治疗运动神经元疾病的疫苗和方法

专利名称:治疗运动神经元疾病的疫苗和方法
治疗运动神经元疾病的疫苗和方法
本申请是申请日为2002年12月5日，申请号为02827701. 5的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及用于治疗运动神经元病(MND)，特别是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的疫苗和方法。
运动神经元病(MND)是一组侵犯脑(上级运动神经元)和脊髓(下级运动神经元)运动神经元的相关疾病。运动神经元是神经细胞，脑沿着它以电冲动的形式向肌肉发出指令。运动神经元的变性导致肌肉无力和消瘦。这通常最初发生在手或腿，一些肌肉群受到的影响多于其它的肌肉群。
有几种MND的分类。在MND最多的病例中，上级和下级运动神经元都发生变性。这种情况被称为肌萎缩性侧索硬化(ALS)，也被称为LouGehrig’ s病，其特点是肌无力、僵硬和(肌纤维)自发性收缩(肌束颤动)。也有不常见的类型，其中观察到更有选择性的上级运动神经元(如原发性侧索硬化，PLS)变性或者下级运动神经元(如进行性肌萎缩，PMA) 变性。进行性延髓麻痹(PBP或延髓发病)是一种以下咽、咀嚼和构音困难开始的ALS，并且侵犯大约25%的ALS患者。
在这些MND的类型之间有相当多的重叠。患PMA的人最后累及上级运动神经元， 在PMA和ALS两者中一些人可能最终经历不同程度的构音和下咽困难(延髓发作的ALS或 PMA)。
ALS是以中枢神经系统(CNS)中控制随意肌肉运动的神经细胞的逐渐变性为特点的慢性、进行性的神经变性疾病。通常在疾病开始的2-3年到10年内，运动神经元的进行性丧失导致渐进性的骨骼肌萎缩和不可逆的死亡。起初最常见在手部观察到肌无力和萎缩以及前角细胞功能障碍的体征，而在脚部较少观察到。开始发病的部分是随机的，并且进展是不对称的。仅在美国当前有30，000人患有ALS，并且每年诊断到大约8，000个新发病例。
ALS以散发性(SALS)和家族性(FALS)的类型发生(Mulder等，1986 ；Munsat, 1989)。原发性危险因子多半还不知道，然而所有ALS患者中5-10%是家族性的(FALS)。已经发现大约所有家族性类型中的20%患者在21号染色体上编码Cu/Si超氧化物歧化酶的 1型基因中有突变(R0sen等，1993 ；Brown, 19%)。SOD是催化超氧阴离子转化成过氧化氢的酶，因此SOD能够保护细胞不受这些有毒自由基的有害影响。由于没有发现在酶活性、多肽的半衰期和抗蛋白酶解与开始发病的年龄和人疾病进展的速度之间的相关性(见Julien， 2001的综述)，因此似乎不同SOD突变体的毒性不应归于自由基清除活性的降低。表达各种SODl突变体的转基因小鼠发展了运动神经元疾病，因而构成公认的用于检验ALS和其它运动神经元治疗的动物模型。
最近，两个独立的科学家小组已经鉴定了一种新的ALS基因(Hadano等，2001 ； Yang等，2001)。这种被称为ALS2的新基因定位在2号染色体上，编码名为alsin的蛋白。 在患有青少年型肌萎缩性侧索硬化(JALS)，也称为ALS2的人和患有青少年型原发性侧索硬化(JPLS)的人中新的ALS2基因都发生了突变。染色体不同区域的突变与不同的运动神经元疾病有关。具体地，在患有ALS的人中发现了一个区域中的突变，而在患有JPLS的人中发现了在两个其它区域中有突变。将来，带有这些突变的转基因小鼠必将构成检验ALS 治疗的进一步模型。
在最近的10年中已经进行了许多用来理解该病的病因学、预后和进展的研究。除了承认在导致其进展的环境方面它是一种多因素疾病外，还没有取得一致的意见，而病因学仍然不清楚。
