_AElAE3)的酶切鉴定。
[0032]Ulkb ladder (NEB) ;2、Bgl II ；3.Xho I ；4.Mfe I。
[0033]图3、构建重组腺病毒AdC7_eGFP。
[0034]A:重组腺病毒载体pAdC7_eGFP的酶切鉴定；
[0035]B:重组腺病毒AdC7_eGFP的噬斑形成
[0036]图4、构建重组腺病毒AdC7_H5NlHA。
[0037]A:pAdC7-H5NlHA 酶切鉴定；
[0038]B:AdC7-H5Nl 酶切鉴定；
[0039]C:检测HA蛋白的表达。
[0040]图5、构建复制缺陷型腺病毒载体pAdC7的策略。
【具体实施方式】
[0041]本发明人经过深入的研究，设计了一种有效的策略，成功地基于黑猩猩型腺病毒AdC7构建成一种新型表达载体。所述的疫苗载体可应用于制备可高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
[0042]本发明提供了一种腺病毒表达载体，所述表达载体包括:所述表达载体在野生型腺病毒AdC7基因组基础上删除部分El编码区与全部E3编码区，并且，在El删除区增添1-Ceu I与P1-Sce I酶切位点，在E3删除区增添Rsr II酶切位点。
[0043]针对腺病毒AdC7基因组，本发明人经过细致的序列比对，最终确定了应用酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I作为外源基因的插入位点，从而不会导致在腺病毒表达载体的其它位置造成剪切。
[0044]黑猩猩型腺病毒AdC7，即SAdV24，又被命名为Pan7，从黑猩猩淋巴结中分离得到。本发明以野生型AdC7为基础，通过基因组直接克隆方法，删除部分El与全部E3编码区，在El删除区增添1-Ceu I与P1-Sce I酶切位点，在E3删除区增添Rsr II酶位点，最终获得了复制缺陷型的AdC7重组腺病毒表达载体。
[0045]所述的表达载体还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子(如CMV)上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
[0046]本发明还提供了一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括:以野生型腺病毒AdC7基因组为基础，删除部分El编码区与全部E3编码区，在El删除区增添1-Ceu I与P1-Sce I酶切位点，在E3删除区增添Rsr II酶切位点，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。
[0047]作为本发明的优选方式，克隆步骤包括:①Overlap PCR得到的片段，经Age I与Spe I酶切后，与Ndel，AgeI和SpeI酶切AdC7基因组后得到的片段，连接成质粒pOIN ；②Hind IIII与Avr II酶切质粒pOIN与AdC7基因组，连接成质粒pOINH ;③Rsr II与Asis I酶切PCR得到的片段与质粒ρΟΙΝΗ，连接成质粒pOINHR;④Avr II与Rsr II酶切PCR得到的片段与质粒pOINHR，连接成质粒pAdC7。
[0048]获得所述腺病毒表达载体后，将之转染病毒生产细胞，进行病毒的繁殖。转染后的一段时间后，可以收获病毒。作为本发明的优选方式，收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度(TCID5tl)的测定可以根据本领域常规方法进行。
[0049]本发明的腺病毒表达载体作为一个表达载体平台，适用于表达多种抗原，从而制备病毒疫苗。所述的抗原没有特别的限制。
[0050]作为本发明的优选方式，为验证AdC7的有效性，本发明人将流感病毒H5N1的HA基因克隆至AdC7载体，研究显示AdC7载体能高表达抗原基因(如HA基因)，证明本发明人成功获得了一种新型的腺病毒载体，可用于疫苗研发以及其它生物医学基础研究，为新型疫苗研发提供一种新型的载体平台。
