专利名称：D-泛酸内酯水解酶和编码该酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于D，L-泛酸内酯的光学拆分(opticalresolution)的新的酶及编码该酶的基因，该拆分是通过D-选择性不对称水解进行的。本发明主要涉及具有来自尖镰孢(FusariumOxysporum)的天然D-泛酸内酯水解酶活性或实质上具有与该酶同等活性的蛋白质以及编码它们的基因。再详细点说，本发明涉及含有编码该蛋白质的碱基序列的DNA；以及用该DNA转化的宿主细胞；用宿主细胞制造D-泛酸内酯水解酶的方法；还涉及这些蛋白质以及宿主细胞的用途。
D-泛酸内酯是制造医学上或生理学上有用的重要的维生素D-泛酸以及双泛酰硫乙胺的中间体。以前，D-泛酸内酯是通过光学拆分化学方法合成的D，L-泛酸内酯制造的。然而，这个方法的缺点是需要价格高的奎宁、番木鳖碱等拆解试剂，D-泛酸内酯的回收也不容易。为了解决这样的问题，本发明人于特开平3-65198号以及特开平4-144681号公报中提出了通过酶的不对称水解光学拆分D，L-泛酸内酯的方法。
即D-泛酸内酯的制造方法和利用下列各属微生物制造D-泛酸水解酶的方法。这些菌属是镰孢属、柱孢属(Cylindrocarpon)、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、周刺座霉属、粘帚霉属、散囊菌属、丛赤壳属(Nectoria)、裂盾菌属、漆斑菌属、脉孢菌属、支顶孢属、锈生座孢属、犁头霉属、孢子丝菌属、轮枝孢属、节皮菌属。D-泛酸内酯的制造方法的特征是，从上列各菌属中选出具有水解内酯能力的微生物，利用该微生物，有选择地不对称水解D，L-泛酸内酯中的D-体，使它生成D-泛酸，分离该泛酸，将它转换成D-泛酸内酯。
但是这里提到的很多微生物未必都有可直接用于工业上的水解活性。为了使这些微生物具有的酶活性达到工业上可应用的水平，需要就培养条件、活性诱导条件等进行长时间的烦琐而艰难的研究。由于这些微生物是真菌，菌体呈现出带有各式各样形态的菌丝状。与具有单一形态的细菌等相比，存在着制备利于工业上生产用的固定化菌体相当困难的问题。还存在从菌体精制酶时，D-泛酸内酯水解酶的回收率也相当低等问题。
本发明的目的是解决这些问题，通过改变D-泛酸内酯水解酶本身使酶的活性急剧上升。就是说，本发明弄清了编码天然的D-泛酸内酯水解酶，例如来源于尖镰孢的天然的D-泛酸内酯水解酶的基因以及编码具有与该酶同等活性的蛋白质的基因，提供用含有编码该蛋白质的碱基序列的DNA转化了的宿主细胞，以及提供用该宿主细胞制造这种蛋白质的方法，还提供这些蛋白质和宿主细胞的用途等。
本发明人考虑到如果从具有上述水解内酯能力的微生物分离出编码D-泛酸内酯水解酶的基因，利用分离出的D-泛酸内酯水解酶基因，开发出效率高而且更有利于生产的D-泛酸内酯生产系统，不仅可以解决上述各种各样的问题，而且有利于带有更新功能的具有水解内酯能力的酶的开发以及使用了这种酶的技术开发的很多方面。特别是本发明人成功地从可以生产D-泛酸内酯水解酶的镰孢属微生物，如尖镰孢中分离出了编码具有水解D-泛酸内酯活性的水解酶的新的基因，从而完成了本发明。
本发明涉及如下一些内容具有天然的D-泛酸内酯水解酶活性或实质上具有与该酶同等活性或同等的一级结构的蛋白质或它的盐，该蛋白质的特征的部分多肽或它的盐，编码酶或蛋白质的基因，例如，DNA、RNA等；利用基因重组技术对该基因进行重组获得含有该基因的载体或质粒；用这样的载体等转化的宿主细胞；培养该宿主细胞，制造该蛋白质或它的盐的方法；利用基因操作获得的宿主细胞和重组蛋白质或它的盐等进行D、L-泛酸内酯的光学拆分，合成D-泛酸内酯的方法以及称之为固定化酶的生产D-泛酸内酯系统的手段。
本发明中给出了理想的D-泛酸内酯水解酶或它的盐，其特征是具有序列表中序列号1表示的氨基酸序列或实质上具有与该序列同等的氨基酸序列。
本发明主要是提供如下一些物质及方法。
(1)具有天然的D-泛酸内酯水解酶活性或实质上具有与该酶同等活性、或是实质上具有与该酶同等的一级结构的蛋白质或它的盐；(2)上述第(1)项记载的蛋白质，其中具有天然D-泛酸内酯水解酶活性的蛋白质来源于属于下列各属的微生物，即镰孢属、柱孢属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、周剌座霉属、粘帚霉属、散囊菌属、丛赤壳属、裂盾菌属、漆斑菌属、脉孢菌属、支顶孢属、锈生座孢属、犁头霉属、孢子丝菌属、轮枝孢属，节皮菌属；(3)上述(1)记载的蛋白质，其中具有天然D-泛酸内酯水解酶活性的蛋白质来自镰孢属微生物；(4)上述第(1)-(3)中任一项记载的蛋白质，是具有序列表中序列号1表示的氨基酸序列或具有与该序列实质上同等的氨基酸序列的D-泛酸内酯水解酶或它的盐；(5)上述第(1)-(4)中任一项记载的蛋白质，其特征是在原核生物中表达外源性DNA序列获得的产物；(6)上述第(1)-(5)中任一项记载的蛋白质，其特征是具有序列表中序列号1表示的氨基酸序列或具有与该序列实质上相同的氨基酸序列；(7)上述第(1)-(6)中任一项记载的蛋白质的部分多肽或它的盐；(8)核酸，其特征是具有编码上述第(1)-(7)中任一项记载的蛋白质或它的部分多肽的碱基序列；(9)上述第(8)项记载的核酸，其特征是具有在序列表中序列号2表示的碱基序列中具有可译框架部分或具有与该框架实质上同等活性的碱基序列；(10)载体，其特征是含有上述第(8)或(9)项中记载的核酸；(11)转化体，其特征是含有上述第(10)项记载的载体；(12)上述第(1)-(7)项中任一项记载的蛋白质或它的部分多肽的制造方法，其特征是在适合增殖的营养培养基中培养上述第(11)项记载的转化体，使它生成含有作为重组蛋白质的D-泛酸内酯水解酶或其盐的上述第(1)-(7)项中任一项记载的蛋白质或它的部分多肽；(13)D-泛酸内酯的制造方法，该方法是利用上述第(1)-(7)项中任一项记载的蛋白质或其部分多肽或上述第(11)项记载的转化体通过D，L-泛酸内酯的光学拆分来制造D-泛酸内酯。
更具体地讲，本发明提供具有序列表中序列号1所表示的氨基酸序列的D-泛酸内酯水解酶或它的盐。
附图的简单说明
图1给出了通过D-泛酸内酯水解酶的消化多肽的解析得到的氨基酸序列。
图2给出了对应于D-泛酸内酯水解酶的消化多肽的cDNA氨基酸序列的部位。
图3给出了以D-泛酸内酯水解酶的基因组DNA为模板的PCR中使用的引物的结构。
图4给出了用于构建D-泛酸内酯水解酶表达载体的PCR中使用的引物的结构。
图5给出了D-泛酸内酯水解酶的氨基酸序列和编码该酶的碱基序列。