很显然，现在在许多其它慢性和急性神经变性疾病中发现了有助于ALS进展的许多因素。这些因素包括氧化应激、兴奋性毒性、营养支持的丧失和离子的不平衡。这些年来试图象在其它慢性和急性神经变性疾病中那样，通过阻断细胞毒性的不同介体来终止ALS 的进展。这些临床试验中的大部分得到了否定的结果(Turner等，2001)。
氧化应激是以能够导致运动神经元死亡的自由基的积聚为特征的。自由基通过 “氧化”而损伤细胞膜的组分、蛋白质或遗传物质。当SOD酶功能有障碍时可能会产生这些自由基，或者由于如在一些家族性ALS患者中发生遗传变异，或者由于神经细胞的化学环境的原因，或者由于谷氨酸兴奋性毒性或其它原因可能产生这些自由基。许多ALS患者服用辅酶Z QlO和维生素E以中和自由基。
谷氨酸是象癫痫持续状态、脑缺血、创伤性脑损伤、ALS、亨廷顿舞蹈病、山黧豆中毒和阿耳茨海默病(Alzheimer's disease)等急性和慢性变性疾病中最常见的毒性介质之一(Pitt等，2000)。谷氨酸是人CNS中主要的兴奋性神经递质。L-谷氨酸存在于大多数突触中，并且能够表现出双重活性在正常的功能中作为必需的神经递质起关键作用，但是当超过其生理水平时就变得有毒了。
对于脊髓运动神经元，通过星形细胞中存在的谷氨酸转运蛋白EAAT2在突触活动之后迅速清除谷氨酸。在ALS患者的脑组织中发现了 EAAT2活性和蛋白水平的降低 (Rothstein等，1992)。这会导致细胞外谷氨酸浓度的升高以及运动神经元的死亡。临床上，谷氨酸释放抑制剂利鲁唑对人和转基因小鼠两者疾病病程的有益影响而导致成为公认的ALS的药物治疗。然而，在中和毒性影响方面，它可能干扰作为普遍存在的CNS神经递质的谷氨酸的生理功能。
这些年来一直争论ALS中免疫因子、细胞和分子的作用。如在许多其它神经变性病中一样，一直争论炎症是否与疾病传播有关以及免疫抑制药物在ALS中建议使用的量。 而且，在许多ALS患者中观察到ALS与抗神经节苷脂抗体存在的相关性，这使一些研究者建议ALS是一种自体免疫性疾病。然而，还没有提供结论性的证据来支持这种假说。
在本发明者的实验室中，最近观察到在由于机械(轴突切开术)或生物化学(谷氨酸、氧化性应激)损害所导致的神经变性的情况下，免疫系统起着关键性的作用。因而， 已经发现识别神经系统(NS)抗原的活化的T细胞促进神经再生或提供神经保护。参考PCT 公开号No. WO 99/60021的申请，其全部内容在此引入作为参考。更具体地，在部分挤压破碎的视神经大鼠模型(Moalem等，1999)和在脊髓损伤的大鼠模型(Hauben等，2000)中显示MBP反应性T细胞具有神经保护作用。直到最近，一直认为免疫系统排斥免疫细胞参与神经系统的修复。非常令人惊奇的是，发现NS特异的活化T细胞可用于促进神经再生或保护神经系统组织避免由于CNS或周围神经系统(PNS)损伤或疾病所导致的损害之后可能发生的第二次变性。
本发明者进而观察到在CNS中，应激状态利用适应性的免疫反应来处理应激，并且这种反应受遗传控制。因而，在视神经的挤压损伤或者向玻璃体内注射毒性剂量的谷氨酸之后，显示在抗中枢神经系统(CNS)自身免疫病的成年小鼠或大鼠品系中视网膜神经节细胞的存活率高于易感品系的两倍以上。发现这种差异可归因于有益的自身免疫T细胞反应，中枢神经系统损伤后该反应在抗性品系中被自发地诱发，但不在易感品系中诱发。因而，假如调控得好的话，当引起抗其自身的T细胞反应时由于这种损伤而导致的神经元的存活率将会较高。换句话说，已经证实，引起保护性的自身免疫反应来对抗应激状态以便保护动物避免损伤的后果。进一步观察到，在调控这种反应的能力被损害的动物或在缺乏成熟T细胞的动物(由于在出生时进行了胸腺切除)中，处理应激状态的能力降低了。结果， 在这些动物中CNS损伤后神经元的存活率显著低于具有设置了保护性自身免疫T细胞介导反应的有效机制的动物中神经元的存活率(Kip nis等，2001)。