[0051]本发明通过腺病毒基因组直接克隆的方法，并利用STBL2大肠杆菌稳定转化体系，避开了传统的通过同源重组方法构建腺病毒载体，极大程度上降低了腺病毒发生突变的可能，获得的重组腺病毒 载体遗传稳定性好。因此，利用本发明构建的腺病毒载体表达外源基因将更稳定、高效。本发明利用体外直接酶切连接方法构建腺病毒载体，在细菌水平筛选阳性克隆更容易、快捷，极大地缩短了腺病毒载体的构建时间。此外，本发明适用于所有腺病毒载体的构建，仅仅需要对腺病毒基因组酶切位点进行分析并加以合理应用即可，能被普遍推广应用于所有生物医学实验室，并且对腺病毒内部序列可进行优化改造，构建各种特异性的腺病毒载体。因此，本发明不仅提供了一种新型表达载体，而且提供了一种新型的腺病毒载体的构建方法，更有利于促进腺病毒载体在生物医学基础研究领域和临床应用开发方面发挥其优异特征，为保障人类健康、提高生活质量奠定基础。
[0052]基于本发明的新改进，本发明还提供了一种用于制备疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括所述的腺病毒表达载体。
[0053]所述的试剂盒还可包括病毒生产细胞，所欲表达的抗原的编码基因。此外，所述的试剂盒中还可包括说明疫苗制备方法的使用说明书。
[0054]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0055]1、材料
[0056]1.1病毒株和细胞
[0057]野生型腺病毒AdC7购于ATCC (Manassas，VA) ;HEK293细胞株购自中国科学院上海生物化学和细胞生物研究所，培养基为含10%胎牛血清(FCS)的DMEM。[0058] 1.2限制性内切酶、菌种与质粒
[0059]限制性内切酶购自New England Biolabs ；DH5 α 和 Stbl2 购自 Invitrogen ；pNEB193 购自 New England Biolabs。
[0060]pshuttle-CMV 载体购自 CLONTECH Laboratories, Inc。
[0061]pUC57-EGFP质粒:EGFP序列(SEQ ID NO:2)由南京金斯瑞公司成并克隆至pUC57载体，获 PUC57-EGFP。
[0062]pUC57-H5NlHA质粒:H5N1HA序列(SEQ ID NO:3)由南京金斯瑞公司合成并克隆至PUC57 载体，获 pUC57-H5NlHA。
[0063]2、方法
[0064]2.1腺病毒的扩增与纯化
[0065]HEK293细胞在含有10%FCS的DMEM中培养，AdC7腺病毒在HEK293细胞中培养扩增。腺病毒感染HEK293在无FCS的DMEM进行，两小时后，加FCS使FCS终浓度达到5%。当细胞全部表现出病毒噬斑(CPE)后，收集被感染的细胞，离心。用DMEM重悬细胞，反复冻融细胞三次，使细胞裂解。病毒经CsCl密度梯度离心纯化，然后加入甘油置_80°C冰箱保存。
[0066]2.2提取腺病毒基因组DNA
[0067]AdC7腺病毒纯化后，用标准方法提取基因组DNA。用BglII消化基因组DNA作分析鉴定。
[0068]2.3构建复制缺陷型的腺病毒载体
[0069]2.3.1 构建质粒 pOIN
[0070]以 pNEBl93 为模板，用引物outside primer of the origin 与 antisense primerof the origin (表 I),通过 PCR 扩增得到片段 the origin。
[0071]以AdC7腺病毒基因组为模板，用引物senseprimer of LITR与antisense primerof LITR.1-Cue，通过PCR扩增得到片段LITR。
[0072]以AdC7腺病毒基因组为模板，用引物sense primer of Ndel-Agel.ΡΙ-Sce与outside primer of Ndel-Agel,通过 PCR 扩增得到片段 Nde1-AgeI。
[0073]通过融合PCR，将片段the origin,片段LITR与片段Nde1-AgeI融合成片段0LN，融合 PCR 时，使用引物 inside primer of origin 与 inside primer of Nde1-AgeI? 通过PCR与融合PCR将AdC7基因组中El的第458-3026位片段删除(基于GenBank登录号AY530878.1的序列计算序列位点)，同时引入一些酶切位点，在片段the origin的5’端引入spe 1、Avr II与Asis I酶切位点，在片段the origin与LITR之间引入Pac I酶切位点，在片段LITR与Nde1-AgeI之间引入1-Ceu I与P1-Sce I酶切位点。用Spe I与Age I酶切片段0LN，用DNA普通产物纯化试剂盒回收；用Nde、Spe I与Age I (用Spe I与Age I酶切AdC7，可得到两个大小几乎相同的片段，即片段Age I (4028)-Spe 1(10601)和AgeI (25823)-Spe I (32770)，在低熔点琼脂糖电泳中分不开，因此用三种酶酶切AdC7基因组)酶切AdC7基因组，低熔点琼脂糖电泳，可获取6.5kb目的片段AgeI (4028)-SpeI (10610)(基于GenBank登录号AY530878.1的序列计算序列位点)。然后，在低熔点琼脂糖中作连接反应，转化，挑选克隆作分析鉴定；获得POIN质粒。
