8% (图4中A)。不仅如此，诱导细胞不仅建立起神经元特异的转录谱，同时成纤 维细胞特异基因，如Fspl、Collal的表达也被沉默（图3中G和图4中A)。
[0205] 4、CiNs具备的神经元电生理功能特征
[0206] 为了检测CiNs的电生理功能特性，对步骤3的CiNs进行了全细胞膜片钳记录实 验（图5中A)。化学诱导14-20天的CiNs细胞膜去极化后，电流钳取具有显著细胞突起 的CiNs细胞检测，能够记录到动作电位（35. 0%，n= 20)(图5中B;表4)。同时，电压钳 记录到快速非活化内向及外向电流，证明CiNs细胞膜表面电压依赖的钾离子及钠离子通 道开放（图5中C;表4)。此外，将CiNs与单层培养的原代胶质细胞或神经元共培养后， CiNs细胞膜的神经元功能特性显著增强（53. 8%，n= 39)(图5中D和E;表5)。自发的 兴奋性突触后电流也被检测到（47. 6%，n= 21)(图5中F和图4中B;表5)。兴奋性突 触后电流可以被受体特异的拮抗剂，如6-氰基-7-硝基喹喔啉-2, 3-二酮（CNQX)和2-氨 基-5-磷酰基戊酸酯（AP5)，所抑制（图5中F)。以上实验结果证明CiNs具有神经元细胞 膜的功能特性，并且在与原代胶质细胞或神经元共培养后，CiNs细胞之间或与原代神经元 之间能够形成突触连接和通讯。
[0207] 表4.未经共培养的CiNs电生理特性
[0208]
[0209]
[0210] 注：Rm:输入阻抗；Cm:膜电容；RMP:静息膜电位；APthreshold:动作电位阈值； APamp:动作电位峰度；Ina-max:最大钠电流峰值。所有数据为均值+/-标准误。
[0211] 表5.经原代胶质细胞或神经元共培养的CiNs电生理特性
[0212]
[0213] 注：所有数据为均值+/_标准误。
[0214] 5、细胞谱系追踪证明化学重编程诱导成纤维细胞转变为神经元
[0215] 为了证明化学重编程得到的神经元是由成纤维细胞转变而来，利用Cre-LoxP细 胞谱系追踪系统来跟踪表达成纤维细胞特异基因，Fspl，的细胞的命运转变（Bhowmicket al.，2004;Iwanoetal.，2002;Madisenetal.，2010;Strutzetal.，1995)(图 6 中A) 〇 由TdTomato焚光蛋白标记的细胞同时表达另一种典型成纤维细胞蛋白，C0L1A1，从而进一 步证明被标记细胞为成纤维细胞（图6中B和C)。在经过化学诱导后（用上述FICB培养 基培养），TdTomato阳性细胞发出大量神经元样细胞突起（图6中D)。结果表明TdTomato 阳性细胞可以通过化学重编程相对高效地被诱导为神经元（图6中E-?。以上结果为化学 重编程诱导成纤维细胞转变为神经元提供了直接的遗传学证据。
[0216] 6、CiNs的化学诱导过程不经过中间增殖阶段
[0217] 为了进一步理解化学重编程所经历的中间过程，在上述小分子诱导（用上述FICB 培养基进行培养）来自杂合TauEGFP基因敲入小鼠的小鼠胚胎皮肤来源的成纤维细胞进行 化学重编程的同时，用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU)处理细胞（图7中A)(Vierbuchenet al.，2010)。结果显示大部分（约80% )的TUJ1阳性细胞没有被BrdU标记（图7中B和 0,说明化学小分子诱导的细胞重编程并不经过中间细胞增殖阶段。
[0218] 7、在诱导CiNs产生的过程中，小分子直接激活了神经元关键的转录因子并打破 了成纤维细胞特异的基因调控网络
[0219] 为探究小分子如何在化学重编程中发挥作用，首先采用每个小分子的功能替代物 尝试将其替代来进一步研究他们的生物学活性。将来自杂合TauEGFP基因敲入小鼠的小 鼠胚胎皮肤来源的成纤维细胞分别在相应的小分子诱导培养基中按照上述方法进行培养 14-21天后检测TUJ1阳性细胞。结果表明Forskolin(cAMP激活剂）、CHIR99021 (GSK3抑制 剂）和I-BET151 (BET家族溴结构域抑制剂）分别可以被其他的cAMP激活剂、GSK3抑制剂 和BET抑制剂所替代（图4中C)，表明了他们在CiNs化学重编程诱导过程中的功能靶点。
