子得到的培养基。神 经元诱导培养基是向Neurobasal培养基中添加N2、B27、GlutaMAX、氨苄青霉素/链霉素 (全部购于Lifetechnologies)和bFGF(Origene)得到的培养基，N2在神经元诱导培养 基中的质量含量为1%，B27在神经元诱导培养基中的质量含量为2%，GlutaMAX在神经元 诱导培养基中的质量含量为l%，bFGF在神经元诱导培养基中的含量为100ng/ml。为了降 低I-BET151的毒性，促进细胞存活及重编程，可以在诱导早期（从0到4或者8天）加入 ROCK抑制剂Y27632 (2yM)或者Fasudil(2yM)。在化学诱导20天后，这个阶段观察到细 胞发出神经丝，诱导培养基换成成熟培养基向所述神经元诱导培养基加bFGF、Forskolin， BDNF(Brain-derivedneurotrophicfactor)(Peprotech公司产品）和GDNF(Glialcell line-derivedneurotrophicfactor)(Peprotech公司产品）得到的培养基，bFGF在所述 成熟培养基中的含量为50ng/ml，Forskolin在所述成熟培养基中的含量为10yM，BDNF在 所述成熟培养基中的含量为20ng/ml，GDNF在所述成熟培养基中的含量为20ng/ml。诱导 至20天的细胞用0. 25%的胰酶消化或者用枪头吹下来并接种到原代分离的星形胶质细胞 上进行共培养以进一步促进诱导细胞成熟。加入小分子的神经元诱导培养基在诱导过程中 每3到4天换一次液。对于细胞增殖鉴定实验，BrdU(5-brom〇-2-deoxyuridine)按终浓度 10yM加入培养基。
[0161] 2. 1 第一轮化学筛选（Ascll+1)
[0162] 多西环素（doxycycline，dox)诱导的Ascii慢病毒载体的制备和转染按照文献 (Vierbuchen，etal.，Nature, 463:1035-1041 (2010))进行。为激活外源Ascii的表达，在 感染16-20小时后在成纤维细胞培养基中添加2yg/mldox(Sigma-Aldrich)。48小时后， 细胞被转移到加入小分子的神经元诱导培养基，用于筛选的小分子单独加入神经元诱导培 养基。在诱导期间，每3-4天换液。用于第一轮化学筛选的小分子库如表1所示，部分小分 子信息如表2所示。
[0163] 表1、开发重编程小分子使用的化学小分子库
[0164]
[0165] 表2、用于重编程诱导的小分子信息
[0166]
[0168]注：ISX9 =N-Cyclopropyl-5-(2-thienyl)-3-isoxazolecarboxamide
[0169]SB431542 = 4-[4_(1，3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-lH-imidazol-2-yljbenzamide
[0170]I-CBP112 = 1_[7_(3,4-Dimethoxyphenyl)-9_[[ (3S)-l-methylpiperidin-3-yl]methoxy]_2, 3, 4, 5_tetrahydr〇-l，4-benzoxazepin-4-yl]propan_l-〇ne;
[0171]JQ1 = (6S)-4-(4-Chlorophenyl)-2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno[3, 2-f][1, 2, 4] triazolo[4, 3_a][1, 4]diazepine-6-aceticacid1, 1-dimethylethylester
[0172]CHIR99021 ( "C"）= [6-[[2-[[4-(2, 4_Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-lH-imid azol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile]
[0173] 2. 2、第二轮化学筛选（FICS+1)进一步寻找到可以促进化学重编程的小分子 I-BET151
