专利名称：一种神经元分离和培养的改进型方法
一种神经元分离和培养的改进型方法技术领域
本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种神经元体外分离和培养方法。
研究背景神经元，又称神经细胞，是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元是具有长突起的细胞，它由细胞体和细胞突起构成。在长的轴突上套有一层鞘，组成神经纤维，它的末端的细小分支叫做神经末梢。细胞体位于脑、脊髓和神经节中，细胞突起可延伸至全身各器官和组织中。细胞体是细胞含核的部分，其形状大小有很大差别，直径约4 120微米。核大而圆，位于细胞中央，染色质少，核仁明显。细胞质内有斑块状的核外染色质(旧称尼尔小体)，还有许多神经元纤维。细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突。每个神经元可以有一或多个树突，可以接受刺激并将兴奋传入细胞体。每个神经元只有一个轴突，可以把兴奋从胞体传送到另一个神经元或其他组织，如肌肉或腺体。
在神经系统发育过程中，中枢神经系统经历了细胞数量和体积的增长及细胞连接形成改变过程。分化的神经元一经产生，便不可能再进行分裂，神经元的正常分化过程一旦受损，即有可能影响突触联系的正常建立等一系列过程。对神经元损伤的机制及其防治， 一直是人们感兴趣的问题。随着对神经元功能的了解，它已逐渐成为神经生物学领域研究的热点。但由于在体内神经元与其它神经细胞以及其他组织细胞混杂存在，妨碍了其生物学功能的研究及应用。因此需要对神经元进行体外培养并纯化，才能深入了解其形态结构和生物学功能。
由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂增殖，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以 存活和生长，其胞体伸出许多又长又细的突起，在取材过程中容易损伤其突起。在胚胎发育过程中，神经系统发育较早。出生后，神经系统发育基本完成， 很多神经元此时已经长出突起，取材于该时期的脑组织对神经元的损伤较大。胚胎时期的神经元分化程度较低，体外生存能力强，该时期神经元之间的联系较少，取材过程中造成的不可逆伤害较小，易于成功培养。
体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。目前神经元的培养分为有血清培养和无血清培养，有血清培养提供细胞培养所必须的营养成分，促进细胞增殖和 DNA的合成，但也为神经胶质细胞、成纤维细胞、神经干细胞等其它神经细胞提供了丰富的营养，但也使得培养的神经元很难分离开。无血清培养技术不利于有丝分裂细胞的生长，可防止非神经元过度增殖，可提高培养的神经元纯度。采用无血清培养能通过添加某些成分， 而且可选择性地促进和控制神经元的生长。
目前尚未见有关神经元体外分离或培养方法的专利文献公开，虽然神经元采用常规细胞培养技术，能够在一定程度上达到培养的目的，但存在着与神经胶质细胞，成纤维细胞等其它杂细胞很难分离以及体外培养存活困难等问题，不能满足细胞实验的要求。本室参照国内外培养分离神经元的方法。根据多年的实验研究，改进了大脑皮质神经元的体外培养方法，建立了一种稳定、可靠的获得神经元的方法，为了解神经元的结构与功能，阐明其在脑血管疾病、神经系统疾病中的作用研究提供成功的实验模型。发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，改进当前体外分离和培养神经元的方法，使之简单易行，培养获得的神经元生长良好，纯度高，产量大，可满足神经科学研究中细胞生物学实验的需求。
采用以下方案来实现本发明的目的。一种体外分离和培养神经元的方法，含有大脑皮质组织分离、组织细胞捣碎后胰酶消化、筛网过滤离心、细胞原代培养等4个实验步骤。此外还可包含神经元鉴定的步骤。
大脑皮质组织分离孕鼠颈椎脱白致死，无菌条件下取出胚胎，然后在无菌条件下取胎鼠两侧大脑半球放入培养皿中，剥离并去除皮层血管组织和软脑膜。
优选方案为孕15-17天的大鼠颈椎脱臼致死，75%乙醇腹部消毒，剪刀剪开腹部至两侧，无菌条件下取出串珠状胚胎，放入盛有IXPBS的培养皿中，然后在无菌超净台内冰床上取胎鼠两侧大脑半球放入盛有IXPBS的培养皿中，用眼科镊夹取动物双侧大脑皮质置于盛有IXPBS的培养皿内，仔细剥离并去除皮层血管组织和软脑膜，再将大脑皮质移至另一个盛有IXPBS的培养皿内。