实施发明的最佳方式本发明提供了如下一些技术和方法，即编码天然的D-泛酸内酯水解酶，例如来源于尖镰孢的天然的D-泛酸内酯水解酶或者是编码实质上具有与该酶同等活性的蛋白质的基因的克隆、鉴定、特征序列的确定(测序)、该基因与表达载体的重组等操作，使用含有编码该蛋白质的碱基序列的DNA转化宿主细胞，然后培养、增殖，用该宿主细胞制造该蛋白质、以及提供这些蛋白质和宿主细胞的用途。以下按顺序予以详细地说明。本发明还提供利用编码上述D-泛酸内酯水解酶基因的各种手段，利用如此分离得到的D-泛酸内酯水解酶基因，提供效率高而且利于生产的D-泛酸内酯水解酶生产系统。
本发明涉及如下一些内容具有天然D-泛酸内酯水解酶活性或实质上具有与该酶同等活性或是实质上具有同等的一级结构的蛋白质或它的盐、该蛋白质的特征部分多肽或它的盐；编码它们的基因、例如DNA、RNA等；利用基因重组技术对该基因进行重组，获得含有该基因的载体或质粒；用这样的载体等转化的宿主细胞；培养该宿主细胞，制造该蛋白质或它的盐的方法；利用基因操作获得的宿主细胞和重组蛋白或它的盐等进行D、L泛酸内酯的光学拆分，合成D-泛酸内酯的方法以及称之为固定化酶的生产D-泛酸内酯的系统方法。
本发明具体地说明了理想的D-泛酸内酯水解酶或它的盐，其特征是具有序列表中序列号1表示的氨基酸序列或实质上具有与其同等的氨基酸序列，但本发明的D-泛酸内酯水解酶包括任何具有水解D-泛酸内酯能力的含有新的氨基酸序列的酶。只要是具有相当的水解D-泛酸内酯的活性的酶就可以。最理想的本发明的D-泛酸内酯水解酶是具有序列表中序列号1表示的氨基酸序列或实质上具有与其同等和/或同一氨基酸序列的酶。
本发明的D-泛酸内酯水解酶基因例如可用如下方法克隆。而基因重组技术如以下一些文献报道的例如T.Maniatis et al.，“MolecularCloning”，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.T.(1989)；日本生化学会编、“续生的化学实验讲座1、基因研究法II”、东京化学同人(1986)；日本生化学会编、“新生物化学实验讲座2、核酸III(重组DNA技术)”东京化学同人(1992)；R.Wued.，“Methods in Enzymology”，Vol.68，Academic Press，NewYork(1980)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100&101，Academic Press，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，“ Methods inEuzymology”，Vol.153，154&155，Academic Press，New York(1987)。使用上述文献记载的方法或其引文中记载的方法或是实质上与这些方法相同的方法或是改进方法可以进行基因重组操作。这些方法和手段可以进行改进使其适合于本发明的目的。
1)D-泛酸内酯水解酶的部分基因组DNA的克隆破碎经培养得到的尖镰孢菌体，按常规方法将染色体DNA离心分离后，分解除去RNA、除去蛋白质、精制DNA成分。关于这些操作参照“植物生物技术实验手册农村文化社、252页”。若是具有生产D-泛酸内酯水解酶能力的属于镰孢属的微生物，用作DNA源最合适。作为镰孢属微生物例如可以用尖镰孢IFO5942、半裸镰孢(FusariumSemitectam)IFO30200等。
同样，属于柱孢属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、周刺座霉属、粘帚霉属、散囊菌属、丛赤壳属、裂盾菌属、漆斑菌属、脉孢菌属、支顶霉属、锈生座孢属、犁头霉属、孢子丝菌属、轮枝孢属、节皮菌属的各种微生物中具有生产D-泛酸内酯水解酶能力的微生物也可用作DNA源。例如Cylindrocarpon tonkinense IFO30561，藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)IFO6349，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)IFO4033，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)IFO4626，米根霉(Rhizopus Oryzae)IFO4706，Volutella buxi IFO6003，链孢粘帚霉(Gliocladium Catenulatum)IFO6121，Euotium chevalieri IFO4334，Nectria elegans IFO7187，Schizophyllum Commune IFO4928，露湿漆斑菌(Myrothecium rovidum)IFO9531，粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)IFO6067，Acremonium fusidioides IFO6813，柄锈生座孢(Tuberculina persicina)IFO6464，李克梨头霉(Absidialichtheimi)IFO4009，Sporothrix schenckii IFO5983 Verticilliummalthousei IFO6624，Arthroderma uncinatum IFO7865等。其中“IFO”代表财团法人发酵研究所〔(邮序列号532)大阪市淀川区十三本町二丁日17番85号〕，这里给出的号码代表财团法人发酵研究所的目录序列号。
2)探针的制作根据D-泛酸内酯水解酶的内部多肽的氨基酸信息制备合成寡核苷酸引物。例如，根据从上述微生物中具有生产D-泛酸内酯酶水解能力的微生物纯化D-泛酸内酯水解酶的内部多肽的氨基酸信息可以合成寡核苷酸引物。典型的情况是，根据氨基酸序列，制备简并的引物。可用本领域内众所周知的方法制备引物，例如，使用DNA自动合成装置，按照磷酸二酯法，磷酸三酯法，亚磷酸酰胺方法等就可合成引物。具体来说，将尖镰孢IFO5942于营养培养基中培养，从培养得到的菌体纯化D-泛酸内酯水解酶，根据需要，用肽水解酶等切断纯化的酶，然后收集该酶内部多肽的氨基酸序列的信息。从得到的氨基酸信息制备理想的合成的寡核苷酯引物。利用这一引物，再以D-泛酸内酯水解酶的基因组DNA为模板，就可进行PCR反应了。PCR反应可按着本领域内众所周知的方法或是按实质上与该方法同样的方法或改进的方法进行。例如可根据R.Saiki，et al.，Science，Vol.230，pp.1350(1985)；R.Saiki，et al.，Science，Vol.239，pp.487(1988)；Henry.a.Erlich，PCR Technology，Stockton Press等记载的方法进行PCR反应。可使用市售的试剂盒或试剂进行反应。