[0174] 为了将不涉及外源遗传操作的纯化学重编程过程变得更高效，使其成为一个更稳 定的诱导体系，进行了第二轮的化学筛选，寻找可以促进神经元细胞重编程以及功能成熟 的其他小分子。在这个筛选中，通过观察神经突起发生的变化检测所添加的小分子的影响。 此外，通过免疫组化等鉴定方法（如TUJ1免疫染色）进行确认。成纤维细胞接种于12孔 培养板，成纤维细胞被种植于12孔板中，连同已经加了FICS的基础小分子的培养基，候选 的筛选用小分子被逐一单孔加入到已种植的成纤维细胞中，FICS+DMS0被作为此筛选策略 的阴性对照，在16天的诱导期，培养基每3-4天换液，显著增加神经突起的发生的小分子为 候选化合物。通过筛选约1500个小分子，发现了一个小分子I-BET151可以有效增强细胞 重编程的比例（可诱导约90%的TUJ1阳性细胞）以及神经突起的发生，采用免疫组化染色 进一步证实。拥有圆形立体的胞体结构、以及至少比胞体长三倍的神经突起的细胞被记作 TUJ1阳性细胞。共选取了 10个20倍视野来定量诱导的TUJ1阳性细胞数。
[0175] 3、免疫荧光分析
[0176] 细胞用PBS两次后用4 %多聚甲醛溶液室温固定20min。随后，细胞用 PBS洗 2 次，然后用 0. 25 %PBST(PBS加 0. 25 %TritonX-100)通透和用 3 % 驴血 清（DS)在37 °C孵育1小时。圈出染色区域，分别加入稀释的第一抗体，在4 °C孵 育过夜。接下来，细胞用PBS洗三次，在添加3 %驴血清和第二抗体的PBS中室温 下孵育1小时。需要时，细胞的细胞核用DAPI(RocheMolecularBiochemicals) 染色.T所用的第一抗体如下：rabbitanti_TUJl(Covance，l:500)，mouse anti-TUJl(SantaCruz，1:100)，mouseanti-MAP2(Sigma-Aldrich，1: 200)，rabbit anti-NF-H(Abeam, 1:500),mouseanti-NeuN(Mi11ipore，1:50)，rabbitanti-GABA(Si gma-Aldrich，1:10, 000)，rabbitanti-vGLUTl(SynapticSystems，1:5, 000)，rabbit anti-COLlAl(Abeam，1:500)，mouseanti-BrdU(SantaCruz，1:50)，goatanti_S0X2(Santa Cruz，1:100)，rabbitanti_PAX6 (Covance，1:250)，rabbitanti-GFAP(Dako, 1:400)，mouse anti_A2B5(Millipore，1:200)，goatanti-S0X10(SantaCruz，1:20)，andrabbit anti_P75(Millipore，1:100)?所用的第二抗体如下：FITCandTRITC-conjugated secondaryantibodies(JacksonImmunoResearch)andAlexaFluor647-conjugated secondaryantibodies(LifeTechnologies)。
[0177] 4、实时荧光定量PCR
[0178]使用QiagenRNeasyPlusminikit提取总RNA，使用TransScriptOne-step gDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix(TransGenBiotech)反转录成cDNAd实时定 量PCR使用带有PowerSYBRGreenPCRMasterMix(2X)的 7300 实时PCR系统（Applied Biosystems)进行D引物列于表3〇
[0179] 表3.用于实时荧光定量PCR和单细胞分析的引物
[0180]
[0181] 基因表达量是用AACT方法分析。所有的结果用P-actin表达量进行归一化处 理，将未诱导的成纤维细胞的值设置为1。实验重复两次。
[0182] 5、流式细胞分析
[0183]TAU-EGFP阳性细胞率使用FACSCalibur流式细胞仪（BectonDickinson)测定， 用Flowjo分析流式细胞仪检测数据。tdTomato阳性细胞用MoFlocellsorter(Dako Cytomation)进行分选。
[0184] 6、单细胞基因表达分析
[0185]按照（Tang,etal.，Nat.Protoc.，5:516:535 (2010))获得单细胞转录物，用 PowerSYBR?GreenMasterMixkit(LifeTechnologies)制备单细胞的cDNA。按照步 骤4的方法进行实时荧光定量PCR。
[0186] 数据采用PCR系统相关的软件进行分析，根据熔解曲线评估每个反应的特异性。 计算循环阈值（cyclethreshold，CT)确定单细胞基因表达谱值。引物列于表3。
[0187] 7、原代神经细胞培养和二次铺被诱导神经细胞
