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【主权项】
1. 使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物，其特征在于：所述组合物包括神 经元样特性化学诱导剂，所述神经元样特性化学诱导剂包括下述1)-6)中的任意组合： 1) 环腺苷单磷酸激动剂； 2) 促神经发生小分子； 3) 糖原合成激酶抑制剂； 4. TGFP受体抑制剂； 5. BET家族溴结构域抑制剂； 6) 选择性Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶抑制剂和/或p38丝裂原活化激酶抑制剂； 所述6)是选择性组分。2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述非神经元真核细胞为哺乳动物非 神经元真核细胞，所述组合物的活性成分为下述CU C2、C3、C4、C5或C6 : CU由所述环腺苷单磷酸激动剂、所述促神经发生小分子、所述糖原合成激酶抑制剂、 和BET家族溴结构域抑制剂组成； C2、由所述环腺苷单磷酸激动剂、所述促神经发生小分子、所述糖原合成激酶抑制剂、 所述TGF P受体抑制剂和BET家族溴结构域抑制剂组成； C3、由所述环腺苷单磷酸激动剂、所述促神经发生小分子、所述糖原合成激酶抑制剂、 和所述TGFP受体抑制剂组成； C4、由所述Cl和所述6)组成； C5、由所述C2和所述6)组成； C6、由所述C3和所述6)组成。3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述环腺苷单磷酸激动剂为下述 六种物质中的至少一种：F，咯利普兰，双丁酰环腺苷单磷酸，8-溴-环腺苷单磷酸，前列腺 素E2和金雀异黄素；所述F为佛司可林。4. 根据权利要求1或2或3所述的组合物，其特征在于：所述促神经发生小分子为I， 所述I为N-环丙基-5-(2-噻吩基）-3-异恶唑甲酰胺。5. 根据权利要求1至4中任一所述的组合物，其特征在于：所述糖原合成激酶抑制剂 为下述物质中的至少一种：C ;所述C的三盐酸盐；3-(2, 4-二氯苯基）-4-(1-甲基-IH-吲 哚-3-基）-IH-吡咯-2, 5-二酮；GSK 31 抑制剂 XV ;GSK-3 抑制剂 IX ;GSK 3 IX ;GSK-3 抑 制剂 XVI ;SB-415286 ;Bio 和（2, Z，3' E)-6-溴靛玉红-3' -丙酮肟； 所述C为6- [2- [4- (2, 4-二氯苯基）-5- (4-甲基-IH-咪唑-2-基）嘧啶-2-基氨基] 乙基氨基]吡啶_3_甲臆。6. 根据权利要求1至5中任一所述的组合物，其特征在于：所述TGF P受体抑制剂是下 述物质中的至少一种：S ;E-616452 ;SB 505124 ;GW 788388 ;SB 525334 和 dorsomorphine ; 所述S为4- [4- (1，3-苯并二唑-5-基）-5- (2-吡啶基）-IH-咪唑-2-基]-苯酰胺水 合物。7. 根据权利要求1至6中任一所述的组合物，其特征在于：所述BET家族溴结构域抑 制剂为下述物质中的至少一种：B ;所述B的氢氯化物；（6S)-(4-(4-氯苯基）-2,3,9_三 甲基-6H-噻吩并[3, 2-f] [1，2, 4]三唑并[4, 3-a] [1，4]二氮杂卓-6-基）乙酸叔丁酯； Bromosporine ;PFI 1 和 1- [7- (3, 4-二甲氧基苯基）-9- [[ (3S) -1-甲基哌啶-3-基]甲 氧基]-2, 3, 4, 5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4-基]丙烷-1-酮；所述B为7-(3, 5-二甲 基异噁唑-4-基）-8-甲氧基-1-((R)-1-(吡啶-2-基）乙基）-lH-咪唑并[4,5-C]喹 啉-2(3H)_ 酮； 和/或，所述6)为下述四种物质中的至少一种：Y27632,法舒地尔，达马莫德和 38203580;所述￥27632为（+)-〇?)-反式-4-(1-氨基乙基）4-(4-吡啶基）环己烷甲酰胺 二盐酸盐，所述SB203580为4-(4' -氟苯基）-2-(4' -甲基亚磺酰基苯基）-5-(4' -吡啶 基）-咪唑。8. 根据权利要求1至7中任一所述的组合物，其特征在于：所述组合物为C1、C2、C3或 C4 ； 所述Cl由所述F、所述I、所述C和所述B组成；所述Cl中，所述F、所述I、所述C和所述 B 的摩尔比为（50-100) : (10-20) : (10-20) : (0? 5-10)或 100 : (10-20) : (10-20) : (0? 5-2) 或 100 :20 :20 : (0? 5-2)或 100 :20 :20 :2 ; 所述C2由所述F、所述I、所述C、所述S和所述B组成；所述C2中，所述F、所述I、所 述 C、所述 S 和所述 B 的摩尔比为（50-100) : (10-20) : (10-20) : (2-10) : (0. 5-10)或 100 : (10-20) : (10-20) : (2-10) : (0? 5-2)或 100 :20 :20 : (2-10) : (0? 5-2)或 100 :20 :20 :10 :2 ; 所述C3由所述F、所述I、所述C和所述S组成；所述C3中，所述F、所述I、所述C和所 述 S 的摩尔比为（50-100) : (10-20) : (10-20) : (2-10)或 100 : (10-20) : (10-20) : (2-10)或 100 :20 :20 : (2-10)或 100 :20 :20 :10 ; 所述C4由所述Cl和所述6)组成组成，所述6)为下述四种物质中的一种：所述 Y27632、所述法舒地尔、所述达马莫德和所述SB203580 ;所述C4中，所述Cl以F计和所述 6)的摩尔比为（50-100) :2或100 :2。9. 根据权利要求1至8中任一所述的组合物，其特征在于：所述神经元样特性为下述 P1、P2和P3中的至少一种： Pl、具有神经元形态； P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种：TUJl， MAP2, NF-H，NeuN，vGlut 和 Gad67 ; P3、由膜片钳检测到膜去极化。10. 根据权利要求1至9中任一所述的组合物，其特征在于：所述非神经元真核细胞为 下述任一种细胞：成纤维细胞，多能干细胞，血液来源细胞，胚胎来源细胞，皮肤来源细胞， 脂肪组织来源细胞，脂肪细胞，上皮细胞，内皮细胞，间充质细胞，实质细胞，小肠上皮细胞 和结缔组织细胞。11. 含有权利要求1至10中任一所述的组合物的产品，所述产品使非神经元真核细胞 获得神经元样特性；所述神经元样特性为下述Pl、P2和P3中的至少一种：P1、具有神经元 形态； P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种：TUJl， MAP2, NF-H，NeuN，vGlut 和 Gad67 ; P3、由膜片钳检测到膜去极化。12. 权利要求1至10中任一所述的组合物或权利要求11所述的产品在将非神经元真 核细胞重编程为神经元样细胞中的应用，所述神经元样细胞为具有神经元样特性的细胞， 所述神经元样特性为下述PI、P2和P3中的至少一种： Pl、具有神经元形态； P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种：TUJl， MAP2, NF-H，NeuN，vGlut 和 Gad67 ; P3、由膜片钳检测到膜去极化。13. 将非神经元真核细胞重编程为神经元样细胞的方法，包括将离体的非神经元真核 细胞在含有权利要求1至10中任一所述的组合物的神经元诱导培养基中培养使所述非神 经元真核细胞转变为神经元样细胞；所述神经元样细胞为具有神经元样特性的细胞，所述 神经元样特性为下述Pl、P2和P3中的至少一种： Pl、具有神经元形态； P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种：TUJl， MAP2, NF-H，NeuN，vGlut 和 Gad67 ; P3、由膜片钳检测到膜去极化。14. 根据权利要求12所述的应用或13所述的方法，其特征在于：所述非神经元真核细 胞为下述任一种细胞：成纤维细胞，多能干细胞，血液来源细胞，胚胎来源细胞，皮肤来源细 胞，脂肪组织来源细胞，脂肪细胞，上皮细胞，内皮细胞，间充质细胞，实质细胞，小肠上皮细 胞和结缔组织细胞。15. 根据权利要求12至14任一所述的应用或方法，其特征在于：所述非神经元真核细 胞没有被转染编码具有促神经发生功能蛋白质的核酸和/或没有转染小分子RNA ;所述具 有促神经发生功能蛋白质为下述至少一种：Scll，Zicl，01ig2, Brn2/4, NeuroDl和Mytll ; 所述小分子RNA为miR-9/9和/或miR-124 ; 和/或， 所述非神经元真核细胞为部分分化或完全分化的细胞。16. 根据权利要求12-15任一所述的应用或方法，其特征在于：所述神经元样细胞不重 组性表达神经发生相关的核酸或神经元转录因子。17. 根据权利要求12-16任一所述的应用或方法，其特征在于：所述神经元样细胞不重 组性表达编码具有促神经发生功能蛋白质的核酸和/或小分子RNA ;所述具有促神经发生 功能蛋白质为下述至少一种：Sell，Zicl，01ig2, Brn2/4, NeuroDl，Mytll，所述小分子RNA 为 miR-9/9 和 / 或 miR-124。18. 根据权利要求12-17任一所述的应用或方法，其特征在于：所述非神经元真核细胞 为成纤维细胞，所述神经元样细胞与来自同一物种的成纤维细胞相比，下述至少一种基因 的表达下调：Fap, Des, Slug, Dcn, FSpl, Collagenl 和 Twist2。19. 根据权利要求13-18中任一所述的方法，其特征在于：所述含有所述组合物的神经 元诱导培养基中含有的所述组合物为权利要求8所述的CUC2、C3或C4,所述含有所述组合 物的神经元诱导培养基中所述Cl的含量以所述F计为50-100 yM或100 yM ;所述含有所述 组合物的神经元诱导培养基中所述C2的含量以所述F计为50-100 yM或100 yM ;所述含有 所述组合物的神经元诱导培养基中所述C3的含量以所述F计为50-100 yM或100 yM ;所述 含有所述组合物的神经元诱导培养基中所述C4的含量以所述F计为50-100 y M或100 y M。20. 根据权利要求13-19中任一所述的方法，其特征在于：所述非神经元真核细胞在所 述神经元诱导培养基中培养14-24天。21. 根据权利要求13-20中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括在所述神经元 诱导培养基培养后，将细胞用促成熟培养基培养14-21天。22. 根据权利要求13-21中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括从培养的细胞 中分离得到所述神经元样细胞。23. 由权利要求13-22中任一所述的方法获得的所述神经元样细胞。24. 包括权利要求23所述的神经元样细胞的治疗组合物。
【专利摘要】本发明公开了将非神经元细胞重编程为神经元样细胞的方法和组合物。该组合物包括神经元样特性化学诱导剂，所述神经元样特性化学诱导剂包括下述1)-6)中的任意组合：1)环腺苷单磷酸激动剂；2)促神经发生小分子；3)糖原合成激酶抑制剂；4)TGFβ受体抑制剂；5)BET家族溴结构域抑制剂；6)选择性Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶抑制剂和/或p38丝裂原活化激酶抑制剂；所述6)是选择性组分。本申请的使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物在16天的诱导时间内能够产生超过90％的TUJ1阳性细胞。通过进一步的促成熟阶段，这些化学方法诱导的神经元样细胞有着神经元特异性的表达谱，能够产生动作电位并且形成功能性突触。
【IPC分类】A61P25/14, C12N5/0793, A61P25/00, A61K35/30, A61P25/28
【公开号】CN105039258
【申请号】CN201510387877
【发明人】邓宏魁, 李翔, 左潇含
【申请人】北京大学, 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月3日