继续培养至细胞至少有 50%病变，该病变肥L细胞带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组，提取病变细胞的总DNA。
[0038] 可选的，在步骤5)中：所述培养基为LB固体培养基，且所述培养时间为35-37小 时，培养溫度为36-38 °C。
[0039] 可选的，在步骤23)中：
[0040] 所述PCR所用的引物的序列如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:4所示。
[0041] 权利要求所述的构建方法构建成的人巨细胞病毒感染性克隆在间接免疫巧光或 者在蛋白质印迹中的应用。
[0042] 权利要求所述的构建方法构建成的人巨细胞病毒感染性克隆在检测抗病毒药物 活性中的应用。
[0043] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0044] (1)、本发明制备的带有绿色巧光蛋白基因（GFP)的细菌人工染色体（pUS-巧质 粒）比改造前的mini-F质粒（PMB01374即pUS-Fl)增加了一个指示标签蛋白，通过该绿色 巧光蛋白的表达，能够更好的更直接观察载体的表达情况，由于GFP巧光是生物细胞的自 主功能，巧光的产生不需要任何外源反应底物，用其作为活体报告蛋白，其作用是任何其它 酶类报告蛋白无法比拟的。
[0045] 似、本发明的带有细菌人工染色的HCMV Han感染性克隆捶救出的HCMV Han-BAC 重组病毒与野生型HCMV Han病毒相比有着相同的生长趋势，但是HCMV Han-BAC重组病毒 中由于含有GFP蛋白标签，该标签蛋白分子量小只有0.7肺，不影响病毒基因的结构和功 能，大量表达对细胞也无毒性。含GFP的重组HCMV Han病毒感染细胞，便可进行病毒对细 胞感染情况的实时观察，更接近自然真实的状态。
[0046] 另外，HCMV Han-BAC感染性单克隆基因组由于含有BAC序列，能在特定的细菌内 (如DH10B、DY380、化250、DY330和GS1783等）保持低拷贝的自我复制，同时可借助Red同 源重组系统对病毒基因进行特异性的基因敲除、替换、插入等一系列的分子生物学的改造。
[0047] (3)、本发明中的带有BAC序列的HCMV Han-BAC重组病毒在免疫巧光实验（IFA) 中证明了该重组病毒相对于野生型HCMV Han病毒在抗原抗体反应后不但其感光灵敏性和 特异性没有减弱，反而由于本身的巧光蛋白使得该病毒在IFA的实验中光强度更高，在显 微镜下更利于视野的捕捉。巧光效率高，巧光色泽与背景色泽对比鲜明，标记后能保持生物 学活性和免疫活性，标记方法简单、快速，安全无毒。
[0048] (4)、本发明中的带有细菌人工染色的HCMV Han-BAC重组病毒在核酸印迹实验中 证明了该重组病毒相对于野生型HCMV Han病毒多加了一段约9化大小的BAC基因序列，且 插入方向和位点都符合预期，但是在蛋白质印迹中的敏感度、效果、生物活性和与抗体结合 的特异性等发面没有任何的弱化。
[0049] 此外，该重组病毒相对于野生型来说，由于能够在细菌内永久的保存，使得HCMV Han-BAC病毒基因组的自然突变几率大大降低，生物学特性保存的较为完整，在周期极长的 条件下几乎不会对病毒性状和基因组产生影响任何实质性的影响，运是野生型HCMV Han病 毒所无法比拟的。
【附图说明】
[0050] 为了更清楚地说明本发明【具体实施方式】或现有技术中的技术方案，下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的 附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前 提下，还可W根据运些附图获得其它的附图。
[005。 图1为本发明提供的PUS-F5质粒（即带有GFP的BAC载体）的构建示意图；
[0052] 图2为本发明提供的带有细菌人工染色的HCMV Han-BAC感染性克隆（人巨细胞 病毒感染性克隆）的构建示意图；
[0053] 图3为本发明提供的HCMV Han-BAC感染性克隆的筛选和鉴定结果图；
[0054] 其中，A :HCMV Han-BAC 单克隆的 PCR 鉴定巧：HCMV Han-BAC 的 Southern Blot 鉴 定；C :HCMV Han-BAC重组病毒的捶救；D :HCMV Han-BAC重组病毒的同步生长曲线；
[0055] 图4为本发明提供的HCMV Han-BAC感染性克隆感染肥L细胞后的间接免疫巧光 图；
[0056] 图5为本发明提供的HCMV Han-BAC感染性克隆感染肥L细胞后的蛋白质印迹图；
[0057] 图6为野生型及本发明提供的感染性克隆的HCMV(WT HCMV Han和HCMV Han-BAC) 在药物更昔洛韦（GCV)处理后对病毒生长的影响结果图；
[0058] 其中，A为HCMV Han在GCV处理后相对于未加 GCV的病毒滴度的生长曲线对比图； B ;HCMV Han-BAC在GCV处理后相对于未加 GCV的病毒滴度的生长曲线对比图。
【具体实施方式】
[0059] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行 清楚、完整的描述，基于本发明中的【具体实施方式】，本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0060] 实施例一
[0061] 人巨细胞病毒感染性克隆的构建方法，包括W下步骤：
[0062] 将绿色巧光蛋白基因插入到BAC中，得到带有GFP的BAC载体；W野生型HCMV Han 病毒基因组为模板，PCR分别扩增左右同源重组臂，将扩增产物分别依次经过纯化、酶切后 再进行连接和PCR扩增，得到同源重组臂全长序列；将所述同源重组臂全长序列与所述带 有GFP的BAC载体进行连接后通过转化W及线性化处理，得到带有HCMV Han同源序列的线 性化质粒；用野生型的HCMV Han病毒感染肥L细胞，再利用所述带有HCMV Han同源序列 的线性化质粒转染感染后的肥L细胞，并经过传代培养后提取感染后肥L细胞且带有HCMV 化n-BAC重组病毒基因组的DNA ;将所述带有肥MV化n-BAC重组病毒基因组的DNA电转化 至感受态细胞DHlOB中，并在含有氯霉素抗性培养基培养，得到人巨细胞病毒感染性克隆。
[0063] 为了更加易于实现人巨细胞病毒感染性克隆的构建，本发明还在上述实施例一的 基础之上提供了实施例二和=，实施例二和=为实施例一的进一步限定和增加：
[0064] 实施例二
[0065] 本实施例人巨细胞病毒感染性克隆的构建方法包括W下步骤：
[006引 a)、将mini-F质粒去掉Ba恤I位点，得到PUS-F2质粒；将PUS-F2质粒的其中一个 限制性酶切位点ClaI去除，得到PUS-F3质粒；
[0067] b)、W去除BamHI位点的质粒PGET007为模板，扩增绿色巧光蛋白基因，并将该扩 增产物克隆至pGEM-T载体中，得到pGEM-GFP质粒；
[0068] C)、W pGEM-GFP质粒为模板，继续扩增带有限制性酶切位点ClaI和HindIII位点 的GFP片段，并克隆至pUS-F3质粒中，得到pUS-F4质粒；
[0069] d)、将PUS-F4质粒的两个ClaI位点之间的化ndIII位点去除，得到PUS-F5质粒。
[0070] e)、提取野生型肥MV化n病毒基因组DNA ;
[0071] 用野生型的HCMV Han病毒W感染复数（M(H)为1的量感染肥L细胞，感染 12小时后，刮下细胞，离屯、收集沉淀，用solution I缓冲液清洗一遍，再用另外添加 proteinaseK 化 25mg/ml)、十二烷基硫酸钢（SDS) (0. 6% )和化Cl (IM)的 solution I 缓冲 液化5ml)重悬细胞沉淀，50°C解育2小时，继续加入RNase I，并于50°C解育1小时，最后 再用酪氯仿进行反复抽提获得细胞基因组沉淀，干燥后用一定量的无菌去离子水重悬核酸 沉淀，运样溶解后的DNA中含有大量的野生型的肥MV化n病毒基因组DNA。
[0072] f)、W野生型HCMV Han病毒基因组DNA为模板，W如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO: 2 所示序列为引物，扩增位于HCMV Han基因组中US区域的左臂序列，W如SEQ ID N0:3和 SEQ ID N0:4所示序列为引物，扩增位于肥MV Han基因组中US区域的左臂序列，分别得到 左臂片段和右臂片段；
[0073] 具体的，提取的野生型HCMV Han病毒基因组为模板PCR分别扩增左右同源重组 臂，其中左臂化-arm)序列位于HCMV Han基因组中US区域的No. 197937-199536,序列全长 leOObp，右臂序列（R-arm)位于基因组中US区域的No. 205037-207036,序列全长2000bp。 其中，SEQ ID NO: I-SEQ ID NO:4的序列分别为：
[00巧]g)、将左臂片段和右臂片段分别进行纯化和酶切后进行连接反应，并W该连接产 物为模板进行PCR，得到同源重组臂全长序列。
[0076] 具体的，用1%琼脂糖凝胶电泳分别纯化左右同源臂片段。将纯化后的左右臂片段 分别用限制性内切酶BamHI进行单酶切，酶切体系的总体积为50 y 1，DNA量为2 y g，37°C 水浴反应4小时后，再用1%琼脂糖凝胶电泳进行纯化，所得酶切纯化后的左右同源臂序列 直接进行连接反应。
[0077] 连接反应总体积为10 y 1，5 y 1 2x连接缓冲液，5 y 1纯化后的左右臂DNA(两臂 DNA浓度比为1:1)，16°C反应4小时后，PCR扩增左臂和右臂的全长序列化+R arms),用1% 琼脂糖凝胶电泳纯化同源重组臂全长序列化+R arms),得