对得到的扩增的DNA片段测序，确认含有与纯化酶内部多肽的氨基酸序列相同的碱基序列，然后用同位素标记作成探针，用于以后的实验等。碱基序列的测定可用双脱氧法，例如M13双脱氧法、Maxam-Gilbert法等进行。有时可以用市售的测序试剂盒，例如Taq染色引物循环测序试剂盒等，或是用碱基序列自动测定仪，例如用荧光DNA测序仪进行。为了用放射性同位素标记探针，可以使用市售的标记试剂盒，例如随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer Mannhaim)等来进行标记。
3)D-泛酸内酯水解酶cNDA的克隆a)mRNA的制备和cDNA文库的构建破碎培养得到的尖镰孢菌体，按AGPC法提取全部RNA，再用适当的方法，例如用寡dT纤维素柱纯化mRNA。典型的纯化mRNA操作可根据本领域内众所周知的方法或实质上与该方法同样的方法或是改进方法进行，也可按下列文献记载的方法，例如胍-氯化铯法、硫氰酸胍法、苯酚法等方法进行mRNA的纯化，所说的文献是T.Maniatis etal.，“Molecular Cloning”，2nd Ed.，Chapter 7.Cold Spring HarborLaboratory Cold Spring Harbor，N.T.(1989)；L.grossman et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.12，Part A&B，Academic Press，NewYork(1968)S.L.Berger et al.，ed.，“Methods in Enzymology”Vol.152，p.33&p.215，Academic Press，New York(1987)；Biochemistry185294-5299，1979。根据需要，使用寡(dT)纤维素柱等对总RNA进行分级纯化，可得到聚(A)mRNA。而若是属于镰孢属的具有生产D-泛酸内酯水解酶能力的微生物用作mRNA源最合适。作为镰孢属微生物可以使用尖镰孢IFO5942，半裸镰孢(Fusarium Semitectam)IFO30200等微生物。
同样属于下列各属的具有生产D-泛酸内酯水解酶能力的微生物也可用作mRNA源。这些微生物为柱孢属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、周刺座霉属、粘帚霉属、散囊菌属、丛赤壳属、裂盾菌属、漆斑菌属脉孢菌属、支顶孢属、锈生座孢属、犁头霉属、孢子丝菌属、轮枝孢属、节皮菌属。相应可用作mRNA源的微生物可例举如下Cylindrocarpon tonkinense IFO30561，藤仓赤霉(Gibberellafujikuroi)IFO6349，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)IFO4033，产黄青霉(Penicilljum chrysogenum)IFO4626，米根霉(RhizopusOryzae)IFO4706，Volutella buxi IFO6003，链孢粘帚霉(GliocladiumCatenulatum)IFO6121，Euotium chevalieri IFO4334，Nectriaelegans IFO7187，Schizophyllum Commune IFO4928，露湿漆斑菌(Myrothecium rovidum)IFO9531，粗糙脉孢菌(NeurosporaCrass)IFO6067，Acremonium fusidioides IFO6813，柄锈生座孢(Tuberculina persicina)IFO6464，李克梨头霉(Absidialichtheimi)IFO4009，Sporothrix schenckii IFO5983 Verticilliummalthousei IFO6624，Arthroderma uncinatum IFO7865等。
用所得mRNA作模板，使用逆转录酶等合成cDNA。运用mRNA和逆转录酶合成cDNA是用本领域内众所周知的方法或实质上与该方法同样的方法或是改进的方法进行。也可用文献H.Land et al.，“NucleicAcid Res.”，Vol.9，2251(1981)U.Gubler et al.，“Gene”，Vol.25，263-269(1983)，S.L.Berger et al.ed.，“Methods in Enzymology”Vol.152，p.307，Academic Press，New York(1987)记载的方法进行。将得到的cDNA插入到市售的噬菌体载体中，然后用常规方法进行包装。以这样制备的cDNA为主体构建cDNA文库。
b)D-泛酸内酯水解酶cDNA的克隆用上述包装的cDNA文库感染宿主细胞，利用噬斑杂交筛选得到阳性噬斑。对得到的菌落测序，通过研究氨基酸序列可以确认D-泛酸内酯水解酶基因已被克隆。除使用噬菌体载体之外，为了进行大肠杆菌等宿主细胞的转化，可以使用，例如钙法、铷/钙法等本领域公知的方法或实质上与该方法同样的方法进行(D.Hanahan，J.Mol.Biol.，Vol.166，p.557(1983)等)。
以制备的cDNA为模板也可进行PCR扩增反应。典型的情况是可以使用上述2)中得到的引物。
用于重组D-泛酸内酯水解酶基因的质粒，只要是在基因工程中常用的宿主细胞(例如大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞、酵母等真核细胞)中可以表达该DNA的质粒，无论什么样的质粒都可以。在这样的序列内，例如，有可能导入适合于在选择的宿主细胞中表达的密码以及设计限制性内切酶作用部位。还应包含为使目的基因容易表达的调控序列、启动序列等，以及含有在连接目的基因中起作用的接头、衔接子等，以及控制抗生素耐性的、或是控制代谢的序列，用于选择的序列等。
理想的情况是可以使用适当的启动子，例如，在大肠杆菌为宿主细胞的质粒中，可使用trp启动子、lac启动子、tac启动子、ipp启动子λ噬菌体PL启动子等。若是以酵母作为宿主细胞可使用GAL1、GAL10启动子等。
以大肠杆菌作为宿主细胞的质粒例举如下pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3z、pGEM-4Z、pGEM-5zf(-)、pBluescript KSTM(stratagene)等。适合于在大肠杆菌中表达的质粒载体有pAS、pKK223(pharmacia)、pMC1403、pMC931、pKC30等。而以酵母作为宿主细胞的质粒有YIp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YCp型载体等，例如pGPD-2等载体。作为宿主细胞，是大肠杆菌时，例如来自大肠杆菌K12菌株的NM533 XLI-Blue、C600、DH1、HB101、JM109等。
