一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法
【专利摘要】本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。本发明提供的复苏培养基的制备方法为：取羊膜间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。采用本发明羊膜间充质干细胞的复苏培养基进行羊膜间充质干细胞的复苏培养，有利于羊膜间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持羊膜间充质干细胞的生物学特征。
【专利说明】
一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法
技术领域
[0001]本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。【背景技术】
[0002]神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一类由于中枢神经系统被阻断，导致神经元细胞功能丧失，从而使中枢神经系统功能被抑制的疾病，具有发病率高、死亡率高的特点，主要包括:脑中风、脑外伤、脊髓性肌肉萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病以及帕金森病等。
[0003]神经退行性疾病均会引发较为严重的症状。其中，脑中风是因各种诱发因素引起脑内动脉狭窄、闭塞或破裂而造成急性脑血液循环障碍的一种疾病，临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征;脊髓性肌肉萎缩症是最常见的致死性神经肌肉疾病之一，是由于脊髓前角细胞运动神经元变性，导致患者近端肌肉对称性、进行性萎缩和无力， 最终导致呼吸衰竭甚至死亡的一种疾病;阿尔茨海默病是一种起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病，临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征；帕金森病主要临床表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍。
[0004]研究表明，老龄是诱发该类疾病最主要的危险因素之一。随着老龄化社会的到来， 神经系统退行性疾病的发病率呈逐年上升趋势。据估计，目前全球阿尔茨海默病患者约 9200万，帕金森病患者约2300万，运动神经元病患者约46万。仅在美国，就有500万阿尔茨海默病患者，1〇〇万帕金森病患者。神经退行性疾病给人类健康和生命造成极大威胁，给患者带来极大痛苦，给家庭及社会带来沉重的负担，因此，充分认识神经退行性疾病的严重性， 提高对该类疾病的治疗与预防水平是当务之急。
[0005]目前治疗此类疾病的药物虽然很多，但是除帕金森病患者通过合理用药可延长其寿命和改善其生活质量外，对其他神经退行性疾病的治疗效果均不理想。因此开发新型的治疗神经退行性疾病的药物迫在眉睫。
[0006]研究表明人羊膜上皮细胞具有神经生物学功能，与神经干细胞具有同源性。神经干细胞(neural stem cell，NSC)研究虽起步较晚，但却是当前研究的热点。由于成体神经组织内NSC数量少，分散分布，取材困难，无免疫原性NSC细胞系建立困难以及异体移植存在的免役排斥问题等原因，使NSC在神经系统疾病治疗中的应用受到一定的限制。随着对羊膜上皮细胞具有神经干细胞特性的研究逐步深入，羊膜干细胞为治疗神经系统退行性疾病和外伤性神经损伤将会带来新的契机。Kakishita等在证实培养HAEC中含酪氨酸轻化酶(TH) 阳性细胞的基础上，利用HAEC可以合成多巴胺的特点，进行大鼠脑内移植HAEC治疗帕金森病(PD)动物模型的实验，结果显示，移植2周后，大鼠脑内有人源性TH阳性细胞的存活，并可释放DA，有效地改善了大鼠F>D症状。Kakishita等进一步于体外实验证实HAEC通过分泌的可溶性营养因子增强多巴胺能神经元的生存，移植到ro大鼠模型脑内的HAEC也可能通过细胞因子作用阻止多巴胺能神经元的丧失。Okawa等以大鼠羊膜上皮细胞作为供体细胞移植于缺血性脑损伤的海马，5周后发现增生的细胞迀移至CA1区锥体层，神经元细胞选择性存活于CA1区锥体层，表明羊膜细胞具有治疗脑损伤的潜力。
[0007]在羊膜干细胞的临床应用中涉及到羊膜干细胞的冻存、复苏技术，细胞复苏是将长期超低温冻存于液氮中的细胞，迅速解冻到常温过程，同时确保恢复细胞的活性与生物学特征。目前，通常采用普通商品化的完全培养基对羊膜干细胞进行复苏培养。但普通商品化的完全培养基在细胞的复苏过程中无法保证干细胞的活力，细胞增值率较低，影响干细胞的临床利用。因此，需要开发一种能够更好地维持羊膜间充质干细胞活力的复苏培养基及其复苏方法。
【发明内容】
[0008]有鉴于此，本发明提供了一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。该复苏培养基能够更好地维持羊膜间充质干细胞的活力。
[0009]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0010]本发明提供了一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基，该复苏培养基的制备方法为:取羊膜间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。