[0220] 为了更好地理解细胞命运重编程的过程，用RNA-Seq分析来检测小分子处理48小 时以及19天后的细胞（用上述FICB培养基分别培养杂合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48 小时和19天）整体基因表达谱的变化。层次聚类的结果显示，诱导细胞和原代神经元聚类 很近，但和成纤维细胞很远（图8中A)。相应的，在选取了特异表达于成纤维细胞、CiNs和 原代神经元中的特异表达基因（表达量相差至少3倍）进行分析后（Caiazzoetal.，2011; Duetal.，2014)，发现这些特异表达基因的重叠情况在诱导后的细胞和原代神经元之间 呈现出一定的相似性（图8中B)。对比成纤维细胞，诱导19天后的细胞（神经元样细胞， CiNs)富集表达很多神经元特异的基因，包括参与神经元形态发生和维持、离子通道以及功 能突触组分的基因（Mapt、Gap43、Stmn3、Stmn4、Synl、Syp和Sytl)(图 8 中C和D)。此外， 成纤维细胞标志基因（Fap、Des、Twist2等）被下调了（图8中D)(Caiazzoetal.，2011; Kimetal.，2011)，表明CiNs丢失了原始的成纤维细胞特性。其中，以成纤维细胞中同一 基因的表达量为1，诱导19天后的细胞（神经元样细胞，CiNs)中的Fap，Des,Slug,Den,和 Twist2表达量分别是0、0. 04、0. 16、0. 003、0. 065。与此结果具有一致性的是，在进一步选 择了特异性表达基因（表达量高至少10倍）进行分析后，发现小分子诱导的细胞中成纤维 细胞基因表达网络被打破了，而神经元富集基因被上调了（图9中A)。化学诱导19天后， 60. 6%的神经元富集基因被上调了至少两倍，而只有1.8%被下调了。另外，80%的成纤维 细胞富集基因被下调了至少两倍，而只有6. 1 %被上调了，这表明化学诱导既可以整体性地 激活神经元富集基因，同时又能抑制成纤维细胞富集基因的表达（图9中A)。GO分析显示 化学诱导后上调的基因主要是参与突触传导、神经元分化、神经元发育、离子运输、轴突生 成、离子通道激活以及其他一些神经发育的关键生物学过程（图9中E)。下调的基因则主 要参与细胞周期、细胞分裂等生物学过程（图9中E)。综合在一起，这些结果表明小分子诱 导后的细胞获得了一个类似原代神经元的转录谱并打破了原始细胞的转录网络。
[0221] RT-qPCR分析结果表明神经命运决定基因的激活和成纤维细胞命运决定基因的下 调在小分子处理24小时之内就发生了（图9中B和C)。ISX9对于激活很多神经元特异基 因是必需的，包括像NeuroDl这种神经元主宰基因（matergenes)(图9中D)。在化学诱 导48小时后，NeuroDl和Ngn2这两个神经命运主宰基因的表达被显著上调了（图9中B和 E)，表明这两个转录因子可能参与了最初的化学诱导过程。有意思的是，Ascii这一最常被 用于诱导神经元命运转变的主宰转录因子在重编程早期并没有被激活（图9中B)。
[0222] 接下来，确定了每个小分子在调节这些内源性细胞命运决定基因的表达上的作 用。通过从组合中逐一撤除每个小分子，结果发现ISX9对于诱导关键神经基因是必需的 (图9中D-F)，表明这些小分子是通过一个基于ISX9的协同作用来诱导神经命运决定基因 表达的。有意思的是，实验结果表明I-BET151是抑制内源性成纤维细胞命运决定基因表达 谱的核心小分子（图9中F和G)，导致了成纤维细胞核心转录网络的有效破坏。这些结果 表明小分子通过协同性地激活目的细胞命运主宰基因并抑制起始细胞命运主宰基因的方 式对细胞命运进行了操控（图9中H)。
[0223]二、讨论
[0224] 本申请开发了一组全新的小分子，能够高效诱导从成纤维细胞向功能神经元细胞 跨胚层的直接谱系重编程。这些化学方法诱导的神经元细胞表现出原代神经元细胞的特 征，体现在表达神经细胞的基因表达谱以及具备相应的电生理功能。化学方法直接重编程 诱导神经元的发现和化学方法诱导细胞多能性的发现（Houetal.，2013)证明了体细胞命 运能够通过采用小分子化合物操纵细胞信号通路和内源的细胞命运决定网络的方式实现， 而整个过程不需要外源转基因或其它细胞命运特异的因子，比如microRNAs。