本发明人进一步发现，在创伤性CNS损伤后用与自身蛋白相像的非致病性合成共聚物，如共聚物1 (Cop 1或格拉默)，一种由四种氨基酸酪氨酸-谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸构成的无规共聚物(在下文称作“Cop 1”)，和聚(谷氨酸、酪氨酸)(在下文称作 “PoluYE”)以及通过由此活化的T细胞的免疫能够用于提高保护性自身免疫，由此进一步减少创伤导致的损害，而且能够进一步保护CNS避免受谷氨酸的毒性作用。参考相应于WO 01/93893，都是2001年1月22日申请的我们在先的美国专利申请Nos. 09/756，301 和09/765，644，就好像这里已经完全公开了一样，其以整体形式在此引入作为参考，其公开了 Cop 1、Cop 1-相关肽和多肽以及由此活化的T细胞保护CNS细胞避免受谷氨酸的毒性作用(USSN 09/756, 301)以及防止或抑制CNS或PNS中神经元的变性或者促进神经的再生(USSN 09/765，644)。进一步参考我们于2001年6月28日申请的在先的美国专利申请 No. 09/893，344，就好像这里已经完全公开了一样，其整体在此引入作为参考，其公开了以前称为polyGT，也称为PolyYE的聚_Glu50Tyr50共聚物以及由此活化的T细胞，保护CNS 细胞避免谷氨酸毒性，而且也防止或抑制CNS或PNS中神经元的变性或促进神经的再生。具体地，在所述的申请中显示，用Cop-I免疫或用聚(谷氨酸、酪氨酸)免疫的小鼠视神经纤维中，存活的视网膜神经节细胞的数量显著高于用PBS注射的小鼠。
公认的并且目前可以有效用于ALS治疗的唯一药物是利鲁唑(2-氨基_6-(三氟甲氧基)苯并噻唑)，一种被认为是谷氨酸释放的阻断剂，其似乎在这种情况下可能通过抑制CNS中谷氨酸的传递而具有一些减少痉挛的效果。其以片剂形式口服。利鲁唑不能治愈疾病或者改善症状。其通过延长患者约3个月的生命而在ALS患者中产生中等至显著的效果，但是不改善肌肉的强度或神经功能。
非常理想的是进一步提供治疗包括ALS在内的运动神经元病的药物。
本申请的本部分或任意其它部分中对任何参考文献的引用或确认都不应认为是承认该文献是对本发明有用的现有技术。
发明概述
根据本发明，现已发现用Cop 1免疫能够保护用作ALS模型的过度表达的人SOD 1的转基因小鼠和面神经轴突切开术后的小鼠都避免运动神经元变性。这个发现以及Cop 1和PolyYE都能够有效地保护视网膜神经节细胞避免受谷氨酸毒性作用的事实表明，这些共聚物适合于治疗运动神经元病，特别是ALS。
申请在一个方面中，本发明涉及用于减少患运动神经元病(MND)患者疾病进展、用于防止运动神经元变性和/或防止受谷氨酸毒性作用的方法，包括用含有活性试剂的疫苗免疫所述的患者，其中该活性试剂从由Cop 1、与Cpol相关的肽、与Cop 1-相关的多肽和 PolyYE构成的组中选出。
运动神经元病(MND)是任何侵犯脑和脊髓中运动神经元的疾病，包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、家族性(FALS)和散发性(SALS) ALS、原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩 (PMA)、进行性延髓麻痹(PBP或延髓开始发病)及其结合的形式，如延髓开始发病的ALS和延髓开始发病的PMA。
在一个实施方案中，本发明的方法包括也用利鲁唑或任何其它适合于治疗MND，特别是ALS的药物进行治疗。
在另一个方面中，本发明提供用于减少运动神经元病(MND)，特别是ALS中的疾病进展、防止在运动神经元变性和/或防止受谷氨酸毒性作用的疫苗，包括从由Cop 1、与 Cpol相关的肽、与Cop 1-相关的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)构成的组中选出的活性试剂。