[0188] 使用新生1天的野生型C57小鼠制备原代神经元细胞。小鼠被处死后，大脑被取 出放在已经预冷的生理盐水中。在预冷的HBSS中切割大脑海马区（9. 5g/LHanks'缓冲 盐，4. 2mMNaHC03, 10mMHEPES, 12mMMgS04, 7g/L葡萄糖，0? 3g/L牛血清白蛋白，0? 5%氨 苄青霉素/链霉素，用NaOH将pH调节到7. 4)。使用5ml0. 2 %的胰酶（Gibco,溶解于 消化液中）消化海马区组织2-3分钟，用lmg/ml胰酶终止剂（Sigma，溶解于HBSS)终止 消化反应。消化溶液包含：4. 2NaHC03, 25HEPES, 137NaCl, 5KC1,和 7Na2HP04(单位：mM)，用 NaOH将pH调到7. 4.消化后的细胞清洗三次后于1，OOOrpm离心10分钟。这些分离出的 神经元细胞被重悬于包含有2 %B27和2mM谷氨酰胺以及0. 5 %的双抗的Neurobasal培 养基（Invitrogen)中。总计1*106被铺被于已经预处理了 12. 5yg/ml的多聚-D-赖氨酸 (Sigma)并放置于6孔板中的玻片上。这些孔板被放置于37度，5%二氧化碳的培养箱中培 养，每三天换液一次。
[0189] 在培养了原代神经元和胶质细胞一个星期时间后，这些诱导神经元细胞被小心的 从培养皿中用枪头吹吸或胰酶消化的方法脱壁，被重新铺被到原代神经细胞上。在重新铺 被14到21天之间进行电生理检测和记录。
[0190] 8、RNA_Seq
[0191] 从成纤维细胞、CiNs(诱导48小时和19天的）以及原代神经元中分离总mRNA。 使用IlluminamRNA-seqPrepKit构建RNA测序文库。通过IlluminaHiSeq2000 对片 段和随机配对的200bp双末端文库进行测序。通过TopHat程序绘制转录组读取序列谱。 标准化的差异表达基因被检测到。用RPKM值来评估基因表达水平。通过Cluster3.0和 TreeView进行分级聚类。在散点图中，设两倍的变化为基因表达显著改变的阈值。通过 DAVID程序进行差异表达基因的G0分析，此方法同NatureProtoc.，4(1) : 44-57 (2009)中 所描述的一样。
[0192] 9、RNA-SeqGE0 序列号
[0193] 本研究中RNA-Seq数据的GE0序列号为GSE68715。
[0194] 10、电生理测试
[0195] 在全细胞膜片钳实验中，细胞外溶液为人工脑脊液（ACSF)，其中包含141mMNaCl， 2. 5mMKC1，1. 3mMMgCl2, 2. 4mMCaCl2,1. 25mMNaH2P04,10mM葡萄糖和 10mMHEPES，并用 NaOH调节pH至7. 4。玻璃吸量管微电极内液包含140mM葡萄糖酸钾，ImMCaCl2，10mMEGTA， 2mMMgCl2,10mMHEPES和5mMNa2ATP，并用K0H调节pH至7. 3。电极由P97电极拉制仪制 作，使得阻抗达到约5MW。膜片钳记录信息由EPC-10放大器收集，PathchMaster软件处理。 记录钠电流与钾电流时，细胞膜电位起初钳制在-80mV，然后以10mV的增幅从-80mV去极化 至+80mV，每个去极化电位持续时间为Is。采样时间与去极化间隔时间分别为2ms与2s。 河豚毒素（TTX，10mM)溶解于细胞外溶液中，由ALA-VM4阀箱施于细胞。从诱导神经元洗脱 后，检测内向快速失活电流是否为钠电流。在电流钳实验中，超极化电流被注射到诱导神 经元细胞中，使其膜电位维持在-70mV左右。诱发动作电位的阶跃电流之间间隔为3s。细 胞被钳制在OpA以记录静息膜电位。电流钳实验中，采样频率为25kHz。为了记录自发性 兴奋性突触后电流（sEPSCs)与自发性抑制性突触后电流（sIPSCs)，诱导细胞分别被钳制 在-70mV(接近氯离子反转电位）和OmV。采样频率为20kHz。
[0196]二、结果
[0197]1、筛选可诱导神经命运的小分子化合物
[0198] 为了找出可诱导神经命运的小分子，开展了第一轮化学筛选，在之前的研究中，有 三个转录因子组合（Ascll、Brn2和Mytll)被证明可以诱导小鼠的成纤维细胞转变成神经 元，其中，Ascii是诱导神经命运的主宰基因，而Brn2和Mytll作为辅助因子可以增强神经 命运的转变（Vierbuchenetal.，Nature, 463:1035-1041 (2010)).。没有Brn2 和Mytll， Ascii单独诱导神经元的效率很低（Vierbuchenetal.，Nature, 463:1035-1041 (2010))。 因此，首先进行了一轮化学筛选寻找可以增强Ascii诱导效果的小分子（图1中A)。该筛 选在来自杂合TauEGFP基因敲入小鼠的小鼠胚胎皮肤来源的成纤维细胞（(MEFs))中进行， 该MEFs转染有表达Ascii的病毒载体（Tuckeretal.，NatNeurosci. ,4:29-37(2001); Vierbuchenetal. ,Nature, 463:1035-1041(2010))〇
[0199] 通过筛选大约5000个小分子（表1)，发现Forskolin、ISX9、CHIR99021和 SB431542这4个小分子分别都能增强Ascl1的诱导效率，使TAUEGFP/TUJ1双阳性的神经细 胞数量提高至少两倍（图1中B)。而Ascii和这4个小分子结合在一起使用可进一步增强 诱导神经元的产生效率（比Ascii单独作用效率高10倍以上）（图1中B和C)。因此，确 定了这4个小分子的组合可以稳定促进基于外源因子Ascii的从小鼠成纤维细胞到神经元 命运的转变。
[0200] 为考察外源的"主宰基因"对于诱导神经元命运是否是非必需的，仅用小分子 对起始的成纤维细胞进行诱导（图1中D)。有意思的是，在没有外源Ascii的情况下， "FICS"(Forskolin，ISX9，CHIR99021和SB431542)这4个小分子的组合足以诱导神经元命 运的产生，只是诱导时间加长了（21天），所获得的细胞大于30%都是TUJ1阳性的并且具 有基本的神经元样的细胞形态（图1中D和F;表2)。每个小分子单独作用并不能诱导出 神经元样的细胞，表明他们之间的协同作用非常重要（图1中F)。这些发现表明这一新的 小分子组合可以起始成纤维细胞向神经元命运的转变。
[0201] 2、进一步寻找到可以促进化学重编程的小分子I-BET151
[0202] 为了增强不涉及外源遗传操作的纯化学重编程过程，使其成为一个更稳定的诱导 体系，用来自杂合TauEGFP基因敲入小鼠的小鼠胚胎皮肤来源的成纤维细胞进行了第二轮 的化学筛选，寻找可以促进神经元细胞重编程以及功能成熟的其他小分子。根据需要，这种 理想的小分子应该能促进诱导神经元的神经突起的发生，并最好使细胞获得一个更复杂的 形态学结构（图3中A)(Vierbuchenetal.，2010)。通过在"FICS+1"的体系上筛选了大 概1500个小分子（图3中A)，发现了一个小分子I-BET151可以有效增强细胞重编程的比 例（可诱导约90%的TUJ1阳性细胞）以及神经突起的发生（图3中B和表2)。此外，在 这一新的"FICSB"组合中，SB431542⑶虽然可以增强诱导神经元的存活以及神经突起的 发生，但对于神经元的获得并不是必需的（图3中C和图2中A)。在之后的实验中都使用 "FICB"这一小分子组合，并对每个小分子的使用浓度都进一步做了优化（图2中B)。在FICB诱导16-20天后，可获得90%以上的TUJ1阳性细胞（其中71 %为TAUEGFP/TUJ1双阳 性，30%为NEUN/TUJ1双阳性），这些细胞有大量的神经突起（图3中B)。FICB诱导的细胞 共表达很多神经元特异的标记基因，包括MAP2和NF-H(图3中D)。此外，FICB诱导的细胞 看起来是既有兴奋性神经元又有抑制性神经元的混杂群体，因为VGLUT1阳性以及GABA阳 性的这两种细胞都可以被检测到（图3中D)。综合在一起，这些结果表明通过使用FICB可 以实现神经元样细胞的化学重编程诱导。
[0203] 3、化学小分子诱导神经元（CiNs)基因表达谱相似于功能神经元
[0204] 为了进一步促进诱导的神经样细胞功能成熟，参考文献报道的做法，将步骤2中 FICB诱导的细胞与来自新生小鼠的原代胶质细胞或原代神经元在促成熟培养基（向上述 神经元诱导培养基加bFGF、Forskolin，BDNF(Brain-derivedneurotrophicfactor)和 GDNF(Glialcellline-derivedneurotrophicfactor)得到的培养基，bFGF在所述促成 熟培养基中的含量为50ng/ml，Forskolin在所述促成熟培养基中的含量为10yM，BDNF在 所述促成熟培养基中的含量为20ng/ml，GDNF在所述促成熟培养基中的含量为20ng/ml)中 共培养（Chandaetal.，2014;Vierbuchenetal.，2010)。在促成熟培养 14-21 天后，诱 导细胞进一步成熟而伸出更多的神经突起（图3中E)。将经过这个过程后所最终诱导出 来的神经元称为化学诱导的神经元细胞（CiNs)(图3中F)。为了排除混杂的多细胞群对 基因表达谱结果的噪音影响，从单细胞水平对CiNs的基因表达谱进行了分析，并进一步确 定诱导神经元所属的功能亚型。实验证明多个典型的泛-神经元与功能突触蛋白共表达在 同一个细胞内。在CiN细胞群中，兴奋性与抑制性神经元均可以被检测到。大部分（约占 45. 8% )的CiNs为表达vGlut的兴奋性谷氨酰胺能神经元，而表达Gad67的抑制性神经元 约占20.