[0225] 虽然主宰转录因子被认为是细胞命运的主导决定因素（Xuetal.，2015)，本申请 展示了一组小分子化合物就足够激活这些基因的表达。就像在研究中展示的一样，ISX9, 一 种异恶唑，已经被报道通过激活的钙离子信号促进神经分化（Schneideretal.，2008)，在 本申请的诱导体系中对于在成纤维起始细胞上激活神经基因是必须的，这种激活效应被其 它小分子进一步加强（图9中D和E)。在诱导CiNs的重编程过程中，Ngn2和NeuroDl是 第一轮响应的基因，它们在小分子处理6小时内就被激活（9中B)。最近，Ngn2,在发育中 的神经命运决定性的原神经基因，已经被报道可以在辅助其它转录因子和小分子的情况下 从成纤维细胞直接诱导神经命运的发生（Bertrandetal.，2002;Liuetal.，2013)。其 它的神经基因（因子）也在接下来的化学重编程进程中被后续性激活（图9中A和图8中 D)。这些结果揭示了小分子主导的成纤维细胞向神经元细胞的直接重编程过程是一种层级 性的转录激活的过程，在这个过程中被小分子有效激活的细胞命运决定的基因可能起始和 稳定了自我调节的神经特异性转录网络环路，并进一步的激发了下游的调控基因的表达， 并建立神经元的功能特征。
[0226] 有趣的是，添加到小分子组合中的I-BET151显著的增进了重编程过程（图3中B 和C)，并且，进一步发现I-BET151是破坏成纤维细胞核心转录网络的核心小分子（图9中 F) <J-BET151被报道能够竞争性的结合到BET家族蛋白的BRD结构域（Sealetal.，2012)。 BRD4，BET家族蛋白之一，被报道能够特异性的结合到已激活（开放的）染色质区域和维持 细胞特异的基因表达谱BRD4(Wuetal，2015)。抑制BRD4可能破坏细胞命运的维持特性并 且改变起始细胞类型的表达谱（Chiangetal.，2014;DiMiccoetal.，2014)，这和本申 请发现的I-BET151在早期重编程过程中直接破坏了成纤维细胞特异的基因网络是一致的 (图9中D和F)。并且，本申请也和细胞命运改变的"彼此抑制模型"(Wangetal.，2011)，以 及已有的报道证明细胞命运能够通过敲除起始细胞类型的关键转录因子是一致的（Hanna etal.，2008)。并且，就在最近已发现BRD4通过结合到核心基因的超级增强子上来维持胚 胎干细胞（ESCs)的多能性，而抑制BRD4导致ESCs核心干性网络的丢失和促使向神经外胚 层的特化（DiMiccoetal.，2014)。作用于结合在超级增强子区的蛋白复合体或者相关激 活（维持）基因表达的因子上的小分子有可能将来能够成为一种广泛的擦除起始细胞身份 的擦除剂。
[0227]另外，虽然在本申请的研究中被鉴定出的小分子并非特异作用神经谱系的，但 是它们作用的信号通路已被报道涉及体外的神经定向分化，甚至包括体内的神经发育。 CHIR99021通常作为一个糖原合成酶激酶3B的抑制剂被用于诱导多能干细胞向神经分化 (Chambersetal.，2009)，并且这个小分子最近也被报道能够增进转录因子介导的神经直 接重编程（Ladewigetal.，2012)。Forskolin是一种独特的二砲腺苷酸环化酶激活剂， 并且通常被用于增加cAMP的水平（Seamonetal.，1981)，而cAMP反应结合元件（CREB)， Forskolin的一个下游祀点，已经被报道用来调节神经的特化和促进轴突的再生（Seamon etal.，1981;Dworkinetal.，2010)。这些在定向分化和谱系重编程上有双重功能的小分 子揭示了发育线索和发育相关的信号通路对于开发促进细胞谱系重编程也是很有教益的。
[0228] 总体而言，本申请揭示了一张新奇的再生医学蓝图，通过使用化学药剂来改变和 设计细胞身份。CiNs和CiPSCs(Houetal.，2013)两项研究的发现揭示了一种通过开发小 分子来操纵细胞命运的普适性策略，这种策略通过小分子替代已经报道的用于谱系重编程 的基因，激活目标细胞类型特异的主宰基因和沉默起始细胞类型的核心基因表达（实现细 胞命运的操纵）。考虑到这种方法未来潜在的治疗用途，可以预期未来通过采用当前已经建 立的这种化学重编程策略，来操纵人类细胞命运。在未来，本申请将可能引导新的其它小分 子的发现，这些新组建的小分子组合将可能实现直接重编程获得其它功能细胞类型，并有 可能帮助更精确的鉴定出决定细胞命运和重编程的新的因子。并且，本申请的研究可能对 体细胞命运的可塑性提供了新的观点，揭示出细胞命运的可塑性可能比以往认为的更加灵 活、更加具备可操作性。
[0229] 参考文献
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