在进一步的方面中，本发明涉及从由Cop 1、与Cpol相关的肽、与Cop 1_相关的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)构成的组中选出的活性试剂用于制备用于减少运动神经元病 (MND)，特别是ALS中的疾病进展、防止运动神经元变性和/或防止受谷氨酸毒性作用的疫苗中的用途。
活性试剂可以不用任何佐剂施用，或者其可以在适合人临床使用的佐剂中被乳化。适合人临床使用的佐剂选自氢氧化铝、氢氧化铝凝胶和羟基磷酸铝。在优选的实施方案中，疫苗助剂是具有酸性等电点和Al P之比为1 1(这里称作铝-磷酸)的无定形
羟基磷酸铝。
在一个优选的实施方案中，本发明疫苗的活性试剂是Cop 1。在另一个优选的实施方案中，活性试剂是聚(谷氨酸、酪氨酸)。
另外，疫苗可以以包括施用利鲁唑或任何其它适合治疗ALS的药物的药方使用。
附图的简要说明

图1显示用不含佐剂的Cop 1或PolyYE进行免疫来保护小鼠视网膜神经节细胞 (RGCs)避免受谷氨酸的毒性作用。
图2A-B显示用含Cop 1 (2A)或PolyYE (2B)的佐剂(CFA)进行免疫来保护小鼠 RGCs避免受谷氨酸的毒性作用。
图3A-B显示用PolyYE (图3A)或Cop 1 (图3B)进行的免疫对青光眼眼内压(IOP) 模型中RGCs存活率的影响。
图4A-4B描绘了过度表达人SODl突变体的转基因小鼠(在下文中称“ALS小鼠”) 进行肌肉强度测试的结果。图4A显示用乳化于铝-磷酸中的Cop 1免疫的ALS小鼠(1、2 和4号小鼠)和非免疫的转基因小鼠(3、5和6号小鼠)每周在旋转的垂直杆上的平均悬挂时间(秒)。图4B描绘了 3只用含Copl的铝-磷酸免疫的ALS小鼠(黑色柱)与3只非免疫的转基因小鼠(对照，灰色柱)平均悬挂时间(基线的百分率％)的比较。为了比较疾病进展率，使所有动物肌肉无力开始的时间(时间为0) —致，使每个动物悬挂时间到其疾病开始发作前的自身基线时间标准化(基线时间_100%)。该附图描绘了在疾病进展后的几周里每组的悬挂时间的平均值士SEM。
图5显示用含Cop 1的铝-磷酸免疫的ALS小鼠(黑色正方形)保存的体重与非免疫小鼠(灰色菱形)的比较。
图6是显示用含Cop 1的CFA免疫的ALS小鼠的期望寿命的曲线图。脊髓运动神经元的进行性丧失导致麻痹。没有接种的对照(n = 15)在一个或更多的肢体中出现麻痹， 并且在211 士7(平均值士SD)天龄时死亡。经Cop 1处理的小鼠存活了 263士8天。
图7显示用含Cop 1的CFA免疫的ALS小鼠和用利鲁唑处理的ALS小鼠的期望寿命。利鲁唑处理的和用Cop 1免疫的ALS小鼠显示分别比没有接种的对照小鼠高9%和 25%。
图8显示在Cop 1处理的和未处理的ALS小鼠中在指定的时间点所测量的平均旋转活动。允许小鼠抓紧和握住下端带有小环的垂直金属线(直径2mm)。通过计算机化的系统分别记录它们的活动并且每日进行评价。为了统计学的评价，将旋转活动归一化到每只小鼠在从第40天到第60天的平均活动。以平均值士平均值的标准误差(SEM)表示数据。 在下列时间段观察到处理的和未处理的小鼠之间有显著的差异第12天和第20天之间(P < 0. 058)、第21天和第24天之间(P < 0. 0079)以及第25天和第28天之间(P < 0. 0017)。
图9A-D显示在面神经轴突切开术之后通过给小鼠施用Cop 1来挽救运动神经元。轴突切开术后8周，用Cop-I免疫接种的小鼠的脑干中荧光金标记的运动神经元的数量(图9D)显著多于在用含PBS的CFA注射的组中所获得的数量(图9B)。用Cop-I处理没有影响未受到损伤的面神经核中的运动神经元的数量(图9A，9C)。用含PBS的CFA免疫的对照没有保护性效果。
本发明的详述
