aq 聚合酶酶，无菌去离子水 补足总体积至 20 y 1。扩增条件为：94°C 2min，（94°C 30s，55°C 30s，72°C 3min)30 个循环， 72°C 10min，16°C lOmin。然后把PCR片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化。测定DNA的浓度，接 着用pGEM-T载体试剂盒（购于日本TaKaRa公司）中的pGEM-T载体0. 5 y 1，纯化回收所得 的GFP PCR片段4. 5 y 1，连接缓冲液5 y 1，混合后于16°C反应4小时，之后将连接产物转化 大肠杆菌感受态D册a (本实验室所有）中。
[0106] 挑取菌落并进行PCR鉴定，PCR程序如上，鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒 进行测序，测序正确的质粒命名为pGEM-GFP。
[0107] (15)、PCR扩增带有ClaI和化ndIII位点的GFP片段克隆转移至PUS-F3质粒中 形成pUS-F4质粒
[0108] WpGEM-GFP质粒为模板，PCR扩增绿色巧光蛋白基因。PCR鉴定的反应体系如步 骤（14)。
[0109] 所用引物为 5 ' -ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3 ' 和 5 ' -TTTGTATAGTTCATCCATGC-3 '。扩 增条件为：94°C 2min，（94°C 30s，55°C 30s，72°C 3min)30 个循环，72°C 10min，16°C lOmin。 之后纯化PCR片段并测定DNA浓度。接着用限制性内切酶ClaI分别酶切纯化后的GFP片 段和PUS-F3载体。酶切体系为20ul，包括ClaI酶2yl和DNA 2yg，d地2〇补齐至20^1。 37°C水浴4小时后胶回收纯化。
[0110] 最后用酶切后的PUS-F3质粒载体0. 5 y 1，GFP PCR片段4. 5 y 1，连接缓冲液5 y 1， 于16°C混合反应4小时。后将连接产物转化大肠杆菌感受态D册a。挑取菌落并进行PCR 鉴定，PCR程序如上所述，鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质 粒命名为PUS-F4。
[011U (16)、在PUS-F4质粒的基础上去掉除2个ClaI位点之间的HindIII位点，最终命 名为pUS-巧
[0112] 参照步骤（11)所述方法将PUS-F4质粒W HindIII酶切、SlNuclease消化、沉淀 重悬连接后的环状质粒即为去掉酶切位点HindIII的即为pUS-巧质粒。具体的pUS-巧质 粒的构建过程请参考图1。
[0113] 2)带有细菌人工染色体基因的人巨细胞病毒临床株（HCMV Han)的感染性克隆 化CMV Han-BAC)的制备
[0114] (21)、HCMV Han病毒基因组的提取
[0115] 该步骤与实施例二的步骤e) -致，在此不作寶述。
[0116] (22)、带有HCMV Han同源序列的细菌人工染色体的构建
[0117] W野生型HCMV Han病毒基因组为模板PCR分别扩增左右同源重组臂，其中左臂 a-arm)序列位于HCMV Han基因组（GenBank:KJ426589. 1)US 区域中的No. 197937-199536， 序列全长leOObp，右臂序列（R-arm)位于基因组US区域中的No. 205037-207036,序列全长 2000bp。
[om] PCR反应体系为：10Xbuffer 2yl，dNTP 0. 4yl，上下游引物各0. 2yl(左臂F 引物-5' -CGGGATCCGGGCAGTGGGAGTTCATGTT-3'，左臂 R 引物 5' -CCCAAGCTTAGCGAGAGCACTGG CAGGGG-3';右臂 F 引物 5' -CCCAAGCTTGAGGGTACTGGGGCAGACGG-3'，右臂 R 引物-5' -CGGGAT CCGTCCCCCGCACCCTAAAACA-3,），PrimeStar 聚合酶：0. 2 y 1，d地2〇 补足至总体积 20 y 1。扩 增条件为：94°C 2min，（94°C 30s，55°C 30s，72°C 3min)30 个循环，72°C 10min，16°C lOmin。