本发明的基因工程技术中可以运用本领域已知的和广泛应用的限制性酶，逆转录酶、DNA修饰、分解酶(该酶可将DNA片段的结构进行修饰和转换以适合于克隆)、DNA聚合酶、末端核苷酸基转移酶、DNA连接酶等。限制性内切酶在R.J.Roberts，Nucleic Acids Res.Vol.13，P165(1985)；S.Linn et al.ed.Nucleases，p.109，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring，New York，1982等例举了一些，而逆转录酶，例如有来自鼠莫洛尼式白血病病毒(MMLV)的逆转录酶，来自禽类成髓细胞性白血病病毒(AMV)的逆转录酶，特别是RNaseH缺损体等最好用。DNA聚合酶，例如有大肠杆菌DNA聚合酶、作为其衍生物的克列诺片段、大肠杆菌噬菌体T4 DNA聚合酶、大肠杆菌噬菌体T7DNA聚合酶、耐热菌DNA聚合酶等。
末端核苷酸基转移酶如R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymolo-gy”、Vol.100.p.96，Academic Press.New York(1983)中记载的可在3’-OH末端加脱氧核苷酸(dNMP)的Td Tase等。DNA修饰、分解酶有内切核酸酶、外切核酸酶等，例如蛇毒磷酸酯酶、脾脏磷酸酯酶、大肠杆菌DNA内切核酸酶I、大肠杆菌DNA内切核酸酶III、大肠杆菌DNA内切核酸酶VII、λ内切核酸酶、DNase I、核酸酶SI、微球菌核酸酶等。作为DNA连接酶，例如大肠杆菌DNA连接酶、T4 DNA连接酶等。
而适合于克隆DNA基因构建DNA文库的载体有质粒、λ噬菌体、粘粒、P1噬菌体、F因子、YAC等载体，理想的是来自λ噬菌体的载体，例如，Charon 4A、Charon 21A、λgt10、λgt11、λDASH11，λFIXII、λEMBL3、λZAP11TM(stratagene)。
另外，根据与本发明相关的D-泛酯内酯水解酶的基因碱基序列，采用基因工程中常用的方法对D-泛酸内酯水解酶的氨基酸序列中适当进行1个至几个以上的氨基酸置换、缺失、插入、转移或添加，导入变异可以制造相应变异的蛋白质。这些变异、变换、修饰方法在以下文献中都有记载，即日本生物化学学会编“续生物化学实验讲座1、基因研究法II”p105(广濑进)、东京化学同人(1986)；日本生物化学学会编“新生物化学实验讲座2、核酸III(重组DNA技术)”、p233(广濑进)东京化学同人(1992)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methodsin Enzymology”Vol.154，p.350&p.367，Academic Press，New York(1987)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100，p.457&p.468，Academic Press.New York(1983)；J.A.wells et al.，“Gene”Vol.34，p.315(1985)；T.Grundstroem et al.“Nucleic AcidsRes.”Vol.13.p.3305(1985)；J.Taylor et al.，“Nucleic Acids Res.”Vol.13，p.8765(1985)R.Wu ed.，“Methods in Enzymology”Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant et al.，“Gene”Vol.44，p.177(1986)。例如利用合成寡核苷酸等进行的指定位置的变异导入法(特异部位的变异导入法)Kunkel法、dNTP[αs]法(Eckstein)法、利用亚硫酸或亚硝酸等的指定区域变异导入法等方法。
而得到的本发明的蛋白质可以通过化学上的手法对它含有的氨基酸残基进行修饰，或使用肽酶、例如胰蛋白酶、糜蛋白酶，木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、内切肽酶、外切肽酶等酶进行修饰，或是部分降解生成蛋白质的衍生物。而用基因重组法制造蛋白质时，可以融合蛋白质进行表达，也可以使其在体内或体外转变加工成实质上与天然的D-泛酸内酯水解酶具有同等的生物学活性的蛋白质。可以使用基因工程所常用的融合法，但这样融合的蛋白质可以利用其融合部位通过亲和层析等方法纯化。有关蛋白质结构的修饰、转换等可以参考例如日本生物化学学会编“新生物化学实验讲座1、蛋白质VIII，蛋白质工程，”东京化学同人(1993)，利用文献记载的方法或引用的文献中记载的方法以及实质与这些方法同样的方法进行蛋白质的修饰和转换。
这样一来，本发明的产物在同一性方面有1个以上的氨基酸残基与天然的产物不同，也可以是有一个以上的氨基酸残基的位置与天然的不同。所以本发明的D-泛酸内酯水解酶包括天然的D-泛酸内酯水解酶中缺失了1个以上的特有氨基酸残基的该酶缺失类似物(例如缺失1-80个，理想的缺失1-60个，再好些的缺失1-40个，更理想的是缺失1-20个，特别理想的是缺失1-10个氨基酸残基)，还包括有一个以上的特有氨基酸残基被其它残基置换的D-泛酸内酯水解酶的置换类似物(例如，有1-80个，理想一点的1-60个，再理想的1-40个，更理想的1-20个，特别理想的是有1-10个被置换)，还包括在天然的D-泛酸内酯水解酶上附加上一个以上的氨基酸残基的该酶的附加类似物(例如加上1-80个，理想的1-60个，再理想些1-40个，更理想的1-20个，特别理想的是加1-10个氨基酸残基)。含有天然D-泛酸内酯水解酶的特征结构域的产物也包括在本发明内。还可举出具有相同性质的D-泛酸内酯水解酶活性的产物。
如果维持着天然的D-泛酸内酯水解酶的特征结构域，象上面讲到的变异体全都包括在本发明中。我们认为实质上具有与天然的D-泛酸内酯水解酶同等的一级结构或含有其中一部分结构的产物也可包括在本发明中，而实质上具有与天然D-泛酸内酯水解酶同等生物学活性的产物也可认为包括在本发明中。也可以是天然产生的一种变异体。本发明的D-泛酸内酯水解酶可以按如下说明的那样进行分离纯化。一方面本发明包括编码上述的多肽的DNA序列，而且包括编码有全部天然特性的或是有部分特性的D-泛酸内酯水解酶的多肽及其类似物或衍生物的DNA序列。该D-泛酸内酯水解酶的碱基序列可以被修饰(例如，添加、删除、置换等)，这样被修饰的产物也可以包括在本发明中。
本发明的DNA序列提供了有关迄今为止人们还不知道的D-泛酸内酯水解酶蛋白质的氨基酸序列的信息，所以这样的信息的利用也包括在本发明中。信息利用指的是，例如编码D-泛酸内酯水解酶及其相关蛋白质的微生物，理想的是具有生产D-泛酸内酯水解酶能力的微生物的基因组DNA和cDNA的分离以及检测用探针的设计等。具有生产D-泛酸内酯水解酶能力的微生物有属于下列各属的微生物，如镰孢属、柱孢属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、周刺座霉属、粘帚霉属、散囊菌属、丛赤壳属、裂盾菌属、漆斑菌属、脉孢菌属、支顶孢属、锈生座孢属、犁头霉属、孢子丝菌属、轮枝孢属、节皮菌属。