本发明提供用于减少患有MND，特别是ALS的患者疾病进展、防止运动神经变性、 延长生命和改善生命质量、和/或避免受谷氨酸毒性作用的疫苗和方法，其包括用含有活性试剂的疫苗免疫所述的患者，其中该活性试剂从由Copl、Cpol相关肽、Copl相关多肽或 PolyYE构成的组中选出，不使用佐剂或者在适合人临床使用的佐剂中乳化。
正如这里使用的，术语“运动神经元” ("motor neurons”和“motonneurons”)、术语“PolyYE”和“聚(谷氨酸、酪氨酸)”以及术语“Copl”和“共聚物1”，每对都是可以互换使用的。
为了本发明的目的，“Cop 1或者与Cop 1相关的肽或多肽”意味着包括任何肽或多肽，包括无规共聚物，它们与髓鞘碱性蛋白(MBP)有功能性交叉反应并能在抗原呈递中与MBP竞争MHC-II类。
本发明的疫苗可能含有作为活性试剂的无规共聚物，该共聚物含合适量的带正电荷的氨基酸如赖氨酸或精氨酸，与带负电荷的氨基酸(优选较少量)如谷氨酸或天冬氨酸的组合，可任选地与作为填充物的不带电的中性氨基酸如丙氨酸或甘氨酸组合，并可任选地与适于赋予共聚物免疫原性的氨基酸如像酪氨酸或色氨酸之类的芳香族氨基酸组合。这种疫苗可包括公开于WO 00/05250中的那些共聚物中的任何一种，其全部内容在此引入作为参考。
更具体地，用于本发明的疫苗含有至少一种共聚物，它选自含有一种氨基酸的无规共聚物，该氨基酸选自以下各组中至少三组中的每一种(a)赖氨酸和精氨酸；(b)谷氨酸和天冬氨酸；(c)丙氨酸和甘氨酸；和(d)酪氨酸和色氨酸。
用于本发明的共聚物可由L-或D-氨基酸或者其混合物组成。本领域技术人员已知，L-氨基酸存在于大多数的天然蛋白中。然而，D-氨基酸有商业供应并可取代用于制备本发明中使用的三元共聚物和其它共聚物的一些或所有氨基酸。本发明考虑使用同时含 D-和L-氨基酸的共聚物，以及基本上由L-或由D-氨基酸组成的共聚物。
在本发明的一个实施方案中，共聚物含有四种不同的氨基酸，每种氨基酸来自(a) 到(d)组中不同的组。根据该实施方案，优选的共聚物包含丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸的组合，其带有净总正电荷且分子量为约2，000-40, OOODa,优选约2，000-13, OOODa,最优选地是平均分子量为约4，700-13, OOODa的共聚物1。优选的分子量范围和制备优选形式 Cop 1的方法描述于美国专利No. 5，800，808中，其全部内容以整体形式在此引作参考。显而易见这只是以实例的方式给出，并且如果与以上一般标准一致，那么疫苗的成分及成分的相对比例都可以变化。因而，共聚物可以是约15到约100个氨基酸长度的多肽，优选约 40到约80，优选具有属名格拉默乙酸盐的共聚物。

在另一个实施方案中，共聚物含有三种不同的氨基酸，每种来自(a)到(d)组的三组中的不同组。这些共聚物在此称为三元共聚物。
在一个实施方案中，用于本发明的三元共聚物含有酪氨酸、丙氨酸和赖氨酸，以下称为YAK。这些三元共聚物中氨基酸的平均摩尔分数可以变化。例如，酪氨酸的摩尔分数可以是约0. 005-0. 250 ；丙氨酸的摩尔分数可以是约0. 3-0. 6 ；以及赖氨酸的摩尔分数可以是约0. 1-0. 5。平均分子量为2，000-40, OOODa，优选为约3，000-35, OOODa0在更优选的实施方案中，平均分子量为约5，000-25，OOODa。可以用精氨酸取代赖氨酸、用甘氨酸取代丙氨酸、和/或用色氨酸取代酪氨酸。
在另一个实施方案中，用于本发明的三元共聚物含有酪氨酸、谷氨酸和赖氨酸，以下称为YEK。这些三元共聚物中氨基酸的平均摩尔分数可以变化谷氨酸的摩尔分数可以是约0. 005-0. 300，酪氨酸的摩尔分数可以是约0. 005-0. 250，以及赖氨酸的摩尔分数可以是约0. 3-0. 7。平均分子量为2，000-40, OOODa，优选为约3，000-35, OOODa0在一个更优选的实施方案中，平均分子量为约5，000-25，OOODa。可以用天冬氨酸取代谷氨酸、用精氨酸取代赖氨酸，和/或用色氨酸取代酪氨酸。