需要注意的是解剖过程一定要全程在冰上进行。目的在于从你处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的降低到O度，有助于提高神经元的存活率。另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要2小时，如果样品多。一定要注意多准备冰袋子。确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行(消化步骤除外)。这样可以大大提高神经元细胞的存活率。在解剖大脑时候，有人用hank’s液，在其中解剖。但即使 是O度，神经元还是在进行着很大程度代谢。所以，hank’s液的无糖环境很不利。建议使用DMEM-高糖或DMEM-F12与马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，血清可以抑制神经凋亡。这其中还有一个问题，就是DMEM培养液会在空气中变碱性。国外有的实验室用L-15 培养液来浸泡解剖过程中的脑，因为L-15不会再空气中变碱性。
组织细胞捣碎后胰酶消化无菌条件下，捣碎脑组织呈糜状，然后加入低浓度的胰酶，置37°C培养箱消化5-30分钟。然后用神经元培养首液终止消化，并继续加入首液轻轻吹打，直至将组织全部吹散，形成细胞悬液。
优选方案为无菌条件下，用眼科镊夹碎脑组织呈糜状，加入浓度O. 1-0. 125%胰酶2ml，37°C培养箱消化10分钟。用神经元培养首液终止消化后，继续加入神经元培养首液轻轻吹打，直至将组织全部吹散，形成细胞悬液。
需要注意的是除了采用胰酶以外，还可以采用木瓜酶联合DNA酶的方法进行消化。木瓜酶是消化过后，存活率最高的酶。木瓜酶配成l_3mg/ml浓度进行消化，同时加入浓度为l_3mg/ml的DNA酶，加入量各l_2ml，消化时间为20-30分钟。DNA酶的作用是，消化掉破裂细胞的DNA，避免了释放的DNA和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化。木瓜酶和DNA酶在使用时需要现配现用。
本方案提到的神经元培养首液配方为胎牛血清|ιο%_
权利要求
1.一种神经元分离和培养方法，其包括以下步骤大脑皮质组织分离；组织细胞捣碎后酶消化；筛网过滤并离心的步骤；以及细胞原代培养；其特征在于细胞原代培养的步骤为将已离心的上清液弃去，用2ml神经元培养首液重悬放入培养皿中，调整细胞密度为 5X 105个/ml，接种于预先用多聚赖氨酸包被的24孔或96孔培养板内进行培养；培养12小时后换液改用神经元培养维持液，首次全量换液；以后每2天换维持液I次,每次半量换液；细胞生长5天可进行鉴定，6天后用于实验。
2.根据权利要求1所述的一种神经元分离和培养方法，其特征在于首次全量换液体积为24孔板每次500 μ I/孔或96孔板100 μ I/孔。
3.根据权利要求1-2所述的一种神经元分离和培养方法，其特征在于所述大脑皮质组织分离步骤为将孕15-17天的大鼠颈椎脱臼致死，75%乙醇腹部消毒，剪刀剪开腹部至两侧，无菌条件下取出串珠状胚胎，放入盛有IXPBS的培养皿中，然后在无菌超净台内冰床上取胎鼠两侧大脑半球放入盛有IXPBS的培养皿中，用眼科镊夹取动物双侧大脑皮质置于盛有 IXPBS的培养皿内，仔细剥离并去除皮层血管组织和软脑膜，再将大脑皮质移至另一个盛有IXPBS的培养皿内。
4.根据权利要求1-2所述的一种神经元分离和培养方法，其特征在于所述组织细胞捣碎后酶消化步骤为无菌条件下，用眼科镊夹碎脑组织呈糜状，加入浓度O. 1-0. 125%胰酶2ml，37°C培养箱消化10分钟；用神经元培养首液终止消化后，继续加入神经元培养首液轻轻吹打，直至将组织全部吹散，形成细胞悬液。
5.根据权利要求1所述的一种神经元分离和培养方法，其特征在于组织细胞捣碎后酶消化的步骤，采用木瓜酶联合DNA酶的方法进行消化。
6.根据权利要求5所述的一种神经元分离和培养方法，其特征在于组织细胞捣碎后酶消化的步骤加入的木瓜酶浓度为l_3mg/ml，加入量为l_2ml。
7.根据权利要求5所述的一种神经元分离和培养方法，其特征在于组织细胞捣碎后酶消化的步骤加入的DNA酶浓度为l-3mg/ml，加入量为l_2ml。
8.根据权利要求5所述的一种神经元分离和培养方法，其特征在于组织细胞捣碎后酶消化的步骤消化时间为20-30分钟。
全文摘要
一种神经元分离和培养的改进型方法，含有大脑皮质组织分离、组织细胞捣碎后胰酶消化、筛网过滤离心、细胞原代培养等4个实验步骤。此外还可包含神经元鉴定的步骤。本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，改进当前体外分离和培养神经元的方法，使之简单易行，培养获得的神经元生长良好，纯度高，产量大，可满足神经科学研究中细胞生物学实验的需求。
文档编号C12N5/0793GK102994451SQ20121056551
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者黄柏胜, 邬力祥, 罗奇志, 韩仰, 罗洁 申请人:黄柏胜