[0119] 用1%琼脂糖凝胶电泳纯化试剂盒纯化左右同源重组臂序列。将纯化后的左右臂 序列分别用限制性内切酶BamHI进行单酶切，酶切体系的总体积为50 y 1，包括DNA 2 y邑。 37°C水浴反应4小时后，用1%琼脂糖凝胶电泳进行纯化，所得酶切纯化后的左右同源臂 序列直接进行连接反应，其反应总体积为10 y 1，包括5 y 1连接缓冲液和5 y 1的左右臂 序列纯化产物（浓度比为1:1)，16°C反应4小时后，PCR扩增左臂和右臂的全长序列化+R arms)，PCR反应体系为：10Xbuffer2yl，dNTP0.4yl，左臂F引物巧'-CGGGATCCGGGCAGT GGGAGTTCATGTT-3，）0. 2 y 1，右臂 R 引物巧，-CGGGATCCGTCCCCCGCACCCTAAAACA-3，）0. 2 y 1， PrimeStar聚合酶0. 2 y l，d地2〇补足至总体积为20 y 1。扩增条件为：94°C 2min，（94°C 30s， 55°C 30s，72°C 3min)30 个循环，72°C 10min，16°C lOmin。
[0120] 用1%琼脂糖凝胶电泳纯化同源重组臂全长序列化+R arms)。最后将此纯化后的 L+R arms序列和环状的PUS-F5载体分别用HindIII酶化酶切体系的总体积为50 y 1，含 DNA 2yg，37°C水浴反应4小时后，再用1%琼脂糖凝胶电泳分别进行纯化，所得纯化后的 载体pUS-巧和L+R arms序列进行连接反应，其反应总体积为10 y 1，包括5 y 1连接缓冲 液，4. 5 y 1的L+R arms酶切纯化产物和0. 5 y 1的载体PUS-F5酶切纯化产物，16°C反应4 小时后直接转化感受态E. COli DN5 a中37°C过夜培养，鉴定及测序，成功后的带有左右臂 同源序列的PUS-F5质粒命名为PUS-F6。
[0121] (23)、pUS-ro 的线性化
[0122] 该步骤与步骤i) 一致，在此不作寶述。
[0123] (24)、带有细菌人工染色体基因的HCMV Han病毒感染性克隆的构建
[0124] 具体的，该步骤包括W下几个步骤：
[01巧](241)、线性化pUS-ro质粒在肥L细胞中的转染
[0126] 与实施例二中的步骤j) 一致，在此不做寶述。
[0127] (242)、HCMV Han 病毒的感染
[012引与实施例二中的步骤k) 一致，在此不做寶述。
[0129] (243)、感染后细胞基因组的提取
[0130] 该步骤与实施例二中步骤1) 一致，在此不做寶述。具体的，上述带有细菌人工染 色的HCMV Han-BAC感染性克隆的构建，其示意图如图2所示。
[0131] (244)、HCMV Han-BAC感染性克隆的初步筛选和鉴定
[0132] 与实施例二中步骤m)的区别在于，在该步骤中，在鉴定不同的序列的时（包括 UL31、UL33、UL：M、UL37、UL44、UL69、UL82、UL97、IE1、IE2、浊和 US29)，所用的引物及扩增 片段如下表所示：
[0133]
[0134] 245)、HCMV Han-BAC感染性克隆活病毒的捶救
[0135] 246)、HCMV Han-BAC重组病毒的活力测定
[0136] 上述步骤245)和246)与实施例二中的活病毒的捶救和活力测定、W及HCMV Han-BAC重组病毒的活力测定的步骤一致，在此不作寶述。筛选和鉴定结果如图3所示，在 图 3 中，A :HCMV Han-BAC单克隆的 PCR鉴定结果；B :HCMV Han-BAC 的 Southern Blot 鉴定； C :HCMV Han-BAC重组病毒的捶救；D为肥MV Han-BAC重组病毒的同步生长曲线。通过图3 可知，该感染性克隆，含有所有测试且分布于整个基因组不同区域的HCMV基因。
[0137] 应用例1
[013引将本发明实施例3构建成的带有细菌人工染色体基因的HCMV Han的感染性克隆 应用到间接免疫巧光法中，具体为：
[0139] 在100皿2的培养皿中均匀放置3-5片圆形玻片，然后将肥L铺满整个培养皿底部， 形成单细胞层，在37 °C，5 %的C〇2培养条件下，待细胞密度度达到80 %时，用HCMV Han-BAC 重组病毒按MOI = 1感染肥L细胞。
[0140] 同步设置阴性对照。37°C、5% C〇2培养箱中吸附化后，将培养皿中的病毒液全部 换掉，重新加入完全MEM培养基培养。感染72小时后，用綴子小屯、将圆形玻片取出，准备进 行IFA实验。操作步骤是：先用3%的甲醒固定贴在圆形玻片的肥L细胞，大约15分钟后， 用PBS洗涂2遍，再用1 %的TritonX-IOO解育5分钟，用PBS洗涂3遍，接着用含30 %的封 闭液封闭15分钟，之后解育一抗（病毒蛋白的IEl，浊，UL44和pp65单克隆抗体）。用PBS 反复洗掉未结合的抗体后，再用标记的第二抗体与化echst分别解育，使之形成抗原-单克 隆抗体-标记的第二抗体（羊抗鼠 IgG)复合物，解育10分钟，用PBS洗干净，然后干燥、封 片后最后使用正置巧光显微镜分别观察巧光。
[0141] 结果见图4,图4中显示了病毒感染前后细胞的形态，及细胞核和病毒蛋白IE1/2/ 化44/PP65/浊的染色结果，感染前细胞形态正常呈梭型，感染后细胞变圆，而细胞核染色结 果显示细胞核变小变圆，感染病毒之后病毒蛋白（IE12AJL44/pp65/浊）被标记显示巧光， 而未感染的则不会被标记。
[0142] 应用例2<