[0074]表1、所用引物
[0075]
【权利要求】
1.一种制备腺病毒表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括: 以野生型腺病毒AdC7基因组为基础，删除部分El编码区与全部E3编码区，在El删除区增添1-Ceu I与P1-Sce I酶切位点，在E3删除区增添Rsr II酶切位点，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的删除部分El编码区是指删除野生型AdC7基因组中第458-3026位的序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的删除全部E3编码区是指删除野生型AdC7基因组中第27094-31799位的序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括: (1)将来源于PNEB193的origin序列、来源于AdC7腺病毒基因组的LITR片段、来源于AdC7腺病毒基因组的Nde 1-Age I片段通过融合PCR融合成片段0LN，用Spe I与Age I酶切片段OLN;用Nde I, Age I与Spe I酶切AdC7腺病毒基因组，将切下的片段Age (4028) -SpeI (10610)与已酶切过的片段OLN相连接形成质粒pOIN ； (2)用HindIII和Avr II酶切AdC7基因组，将切下的目的片段Hind III (7153)-AvrII(23363)插入到质粒pOIN的Hind III和Avr II位点中，获得的质粒命名为pOINH ； (3)从AdC7腺病毒基因组中扩增位于AdC7腺病毒基因中31800-36535之间的片段，在5’端引入Avr II与Rsr II酶切位点，在3’端引入Pac I与Asis I位点，将扩增的片段插入到POINH的Avr II与Asis I位点中，获得的质粒命名为pOINHR ;和 (4)从AdC7腺病毒基因组中扩增位于AdC7腺病毒基因中23165-27093之间的片段，在3’端引入Rsr II位点，将扩增的片段插入到pOINHR的Avr II与Rsr II位点中，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。
5.一种腺病毒表达载体，其特征在于，所述表达载体在野生型腺病毒AdC7基因组基础上删除部分El编码区与全部E3编码区，并且，在El删除区增添1-Ceu I与P1-Sce I酶切位点，在E3删除区增添Rsr 11酶切位点。
6.如权利要求5所述的腺病毒表达载体，其特征在于，所述表达载体的酶切位点P1-Sce I和1-Ceu I之间，还包括外源的抗原编码基因。
7.如权利要求6所述的腺病毒表达载体，其特征在于，所述的外源抗原是流感病毒的血凝素抗原。
8.一种制备疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提供权利要求5所述的腺病毒表达载体； (2)将外源的抗原编码基因插入到(1)表达载体的酶切位点P1-SceI和1-Ceu I之间； (3)将(2)的重组表达载体感染病毒生产细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的疫苗。
9.一种用于制备疫苗的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: 权利要求5-7任一所述的腺病毒表达载体。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括: 病毒生产细胞；和/或 抗原编码基因。
【文档编号】C12N15/861GK103923943SQ201310364528
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】周东明, 成涛 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所