本发明的DNA序列可以用作例如编码D-泛酸内酯水解酶及其相关蛋白质的具有生产D-泛酸内酯水解酶能力的微生物，特别是以镰孢属为首的微生物的基因组DNA和cDNA的分离和检测用的探针。分离基因时，可以利用PCR法以及用了逆转录酶(RT)的PCR法(RT-PCR法)。按照已被克隆、被确定了序列的D-泛酯内酯水解酶的cDNA序列推测的氨基酸序列选择其特征的序列区域，设计DNA引物并进行化学合成，利用得到的DNA引物运用PCR法、RT-PCR法、及其它方法，可进行D-泛酸内酯水解酶DNA及其相关DNA的分离和检测等。
就象上面说明的那样，按照本发明，可以提供将D-泛酸内酯水解酶的基因及其重组DNA分子移入宿主细胞中，使D-泛酸内酯水解酶表达，得到想要的D-泛酸内酯水解酶的方法。根据本发明也可提供实质上可表达D-泛酸内酯水解酶的基因的重组体或转染子及其制造方法和它的用途。
另一方面，可以认为本发明是涉及有可能在大肠杆菌等原核生物或真核生物表达的DNA和RNA等核酸，这些DNA和RNA是编码具有D-泛酸内酯水解酶活性的蛋白质或实质上与该酶具有同等活性的蛋白质或它的盐；最理想的是编码来自于尖镰孢的D-泛酸内酯水解酶或它的盐；或实质上具有与该酶同等活性或实质上具有与该酶同等一级结构的蛋白质中的一部分或全部的多肽。而这样的核酸，特别是DNA可以是(a)可以编码序列表中序列号1表示的氨基酸序列的碱基序列或与该序列互补的序列。(b)可以与(a)的DNA序列或它的片段杂交的序列，以及(c)可以与(a)或(b)序列杂交的具有简并密码的序列。用这样的核酸进行转化使本发明的表达多肽的大肠杆菌等原核生物或真核生物也成了本发明的特征。
按照本发明，将编码具有D-泛酸内酯水解酶活性的蛋白质的DNA或实质上与该蛋白质具有同等活性的蛋白质的DNA，或是含有可能表达该DAN的载体等的DNA导入具有生产D-泛酸内酯水解酶活性能力的微生物，例如导入属于镰孢属、柱孢属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、周刺座霉属、粘帚霉属、散囊菌属、丛赤壳属、裂盾菌属、漆斑菌属、脉孢菌属、支顶孢属、锈生座孢属、犁头霉属、孢子丝菌属、轮枝孢属、节皮菌属的微生物中，就可以得到改变了生产D-泛酸内酯水解酶能力的微生物。作为这样的微生物，例如有尖镰孢IFO5942，半裸镰孢IFO30200，Cylindrocarpon tonkinense IFO30561，藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)IFO6349，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)IFO4033，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)IFO4626，米根霉(Rhizopus Oryzae)IFO4706，Volutella buxi IFO6003，链孢粘帚霉(Gliocladium Catenulatum)IFO6121，Euotium chevalieri IFO4334，Nectria elegans IFO7187，Schizophyllum Commune IFO4928，露湿漆斑菌(Myrothecium rovidum)IFO9531，粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)IFO6067，Acremonium fusidioides IFO6813.柄锈生座孢(Tuberculina persicina)IFO6464，李克梨头霉(Absidialichtheimi)IFO4009，Sporothrix schenckii IFO5983 Verticilliummalthousei IFO6624，Arthroderma uncinatum IFO7865等。
转化的方法有用适当的细胞壁溶解酶制备原生质体化的细胞，然后在氯化钙、聚乙二醇存在下使DNA接触上述制备的原生质体化的细胞，或是用电穿孔法(例如E.Neumann et al.，“EMBO J”，Vol.1，pp.841(1982)等)，显微注射法，以及基因枪导入法等方法。
酶可以从各种原料，例如细胞培养液，细胞培养破碎物等，转化细胞等产酶材料用如下众所周知的方法纯化得到，这些方法是硫酸铵沉淀等盐析法、葡聚糖凝胶过滤法、使用例如带有二乙基氨基乙基或羧甲基等的载体的离子交换层析法、使用例如带有丁基、辛基、苯基等疏水性基团的载体的疏水性层析法、色素凝胶层析法、电泳法、透析、限外过滤法、亲和层析法、高速液相层析法等。如果得到的是包涵体，可以在盐酸胍，尿素等变性剂存在下，甚至根据需要，在2-巯基乙醇、二硫苏糖醇等还原剂存在下对包涵体进行处理，使其变成有活性的酶。也可将产酶细胞原封不动地用作酶。而固定化酶是用本领域内众所周知的方法将酶或产酶细胞固定化了的产物。酶的固定化是通过称之为共价结合法和吸附法的载体结合法、交联法、包埋法等方法进行的。例如，根据需要，可使用戊二醛、六甲撑二异氰酸酯、六甲撑二异硫氰酸酯等缩合剂进行酶的固定化。还有通过聚合反应使单体凝胶化的单体法，从通常的单体聚合成大分子的予聚合法，使多聚体凝胶化的聚合物法，还有使用聚丙烯酰胺的固定化，使用藻酸、胶原、明胶、琼脂、κ-角叉菜胶等天然高分子的固定化，使用光固化树脂、聚氨酯聚合物等合成高分子的固定化。而微生物的培养以及通过使用水解酶进行D-泛酸内酯的不对称水解，将内酯类化合物光学拆分以及对于生成物的处理，可以按特开平3-65198号和特开平4-144681号公报记载的那样进行。
例如，收集于液体培养基振荡培养的转化菌，然后加入D、L-泛酸内酯水溶液(2-60％浓度)，把pH调至6-8，于10℃-40℃条件下反应数小时至一天。反应结束后，分离菌体，使用有机溶剂(醋酸乙酯那样的酯类、苯那样的芳香族烃类、氯仿那样的卤化碳烃类等最理想)萃取分离反应液中未反应的L-泛酸内酯，而水相中残存的D-泛酸通过在盐酸酸性条件下加热使其内酯化，再通过上述的有机溶剂萃取就可得到生成的D-泛酸内酯。而转化菌的处理菌体(即，作成干燥菌体或固定化菌体等)以及从转化菌获得的酶和固定化酶等也可以同样进行。