[0011]作为优选，第一培养的时间为24?72h。[〇〇12]在本发明提供的一些实施例中，第一培养的时间为24h。
[0013]在本发明提供的一些实施例中，第一培养为在37 °C、5 % C02条件下培养。
[0014]作为优选，第一培养的羊膜间充质干细胞的接种密度为(5?10)X103cell/cm2。
[0015]优选地，第一培养的羊膜间充质干细胞的接种密度为7X103cell/cm2。
[0016]作为优选，无血清培养基为DMEM/F12培养基。[〇〇17]作为优选，第二培养的时间为24?72h。[〇〇18]在本发明提供的一些实施例中，第二培养的时间为24h、48h或72h。
[0019]在本发明提供的一些实施例中，第二培养为在37 °C、5 % C02条件下培养。
[0020]作为优选，收集上清液后还包括离心的步骤。[0021 ] 作为优选，离心为1000?2000rpm离心5?lOmin。
[0022]在本发明提供的一些实施例中，离心为lOOOrpm离心5min。
[0023]作为优选，离心后还包括过滤除菌的步骤。
[0024]在本发明提供的一些实施例中，用于过滤除菌的滤膜的孔径为0.22M1。
[0025]本发明还提供了一种羊膜间充质干细胞的复苏培养方法，采用本发明的复苏培养基复苏培养冻存的羊膜间充质干细胞。
[0026]作为优选，本发明提供的羊膜间充质干细胞的复苏培养方法为:取冻存的羊膜间充质干细胞，经温育后，采用本发明复苏培养基复苏培养温育后的羊膜间充质干细胞。 [〇〇27]优选地，本发明提供的羊膜间充质干细胞的复苏培养方法为:取冻存的羊膜间充质干细胞，在35?42°C下震荡温育30?60s，加入5?10倍体积的本发明复苏培养基，离心， 去上清，按(5?10)X103cell/cm2的密度接种于本发明复苏培养基，在37°C、5%⑶2条件下培养24h，获得第一复苏羊膜间充质干细胞;然后按(5?10) X 103cell/cm2的密度将第一复苏羊膜间充质干细胞接种于本发明复苏培养基，在37°C、5%C02条件下继续培养24?48h， 获得复苏后的羊膜间充质干细胞。
[0028]在本发明提供的一些实施例中，本发明提供的羊膜间充质干细胞的复苏培养方法为:取冻存的羊膜间充质干细胞，在42°C下震荡温育60s，加入5倍体积的本发明复苏培养基，离心，去上清，按7 X 103cel 1/cm2的密度接种于本发明复苏培养基，在37 °C、5 %⑶2条件下培养24h，获得第一复苏羊膜间充质干细胞;然后按7X103cell/cm2的密度将第一复苏羊膜间充质干细胞接种于本发明复苏培养基，在37°C、5%C02条件下继续培养48h，获得复苏后的羊膜间充质干细胞。
[0029]本发明提供了一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。该复苏培养基的制备方法为:取羊膜间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。本发明的有益效果为:用羊膜间充质干细胞的条件培养基进行羊膜间充质干细胞的复苏培养，有利于羊膜间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持羊膜间充质干细胞的生物学特征。【附图说明】
[0030]图1示实施例1复苏后细胞活力检测结果；
[0031]图2示实施例1中试验组的复苏后的羊膜间充质干细胞的流式检测结果;其中图2-1示⑶73检测结果，图2-2示⑶90检测结果，图2-3示⑶105检测结果，图2-4示⑶34检测结果， 图2-5示⑶45检测结果，图2-6示HLA-DR检测结果；
[0032]图3示实施例1中对照组的复苏后的羊膜间充质干细胞的流式检测结果;其中图3-1示⑶73检测结果，图3-2示⑶90检测结果，图3-3示⑶105检测结果，图3-4示⑶34检测结果， 图3-5示⑶45检测结果，图3-6示HLA-DR检测结果；
[0033]图4示实施例1中试验组的复苏后的羊膜间充质干细胞的诱导成骨分化鉴定结果；
[0034]图5示实施例1中试验组的复苏后的羊膜间充质干细胞的诱导成脂分化鉴定结果； [〇〇35]图6示实施例2复苏后细胞活力检测结果；
[0036]图7示实施例2中试验组的复苏后的羊膜间充质干细胞的流式检测结果;其中图7-1示⑶73检测结果，图7-2示⑶90检测结果，图7-3示⑶105检测结果，图7-4示⑶34检测结果， 图7-5示⑶45检测结果，图7-6示HLA-DR检测结果；
[0037]图8示实施例2中对照组的复苏后的羊膜间充质干细胞的流式检测结果;其中图8-1示⑶73检测结果，图8-2示⑶90检测结果，图8-3示⑶105检测结果，图8-4示⑶34检测结果， 图8-5示⑶45检测结果，图8-6示HLA-DR检测结果；[〇〇38]图9示实施例3复苏后细胞活力检测结果；
[0039]图10示实施例3中试验组的复苏后的羊膜间充质干细胞的流式检测结果;其中图10-1示CD73检测结果，图10-2示CD90检测结果，图10-3示CD105检测结果，图10-4示CD34检测结果，图10-5示CD45检测结果，图10-6示HLA-DR检测结果；
[0040]图11示实施例3中对照组的复苏后的羊膜间充质干细胞的流式检测结果;其中图11-1示⑶73检测结果，图11-2示⑶90检测结果，图11-3示⑶105检测结果，图11-4示⑶34检测结果，图11-5示CD45检测结果，图11-6示HLA-DR检测结果。【具体实施方式】
[0041]本发明公开了一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[〇〇42] 术语解释:
[0043]细胞复苏:将长期超低温冻存于液氮中的细胞，迅速解冻到常温过程，同时确保恢复细胞的活性与生物学特征；
[0044]条件培养基:在细胞增殖培养过程中，细胞会分泌活性物质到培养液中，其中细胞因子是主要的活性物质之一，这种培养过某种细胞或组织以后，含有细胞分泌物的培养液就叫做条件培养液。利用条件培养液可有效提高细胞或组织体外培养的成功率，而且不同来源的条件培养液对不同细胞、组织有不同的促进或抑制作用。
[0045]本发明提供的羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法中所用生物材料均可由市场购得。
[0046]下面结合实施例，进一步阐述本发明:[〇〇47] 实施例1
[0048]( — )羊膜间充质干细胞的培养及条件培养基的收集[〇〇49] 将羊膜组织剪碎至1.0-20.0cm3后，将组织块用0.1 %胰酶消化60min，再用0.5 % I 型胶原酶消化，当组织块基本消化为止，再2000rpm离心5min，弃上清，用roS重悬，过70mi细胞筛后，再次以2000rpm离心5min，用DMEM/F12+10%FBS培养重悬细胞沉淀。放置在37°C， 5 %C02培养箱静置培养，每2-3天换液，待细胞克隆汇合度达到80 %-90 %，用0.25 %胰酶消化细胞，离心后用完全培养基重悬沉淀，7 X103/cm2细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。
[0050]条件培养基收集:将羊膜间充质干细胞按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿，完全培养基进行培养24小时后，用roS清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基，继续培养24小时后，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，lOOOrpm离心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用〇.22wii滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放置在-20°C培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80°C保存1年以上。需要使用时，恢复到常温使用。
[0051](二)羊膜间充质干细胞的复苏
[0052]复苏试验分为试验组和对照组，试验组的操作流程为:将冻存的羊膜间充质干细胞将冻存的间充质干细胞从液氮中取出，放置在42°C的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的条件培养基中，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞悬液以lOOOrpm离心5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀;轻轻吹打混匀，并按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，用条件培养基培养。 放置在37 °C，5 %C02培养箱静置24小时后，更换条件培养基继续培养，每日观察细胞扩增情况，细胞进行继续培养48小时，用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞进行细胞传代或其他实验。
[0053]对照组的操作流程为:从液氮中取出羊膜间充质干细胞细胞，立即投入42°C水浴中融化。PBS洗涤后，取出细胞进行细胞活力检测，以lOOOrpm离心5分钟，去上清，用完全培养基重悬细胞，按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，并放置于37 °C、5 %⑶2培养箱中培养72小时。用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测。其余细胞进行细胞传代或其他实验。活力检测结果见图1。[〇〇54]由图1可知，试验组细胞复活活力高于对照组，表明本实施例复苏培养基有利于羊膜间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持羊膜间充质干细胞的生物学特征。
[0055](三)流式细胞仪检测复苏后的干细胞表面标志[〇〇56] 待复苏后细胞汇合度达到80 %-90 %，用0.25%胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2 X 105细胞数，染色缓冲液洗1次，lOOOrpm离心5min;弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及HLA-DR抗体各2yL，并设一管为空白对照；在4°C 下，避光反应15-20min;染色缓冲液洗一次，lOOOrpm离心5min;直接标记的细胞弃上清，避光加入500yL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。试验组的试验结果见图2,对照组的试验结果见图3。
[0057]由图2、图3可知，试验组采用本发明提供的复苏培养基对冻存的间充质干细胞进行复苏培养后，阴性表面标志⑶34、CD45、HLA-DR为均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90，CD105均呈现阳性。说明复苏后羊膜间充质干细胞依然保持间充质干细胞的生物学特征。[〇〇58](四)复苏后细胞诱导成骨分化鉴定[〇〇59] 待试验组复苏后细胞汇合度达到80 %-90 %，用0.25 %胰酶消化离心细胞，按照5 X 103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果见图4。
[0060]由图4可见，复苏后的间充质干细胞，经过成骨诱导4周后，由茜素红染色可见钙化结节，说明经过本实施例复苏培养基复苏后的羊膜间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。[0061 ](五)复苏后间充质干细胞诱导成脂分化鉴定[〇〇62]待试验组复苏后细胞汇合度达到80 %-90 %，用0.25 %胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照5 X 103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10%胎牛血清、0.5mM IBMX、lyM地塞米松、100yM吲哚美辛、5yg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。三周后进行油红0染色， 鉴定脂滴形成情况，结果见图5。[〇〇63]由图5可见，复苏后的间充质干细胞经过成脂诱导三周后，由油红0染色可见红色油滴，说明经过本实施例复苏培养基复苏后的羊膜间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜能。
[0064] 实施例2
[0065]( — )羊膜间充质干细胞的培养及条件培养基的收集[〇〇66] 将羊膜组织剪碎至1.0-20.0cm3后，将组织块用0.1 %胰酶消化60min，再用0.5 % I 型胶原酶消化，当组织块基本消化为止，再2000rpm离心5min，弃上清，用roS重悬，过70mi细胞筛后，再次以2000rpm离心5min，用DMEM/F12+10%FBS培养重悬细胞沉淀。放置在37°C， 5 %C02培养箱静置培养，每2-3天换液，待细胞克隆汇合度达到80 %-90 %，用0.25 %胰酶消化细胞，离心后用完全培养基重悬沉淀，7 X103/cm2细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。
[0067]条件培养基收集:将羊膜间充质干细胞按照7X103/cm2细胞密度接种培养皿，完全培养基进行培养24小时后，用roS清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基，继续培养48小时后，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，lOOOrpm离心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用〇.22wii滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放置在-20°C培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80°C保存1年以上。需要使用时，恢复到常温使用。[〇〇68](二)羊膜间充质干细胞的复苏
[0069]复苏试验分为试验组和对照组，试验组的操作流程为:将冻存的羊膜间充质干细胞将冻存的间充质干细胞从液氮中取出，放置在42°C的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的条件培养基中，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞悬液以lOOOrpm离心5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀;轻轻吹打混匀，并按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，用条件培养基培养。 放置在37 °C，5 %C02培养箱静置24小时后，更换条件培养基继续培养，每日观察细胞扩增情况，细胞进行继续培养48小时，用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞进行细胞传代或其他实验。
[0070]对照组的操作流程为:从液氮中取出羊膜间充质干细胞细胞，立即投入42°C水浴中融化。PBS洗涤后，取出细胞进行细胞活力检测，以lOOOrpm离心5分钟，去上清，用完全培养基重悬细胞，按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，并放置于37 °C、5 %⑶2培养箱中培养72小时。用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测。其余细胞进行细胞传代或其他实验。活力检测结果见图6。
[0071]由图6可知，试验组细胞复活活力高于对照组，表明本实施例复苏培养基有利于羊膜间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持羊膜间充质干细胞的生物学特征。[〇〇72](三)流式细胞仪检测复苏后的干细胞表面标志[〇〇73] 待复苏后细胞汇合度达到80%-90%，用0.25%胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2 X 105细胞数，染色缓冲液洗1次，lOOOrpm离心5min;弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及HLA-DR抗体各2yL，并设一管为空白对照；在4°C 下，避光反应15-20min;染色缓冲液洗一次，lOOOrpm离心5min;直接标记的细胞弃上清，避光加入500yL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。试验组的试验结果见图7,对照组的试验结果见图8。
[0074]由图7、图8可知，试验组采用本发明提供的复苏培养基对冻存的间充质干细胞进行复苏培养后，阴性表面标志⑶34、CD45、HLA-DR为均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90，CD105均呈现阳性。说明复苏后羊膜间充质干细胞依然保持间充质干细胞的生物学特征。[〇〇75](四)复苏后细胞诱导成骨分化鉴定[〇〇76] 待试验组复苏后细胞汇合度达到80 %-90 %，用0.25 %胰酶消化离心细胞，按照5 X 103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果与图4相似。可见，复苏后的间充质干细胞经过成骨诱导4周后，由茜素红染色可见钙化结节，说明经过本实施例复苏培养基复苏后的羊膜间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。
[0077](五)复苏后间充质干细胞诱导成脂分化鉴定[〇〇78]待试验组复苏后细胞汇合度达到80 %-90 %，用0.25 %胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照5 X 103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10%胎牛血清、0.5mM IBMX、lyM地塞米松、100yM吲哚美辛、5yg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。三周后进行油红0染色， 鉴定脂滴形成情况，结果与图5相似。可见，复苏后的间充质干细胞经过成脂诱导三周后，由油红0染色可见红色油滴，说明经过本实施例复苏培养基复苏后的羊膜间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜能。[〇〇79] 实施例3[〇〇8〇](一)羊膜间充质干细胞的培养及条件培养基的收集[〇〇81 ] 将羊膜组织剪碎至1.0-20.0cm3后，将组织块用0.1 %胰酶消化60min，再用0.5 % I 型胶原酶消化，当组织块基本消化为止，再2000rpm离心5min，弃上清，用roS重悬，过70mi细胞筛后，再次以2000rpm离心5min，用DMEM/F12+10%FBS培养重悬细胞沉淀。放置在37°C， 5 %C02培养箱静置培养，每2-3天换液，待细胞克隆汇合度达到80 %-90 %，用0.25 %胰酶消化细胞，离心后用完全培养基重悬沉淀，7 X103/cm2细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。
[0082]条件培养基收集:将羊膜间充质干细胞按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿，完全培养基进行培养24小时后，用roS清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基，继续培养72小时后，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，lOOOrpm离心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用〇.22wii滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放置在-20°C培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80°C保存1年以上。需要使用时，恢复到常温使用。[〇〇83](二)羊膜间充质干细胞的复苏
[0084]复苏试验分为试验组和对照组，试验组的操作流程为:将冻存的羊膜间充质干细胞将冻存的间充质干细胞从液氮中取出，放置在42°C的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的条件培养基中，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞悬液以l〇〇〇rpm离心5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀;轻轻吹打混匀，并按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，用条件培养基培养。 放置在37 °C，5 %C02培养箱静置24小时后，更换条件培养基继续培养，每日观察细胞扩增情况，细胞进行继续培养48小时，用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞进行细胞传代或其他实验。[〇〇85]对照组的操作流程为:从液氮中取出羊膜间充质干细胞细胞，立即投入42°C水浴中融化。PBS洗涤后，取出细胞进行细胞活力检测，以lOOOrpm离心5分钟，去上清，用完全培养基重悬细胞，按照7 X 103/cm2细胞密度接种培养皿中，并放置于37 °C、5 %⑶2培养箱中培养72小时。用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测。其余细胞进行细胞传代或其他实验。活力检测结果见图9。
[0086]由图9可知，试验组细胞复活活力高于对照组，表明本实施例复苏培养基有利于羊膜间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持羊膜间充质干细胞的生物学特征。[〇〇87](三)流式细胞仪检测复苏后的干细胞表面标志[〇〇88] 待复苏后细胞汇合度达到80 %-90%，用0.25 %胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2 X 105细胞数，染色缓冲液洗1次，lOOOrpm离心5min;弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及HLA-DR抗体各2yL，并设一管为空白对照；在4°C 下，避光反应15-20min;染色缓冲液洗一次，lOOOrpm离心5min;直接标记的细胞弃上清，避光加入500yL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。试验组的试验结果见图10，对照组的试验结果见图11。
[0089]由图10、图11可知，试验组采用本发明提供的复苏培养基对冻存的间充质干细胞进行复苏培养后，阴性表面标志⑶34、⑶45、HLA-DR为均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90，CD105均呈现阳性。说明复苏后羊膜间充质干细胞依然保持间充质干细胞的生物学特征。
[0090](四)复苏后细胞诱导成骨分化鉴定
[0091]待试验组复苏后细胞汇合度达到80 %-90 %，用0.25 %胰酶消化离心细胞，按照5 X 103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果与图4相似。可见，复苏后的间充质干细胞经过成骨诱导4周后，由茜素红染色可见钙化结节，说明经过本实施例复苏培养基复苏后的羊膜间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。
[0092](五)复苏后间充质干细胞诱导成脂分化鉴定[〇〇93]待试验组复苏后细胞汇合度达到80 %-90 %，用0.25 %胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照5 X 103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10%胎牛血清、0.5mM IBMX、lyM地塞米松、100yM吲哚美辛、5yg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。三周后进行油红0染色， 鉴定脂滴形成情况，结果与图5相似。可见，复苏后的间充质干细胞经过成脂诱导三周后，由油红0染色可见红色油滴，说明经过本实施例复苏培养基复苏后的羊膜间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜能。
[0094]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基，其特征在于，所述复苏培养基的制备方法为: 取羊膜间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培 养后，收集上清液，获得复苏培养基。2.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述第一培养的时间为24?72h。3.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述第一培养的羊膜间充质干细胞 的接种密度为(5?10) X 103cell/cm2。4.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述无血清培养基为DMEM/F12培养基。5.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述第二培养的时间为24?72h。6.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述收集上清液后还包括离心的步骤。7.根据权利要求6所述的复苏培养基，其特征在于，所述离心为1000?2000rpm离心5? 10min〇8.根据权利要求6或7所述的复苏培养基，其特征在于，所述离心后还包括过滤除菌的步骤。9.一种羊膜间充质干细胞的复苏培养方法，其特征在于，所述采用权利要求1至8中任 一项所述的复苏培养基复苏培养冻存的羊膜间充质干细胞。10.根据权利要求9所述的复苏培养方法，其特征在于，所述复苏培养方法为:取冻存的 羊膜间充质干细胞，经温育后，采用权利要求1至8中任一项所述的复苏培养基复苏培养所 述温育后的羊膜间充质干细胞。
【文档编号】C12N5/0775GK106011058SQ201610613644
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】葛啸虎, 陈海佳, 王飞, 王一飞, 冯德龙, 张维敏
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司