在另一个实施方案中，用于本发明的三元共聚物含有赖氨酸、谷氨酸和丙氨酸，以下称为ΚΕΑ。这些多肽中氨基酸的平均摩尔分数也可以变化。例如，谷氨酸的摩尔分数可以是约0. 005-0. 300，丙氨酸的摩尔分数可以是约0. 005-0. 600，以及赖氨酸的摩尔分数可以是约0. 2-0. 7。平均分子量是2，000-40, OOODa，优选为约3，000-35, OOODa0在一个更优选的实施方案中，平均分子量是约5，000-25，OOODa。可以用天冬氨酸取代谷氨酸、用甘氨酸取代丙氨酸、和/或用精氨酸取代赖氨酸。
在另一个实施方案中，用于本发明的三元共聚物含有酪氨酸、谷氨酸和丙氨酸，以下称为YEA。这些多肽中氨基酸的平均摩尔分数可以变化。例如，酪氨酸的摩尔分数可以是约0. 005-0. 250，谷氨酸的摩尔分数可以是约0. 005-0. 300，以及丙氨酸的摩尔分数可以是约0. 005-0. 800。平均分子量在2，000-40，OOODa之间，优选在约3，000-35，OOODa之间。 在一个更优选的实施方案中，平均分子量是约5，000-25，OOODa0可以用色氨酸取代酪氨酸、 用天冬氨酸取代谷氨酸、和/或用甘氨酸取代丙氨酸。
在更优选的实施方案中，这些三元共聚物中氨基酸的摩尔分数大约是共聚物1优选的摩尔分数。共聚物1中氨基酸的摩尔分数是谷氨酸约0. 14，丙氨酸约0. 43，酪氨酸约0. 10以及赖氨酸约0. 34。最优选的共聚物1的平均分子量为约5，000-9，OOODa0如果进行一个或多个下面的取代，此处公开的疫苗中共聚物1的活性预期仍保留天冬氨酸取代谷氨酸、甘氨酸取代丙氨酸、精氨酸取代赖氨酸和色氨酸取代酪氨酸。
更优选的谷氨酸、丙氨酸和酪氨酸的三元共聚物或YEA，其单体摩尔比是约0. 21 比约0. 65比约0. 14。
更优选的谷氨酸、丙氨酸和赖氨酸的三元共聚物或KEA，其单体摩尔比是约0. 15 比约0. 48比约0. 36。
更优选的谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸的三元共聚物或YEK，其单体摩尔比是约0. 26 比约0. 16比约0. 58。
更优选的酪氨酸、丙氨酸和赖氨酸的三元共聚物或YAK，其单体摩尔比是约0. 10 比约0. 54比约0. 35。
可通过本领域技术人员可用的任何方法制备三元共聚物。例如，可在缩合条件下用期望摩尔比的氨基酸溶液制备三元共聚物，或者通过固相合成方法制造。缩合条件包括合适的温度、PH和溶剂条件，供一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合形成肽键。缩合剂，例如二环己基碳化二亚胺，可用于促进肽键的形成。封闭基团可用于保护官能团，如侧链部分以及一些氨基或羧基，避免不期望的副反应。
例如，可使用在美国专利3，849，650中公开的方法，其中酪氨酸、丙氨酸、Y -苄基谷氨酸以及N- ε -三氟乙酰赖氨酸的N-羧基酐在室温下无水二氧六环中用二乙胺作为引发剂进行聚合。用含溴化氢的冰醋酸可使谷氨酸的Y-羧基去封闭。用1摩尔哌啶除去赖氨酸的三氟乙酰基。本领域技术人员容易理解，通过选择性去除与谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸或赖氨酸中任何一项有关的反应，可对方法进行调整以制造含期望氨基酸，也即共聚物1 中四个氨基酸中的三个的肽和多肽。对此应用目的，术语“环境温度”和“室温”意指约20 到约的温度范围。
多肽合成期间或制造出三元共聚物以后，可调节三元共聚物的分子量。在多肽合成期间调节分子量，要调节合成条件或氨基酸的量，使多肽达到期望的大致长度时停止合成。合成之后，期望分子量的多肽可通过任何可用的大小选择方法，如在分子量选择柱或凝胶上的多肽层析，然后收集期望的分子量范围。本发明的多肽也可被部分水解以除去高分子量的部分，例如通过酸或酶的水解，然后纯化以除去酸或酶。