通过利用上述的本发明的各种状态，可作为有关利用以D-泛酸内酯水解为首的内酯水解酶的酶的不对称水解的内酯类化合物的光学拆分法的合成研究的有用手段，或是可以提供适用于其它用途的各种技术手段。以下给出实施例，具体说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制，所以应该理解源于本发明说明书思想的各种各样的实施状态都是可能的。另外，说明书和图中用缩略号表示碱基和氨基酸等，这是根据IUPAC-IUB Commission on biochemical Nomenclature或根据本领域习惯用语的意思表示的。当在氨基酸中存在光学异构体时，只要是不特别指定的都表示L-型。
带有导入下述实施例1中得到的D-泛酸内酯水解酶基因的载体(PFLC40E)的大肠杆菌JM109(EJM-ESE-1)，从平成7年8月30日起(原保藏日)保藏于茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮编号305)的通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(NIBH)(保藏号FERM P-15141)，于平成8年8月28日由原保藏转换成根据布达佩斯条约的保藏，以保藏号FERM BP-5638保藏在NIBH。
实施例以下给出实施例，具体地说明本发明，本发明不受实施例的限制，应包含各种各样的形式。
实施例11)纯化酶的氨基酸序列的确定将按特开平4-144681号实施例1制备的冷冻干燥的D-泛酸内酯水解酶14.3nmol(亚基分子量为6万)溶解于含有8M尿素的50mMTris-HCl(pH9.0)44μl中，37℃变性1小时。再向该溶液中加入44μ150m M Tris-HCl(pH9.0)溶液使尿素浓度变成4M，然后添加12μl(0.144nmol，E/S＝1/100)的12nmol/ml的赖氨酰内肽酶(和光纯药)，于30℃消化12小时。得到的消化肽在反相柱(Nakarari Tesuku)上进行分离、利用ABI社477A蛋白质测序仪进行了氨基酸的序列分析。
分离条件柱Cosmosil 5C 18-AR(4.6×250mm)流速1ml/min温度35℃检测波长210nm洗脱液A，0.1％TFA(三氟乙酸)B，0.1％TFA/80％CH3CN洗脱条件A→B的梯度洗脱(15％/min)氨基酸序列分析的结果如图1和图2所示。
2)基因组DNA的制备a)D-泛酸内酯水解酶的基因组DNA的抽提法利用减压过滤收集对数增殖后期的菌体，将菌体放入液氮里，用韦林式搅切器将菌体破碎，将达到一定细度的菌体移入研钵，边加液氮边研磨。然后研好的菌体悬浮于70℃保温的2×CTAB液(2％CTAB(溴化十六烷基三甲基铵，Sigma)、0.1M Tris-HCl，pH8.0，1.4m NaCl，1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮，sigma)中，于65℃温育3-4小时。离心分离，上清依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿处理，最后用异丙醇使DNA沉淀。用70％乙醇洗净，风干后，溶解于TE(Tris-10mM-EDTA 1mMpH7.8)。用核糖核酸酶A和核糖核酸酶T1分解RNA，再依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿处理，进行除去蛋白质的操作。最后用等体积的异丙醇使DNA沉淀。用70％乙醇洗净，风干后溶解于TE液中，制得基因组DNA标准样品。
b)D-泛酸内酯水解酶基因的扩增根据D-泛酸内酯水解酶内部多肽的氨基酸序列的信息(图1、图2)分别合成对应于N-末端氨基酸序列的有意义链的有意义引物和对应于内部多肽序列的反意义链的反意义引物(图3)。
以D-泛酸内酯水解酶基因组DNA为模板，在下列条件下进行PCR反应。PCR扩增可按照例如R.Saiki，et al.，Science，Vol.230，pp.1350(1985)；R.Saiki，et al.，Science，Vol.239，pp.487(1988)；PCRTechnology，Stockton Press(1989)等文献记载的方法进行。通过PCR扩增可得到大约1kb的扩增的DNA片段。
PCR条件染色体DNA 2.5μg有意义引物 250pmol(参考图3)反意义引物 250pmol(参考图3)dNTP(2mM) 5μlTth聚合酶缓冲液(X10) 5μlTthDNA聚合酶(东洋纺) 3unitsH2O合计50μl92℃/1分钟、55℃/1分钟、73℃/3分钟共进行30个循环。
将得到的扩增的DNA片段测序，转换成氨基酸序列，发现了D-泛酸内酯水解酶内部多肽的部分氨基酸序列的部位。
3)cDNA的制备a)mRNA的制备收集对数增殖前期的菌体，立即于液氮中冷冻破碎后按AGPC(Acid Guanidinium thiocyanate Phenol Chloroform)法(例如，实验医学，Vol.No.15p99(1991))抽提总RNA。将得到的总RNA加到聚dT-纤维素柱(Pharmacia)进行纯化。
b)cDNA文库的制备以得到的mRNA为模板，用cDNA rapido衔接子连接模式(cDNArapido adaptor ligation module，cDNA Synthesis module RPN1256，1994Pharmacia社(Amersham International pic))合成cDNA。
c)D-泛酸内酯水解酶cDNA的克隆用cDNA文库感染宿主大肠杆菌，通过噬斑杂交得到阳性噬斑，杂交用的探针是以含有尖镰孢的D-泛酸内酯水解酶基因的大约1kb的片段为模板，用多引物法进行标记制备。对得到的克隆进行测序，转换成氨基酸序列，结果可以判明成功地克隆了上述的D-泛酸内酯水解酶基因的全长。
这样一来得到了序列号2表示的碱基序列。由该碱基序列编码的与序列号1表示的氨基酸序列有相同性的序列并不存在于NBRF(National Biomedical Research Foundation)蛋白质序列资料库中，所以带有这一碱基序列的DNA被认为是全新的序列。
确定了碱基序列的cDNA中其N末端部分缺失一部分，没有起始密码，可以通过PCR法构建重新插入了起始密码的表达载体(命名为PFLC40E)。
制备带有图4表示的限制酶切位点的有意义和反意义引物的合成寡核苷酸，用这些引物在以下条件下进行PCR反应。PCR扩增例如可按R.Saiki.et al.，Science，Vol.230，pp.1350(1985)；R.Saili，et al.，Science.Vol.239，pp.4891(1988)；PCR Technology，Stockton Press(1989)等文献记载的方法进行。
PCR条件总DNA(cDNA) 10μg有意义引物0.1nmol(参考图4)反意义引物0.1nmol(参考图4)dNTP(2mM) 10μlTth聚合酶缓冲液(X10) 10μlTthDNA聚合酶4unitsH2O合计100μl94℃/1分钟， 55℃/1分钟，75℃/3分钟；共进行30循环。
这样制备的PCR产物，其两端分别带有EcoR1和Xba1限制酶切位点，所以用各限制酶(EcoR1(宝酒造)和Xbal(宝酒造))处理，与pUC18进行连接反应(宝酒造连接试剂盒)，构建表达载体(PFLC40E)。
接下来按照“ Molecular Cloning”Second ed.，1989，ed.by J.Sambrook et al.，Cold Spring Habor Laboratory Press记载的方法用上面构建好的载体转染E.coli JM109感受态细胞，进行转化工作。该转化体在含有50mg/l的氨苄青霉素的2×YT培养基(色氨酸1.5％，酵母抽提液1％，NaCl0.5％)上进行筛选。转化处理按氯化钙法进行。
这样得到的重组大肠杆菌在含有50mg/l的氨苄青霉素2×YT培养基10ml试管中予培养，这个予培养液(计100μl)作为菌种在与予培养液有相同组成的本培养液100ml中进行了培养时间、培养温度、以及异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)添加时间的研究。培养结果如表1所示。培养后将得到的菌体超声破碎，用离心的上清测定D-泛酸内酯水解酶的活性。在最适条件下的比活是2.25U/mg。D-泛酸内酯水解酶活性测定在以下条件下进行的，以1分钟内水解1μmol的D-泛酸内酯的酶活作为1个活性单位(unit)。向10％浓度的D-泛酸内酯的0.5M PIPES缓冲液(pH7.0)200μl加入50μl酶液，于30℃反应120分钟后再加入250μl的2mMEDTA甲醇溶液，终止反应。然后用HPLC(Nucleosil 5C184.6×150mm、洗脱液为10％甲醇、流速1ml/min、检测波长230nm)求出反应终止液的水解率。例如如果水解率为1％，则相应的1ml酶液的活性就是1.6×102U/ml。
用PFLC40E转化的大肠杆菌JM109是在2×YT培养基中培养的。加入IPTG使最终浓度为2mM。
aIPTG于培养开始的同时加入到2×YT培养基中。
bIPTG是在培养开始后4小时加入到2×YT培养基中。
进行SDS-PAGE的结果检测出了离心沉淀的不溶性组分中的浓的予想分子量的粗带，进行印迹，通过Edman降解法分析其N末端的氨基酸序列的结果表明该蛋白的序列与D-泛酸内酯水解酶的序列一致。因此可以认为D-泛酸内酯水解酶cDNA在这个大肠杆菌表达系统中虽然有一部分D-泛酸内酯水解酶是以可溶性形式表达的，但大部分是以包涵体形式表达的。含有导入了上述D-泛酸内酯水解酶基因的载体(PFLC 40E)的大肠杆菌JM109(EJM-ESE-1)保藏于茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮编号305)的通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(NIBH)，保藏号为FERM PB-5638〔平成7年8月30日(原保藏日)保藏的保藏号是FERMP-15141(微工研菌寄第P-15141号原保藏)，于平成8年8月28日根据布达佩斯条约提出了保藏的移管申请〕。
产业上利用的可能性根据本发明，编码天然的D-泛酸内酯水解酶例如编码来自尖镰孢的天然的D-泛酸内酯水解酶或编码实质上具有与该酶同等活性的蛋白质的基因结构已经清楚了。有望在用含有编码该蛋白质的碱基序列的DNA转化宿主细胞，再用该宿主细胞制造该蛋白质的方法方面，以及在用这些蛋白和用宿主细胞制造D-泛酸内酯的用途方面有飞跃的发展。还有可能通过D-泛酸内酯水解酶本身的改变使酶的活性急剧上升。序列表〔序列号1〕序列的长度380序列类型氨基酸拓扑型直链序列种类多肽序列Ala Lys Leu Pro Ser Thr Ala Gln Ile Ile Asp Gln Lys Ser Phe Asn1 5 10 15Val Leu Lys Asp Val Pro Pro Pro Ala Val Ala Asn Asp Ser Leu Val20 25 30Phe Thr Trp Pro Gly Val Thr Glu Glu Ser Leu Val Glu Lys Pro Phe35 40 45His Val Tyr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Val Ile Gly Lys Asp Pro Ser50 55 60Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ser Asp Thr Asp Pro Ile Phe His Glu Ala65 70 75 80Val Val Trp Tyr Pro Pro Thr Glu Glu Val Phe Phe Val Gln Asn Ala85 90 95Gly Ala Pro Ala Ala Gly Thr Gly Leu Asn Lys Ser Ser Ile Ile Gln100 105 110Lys Ile Ser Leu Lys Glu Ala Asp Ala Val Arg Lys Gly Lys Gln Asp115 120 125Glu Val Lys Val Thr Val Val Asp Ser Asn Pro Gln Val Ile Asn Pro130 135 140Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Lys Gly Asn Ile Ile Phe Ala Gly Glu Gly145 150 155 160Gln Gly Asp Asp Val Pro Ser Ala Leu Tyr Leu Met Asn Pro Leu Pro165 170 175Pro Tyr Asn Thr Thr Thr Leu Leu Asn Ash Tyr Phe Gly Arg Gln Phe180 185 190Asn Ser Leu Asn Asp Val Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Asp Leu Tyr195 200 205Phe Thr Asp Thr Leu Tyr Gly Tyr Leu Gln Asp Phe Arg Pro Val Pro210 215 120Gly Leu Arg Asn Gln Val Tyr Arg Tyr Asn Phe Asp Thr Gly Ala Val225 230 235 240Thr Val Val Ala Asp Asp Phe Thr Leu Pro Asn Gly Ile Gly Phe Gly245 250 255Pro Asp Gly Lys Lys Val Tyr Val Thr Asp Thr Gly Ile Ala Leu Gly260 265 270Phe Tyr Gly Arg Asn Leu Ser Ser Pro Ala Ser Val Tyr Ser Phe Asp275 280 285Val Asn Gln Asp Gly Thr Leu Gln Asn Arg Lys Thr Phe Ala Tyr Val290 295 300Ala Ser Phe Ile Pro Asp Gly Val His Thr Asp Ser Lys Gly Arg Val305 310 315 320Tyr Ala Gly Cys Gly Asp Gly Val His Val Trp Asn Pro Ser Gly Lys325 330 335Leu Ile Gly Lys Ile Tyr Thr Gly Thr Val Ala Ala Asn Phe Gln Phe340 345 350Ala Gly Lys Gly Arg Met Ile Ile Thr Gly Gln Thr Lys Leu Phe Tyr355 360 365Val Thr Leu Gly Ala Ser Gly Pro Lys Leu Tyr Asp370 375 380〔序列号2〕序列的长度1140序列类型核酸链数2条链拓扑型直链序列种类cDNA起源生物名尖镰孢IFO5942序列GCTAAGCTTCCTTCTACGGCTCAGATTATTGATCAGAAGTCGTTCAATGTCTTGAAGGAT60GTGCCACCTCCTGCAGTGGCCAATGACTCTCTGGTGTTCACTTGGCCTGGTGTAACTGAG120GAGTCTCTTGTTGAGAAGCCTTTCCATGTCTACGATGAAGAGTTTTACGATGTAATTGGA180AAAGACCCCTCTTTGACCCTCATCGCAACATCGGACACCGACCCAATCTTCCATGAGGCT240GTCGTATGGTATCCTCCTACTGAAGAGGTGTTCTTTGTGCAGAATGCTGGCGCTCCTGCC300GCAGGCACTGGCTTGAACAAGTCTTCCATCATTCAGAAGATTTCCCTCAAGGAGGCCGAT360GCTGTTCGCAAGGGCAAGCAGGATGAGGTCAAGGTCACAGTTGTTGACTCGAACCCTCAG420GTTATCAACCCAAATGGTGGTACTTACTACAAGGGCAACATCATCTTCGCTGGTGAGGGC480CAAGGCGACGATGTTCCCTCTGCGCTGTACCTCATGAACCCTCTCCCTCCTTACAACACC540ACCACCCTTCTCAACAACTACTTCGGTCGCCAGTTCAACTCCCTCAACGACGTCGGTATC600AACCCCAGGAACGGTGACCTGTACTTCACCGATACCCTCTACGGATATCTCCAAGACTTC660CGTCCTGTTCCTGGTCTGCGAAACCAGGTCTATCGTTACAACTTTGACACTGGCGCTGTC720ACTGTTGTCGCTGATGACTTTACCCTTCCCAACGGTATTGGCTTTGGCCCCGACGGCAAG780AAGGTTTATGTCACCGACACTGGCATCGCTCTCGGTTTCTACGGTCGCAACCTCTCTTCT840CCCGCTTCTGTTTACTCTTTCGACGTGAACCAGGACGGTACTCTTCAGAACCGCAAGACC900TTTGCTTATGTTGCCTCATTCATCCCCGATGGTGTCCACACTGACTCCAAGGGTCGTGTT960TATGCTGGCTGCGGTGATGGTGTCCATGTCTGGAACCCCTCTGGCAAGCTCATCGGCAAG1020ATCTACACCGGAACGGTTGCTGCTAACTTCCAGTTTGCTGGTAAGGGAAGGATGATAATT1080ACTGGACAGACGAAGTTGTTCTATGTCACTCTAGGGGCTTCGGGTCCCAAGCTCTATGAT1140
权利要求
1.一种具有天然的D-泛酸内酯水解酶活性或实质上具有与该酶同等活性或具有与该酶同等的一级结构的蛋白质或它的盐。
2.权利要求1记载的蛋白质，其特征是它来源于属于下列各属的微生物镰孢属、柱孢属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、周刺座霉属、粘帚霉属、散囊菌属、丛赤壳属、裂盾菌属、漆斑菌属、脉孢菌属、支顶孢属、锈生座孢属、犁头霉属、孢子丝菌属、轮技孢属和节皮菌属。
3.权利要求1记载的蛋白质，其特征是该天然的D-泛酸内酯水解酶来自镰孢属微生物。
4.权利要求1-3中任一项记载的蛋白质，是具有序列表中序列号1表示的氨基酸序列或实质上具有与该序列同等的氨基酸序列的D-泛酸内酯水解酶或它的盐。
5.权利要求1-4中任一项记载的蛋白质，是在原核生物中表达外源性DNA序列获得的产物。
6.权利要求1-5中任一项记载的蛋白质，具有序列表中序列号1表示的氨基酸序列或实质上具有与该序列同等的氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任一项记载的蛋白质的部分多肽或它的盐。
8.具有编码权利要求1-7中任一项记载的蛋白质或它的部分多肽的碱基序列的核酸。
9.权利要求8记载的核酸，其特征是在序列表中序列号2表示的碱基序列中具有可译框架部分或实质上具有与该框架部分同等活性的碱基序列。
10.含有权利要求8或9中记载的核酸的载体。
11.含有权利要求10中记载的载体的转化体。
12.包括D-泛酸内酯水解酶或其盐的权利要求1-7中任一项记载的蛋白质或它的部分多肽的制造方法，其特征是，在适合增殖的营养培养基中培养权利要求11记载的转化体，以重组蛋白的形式生成包括D-泛酸内酯水解酶或其盐的权利要求1-7中任一项记载的蛋白质或其部分多肽。
13.D-泛酸内酯的制造方法，其特征是使用权利要求1-7中任一项记载的蛋白质、其部分多肽或权利要求11记载的转化体，通过D、L-泛酸内酯的光学拆分来制造D-泛酸内酯。
全文摘要
本发明提供用于通过D、L-泛酸内酯的D-型选择性的不对称水解进行光学拆分的一种新的酶以及编码该酶的基因。本发明阐明了编码天然的D-泛酯内酯水解酶的基因，例如来自尖镰孢的天然的D-泛酸内酯水解酶的基因或者是编码实质上具有与该酶同等活性的蛋白质的基因，同时提作用含有编码该蛋白质碱基序列的DNA转化宿主细胞再用该宿主细胞制造该蛋白质的方法，还提供这些蛋白质和宿主细胞的用途。
文档编号C12N15/55GK1166182SQ96191238
公开日1997年11月26日 申请日期1996年9月13日 优先权日1995年9月13日
发明者坂本惠司, 山田秀明, 清水昌, 小林达彦 申请人:富士药品工业株式会社