在一个实施方案中，可用以下方法制备期望分子量的三元共聚物，其中包括将受保护的多肽与氢溴酸反应以形成具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽。通过一次或多次试验反应确定反应的持续时间和反应温度。试验反应期间，改变时间和温度并测定给定批次试验多肽的分子量范围。将提供最佳分子量范围的多肽批次所使用的试验条件用于批量生产。因而，可通过以下方法制造具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽，其中包括按试验反应已确定的反应时间和温度将受保护的多肽与氢溴酸反应。接着用哌啶水溶液进一步处理具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽，以形成具有期望分子量的低毒性多肽。
在优选的实施方案中，使给定批次的受保护的多肽测试样品在温度约20-28°C下与氢溴酸持续反应约10-50小时。通过进行几次试验反应确定该批次的最佳条件。例如， 在一个实施方案中，使保护多肽在温度约26°C下与氢溴酸持续反应约17小时。
因为Copl与跟MS-缔合的HLA-DR分子的结合基序是已知的(Fridkis-Hareli等，1999)，很容易制备确定序列的多肽并按Fridkis-Hareli等(1999)所述的方法测试其与 HLA-DR分子的肽结合沟的结合。这种肽的实例公开于WO 005M9，其全部内容在此引作参考。在所述申请中具体公开的肽中的32个在下表1中列出。预期这种肽和其它类似肽具有类似Cop 1的活性。这种肽和其它类似肽也被认为在与Cop 1相关的肽或多肽的定义范围内，并且其用途被认为是本发明的一部分。
根据本发明的“与Cop 1相关的多肽”的定义被解释为包括其它合成的氨基酸共聚物，例如Fridkis-Hareli等2002描述的无规的四种氨基酸的共聚物，作为多发性硬化治疗的候选共聚物，即含有苯丙氨酸、谷氨酸、丙氨酸和赖氨酸(聚FEAK)或酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和赖氨酸(聚YFAK)的共聚物(14-，35-和50-聚体)，以及任何其它发现可被认为类似于Cop 1和PolyYE的通用抗原的类似共聚物。
权利要求
1.Cop1在制备用于在肌萎缩性侧索硬化(ALQ患者中减少疾病进展、防止运动神经变性和避免受谷氨酸的毒性作用的疫苗中的用途，其中所述的疫苗包含Cop 1但不包含佐剂。
2.根据权利要求
1的用途，其中每月至少施用一次所述的疫苗。
3.根据权利要求
1或2的用途，其中每2-3个月至少施用一次所述的疫苗。
4.根据权利要求
1或2的用途，其中所述的疫苗与另一种用于治疗ALS的药物一起给药。
5.根据权利要求
4的用途，其中所述的另一种用于治疗ALS的药物是利鲁唑。
专利摘要
一种用于减少运动神经元疾病(MND)，特别是肌萎缩性侧索硬化(ALS)患者的疾病进展、和/或防止运动神经变性、和/或避免受谷氨酸的毒性作用的疫苗，包括一种活性试剂，其中该活性试剂从由Cop 1、与Cop-1相关的肽、与Cop-1相关的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)构成的组中选出。所述的活性试剂优选为Cop 1或聚(谷氨酸、酪氨酸)，并且可以与或不与佐剂一起使用。
文档编号A61P21/00GKCN102151330SQ201110056639
公开日2011年8月17日 申请日期2002年12月5日
发明者E·约勒斯, M·埃森巴赫-施瓦茨 申请人:耶达研究及发展有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan