一种反刍动物内源氮排泄量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及反刍动物内源氮排泄量测定领域，更具体涉及一种测定反刍动物消化 道不同部位内源氮排泄量的方法，以便于准确定量测定反刍动物消化道不同部位内源氮排 泄量，降低测定成本；并通过营养调控手段，降低反刍动物氮排放。
【背景技术】
[0002] 动物即使在采食无氮日粮时，其粪便和尿液中仍还有一定氮素，此类氮即为内源 氮，是动物生理代谢过程中不可避免的。粪中内源氮主要来源于动物体内酶、肠脱落细胞、 血浆清蛋白、氨基酸等；而尿中内源氮主要来源于动物机体内氮代谢产物如尿素和尿酸等。 目前，关于动物消化道内源氮排泄量的测定方法，主要采用无氮日粮法、完全可消化蛋白源 或静脉灌注平衡氨基酸法、肽营养超滤技术、回归分析法、高精氨酸法、氨基酸库法和同位 素标记内（外）源氮法，这些测定方法在理论、技术或应用等方面均或多或少存在某些不 足。无氮日粮法是动物处于非正常生理条件下测定内源氮最简单的经典方法，但由于动物 处在非正常的生理状态，缺乏日粮蛋白质或肽对消化酶的刺激，因此低估内源氮排泄量；完 全可消化蛋白源或静脉灌注平衡氨基酸法，该方法的前提条件是酪氨酸或平衡氨基酸在消 化道内被完全吸收，而事实上日粮粗纤维水平和抗营养因子等含量均影响内源氮的排泄与 吸收；肽营养超滤技术的不足之处在于超滤技术本身的技术难度以及没有考虑日粮因素对 内源氮损失的影响；回归分析法与无氮日粮法并没有本质差异；高精氨酸法适用于日粮仅 有唯一蛋白质来源的情况，且日粮赖氨酸胍基化的充分与否随日粮蛋白质来源的不同而有 差异；氨基酸库法涉及到动物体多个组织取样和内容物中内源氨基酸的测定，在实际应用 中较为复杂；同位素标记内源氮法的不足在于该方法计算过程较为复杂、费用昂贵；同位 素标记外源氮法费用昂贵，且其最大疑义是随着食入标记饲料之后时间的延长，再循环干 扰增大，吸收后又进入肠腔的标记内源氮排泄量逐渐增多，外源氮流量测定值偏高，导致低 估内源氮排泄量；同时费用昂贵。
[0003] 大气中二氧化碳（C02)约含98. 9% 12C和1. 1 % 13C同位素，光合作用过程中植物 是排斥13c的，而动物在利用日粮氨基酸合成体蛋白时并不排斥由 13C来提供碳架。植物可 通过两条途径固定C02，一是C4途径，该途径的C0 2受体是叶肉细胞细胞质中的磷酸烯醇式 丙酮酸，在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化下，固定HC03lC0 2溶解于水），生成含四个碳原子 的二羧酸-草酰乙酸，所以这个反应途径称为四碳双羧酸途径，简称C4途径；其二是C 3途 径，该途径的C02受体是一种戊糖，即核酮二磷酸，故又称为还原戊糖磷酸途径，这个途径的 C02固定最初产物是一种三碳化合物，故又称为C3途径。植物在固定C02时，c 4途径比c3 途径对13c的排斥程度低。小麦、大麦和大豆是c3植物，而玉米、高粱和甘蔗是c4植物。在 植物生理学上， 13c丰度通常用δ 13c(%。）表示，C3和C4植物的δ 13c分别为-28. 1±2. 5%。 和-13. 5±1. 5%。。，其计算公式为：
[0004]
[0005] 奶牛产品中13C:12C能反映出奶牛所消化的饲料中稳定性同位素的比值。放牧反刍 动物所消耗的C 3植物和C4植物的比例，可以根据日粮、瘤胃内容物与粪样中自然富集的13C 比例测定。与饲喂(：4植物的奶牛相比，饲喂c3植物的奶牛，其毛发和牛奶中13c: 12c较低。 另有研究发现动物机体的同位素组成与其日粮的同位素组成相似。如果奶牛由放牧在只有 c3植物的牧场突然改变为饲喂含有c4植物的日粮，则可以通过测定牛奶中同位素的浓度判 别其C的来源，即：若牛奶中 13C: 12C与C4植物的比值一致，则表明所有C源都直接来源于日 粮；若牛奶中13c: 12C与C3植物的比值一致，则表明所有C源均来自体组织；若13c: 12c比值 介于两者之间，则表明C源来自于日粮和体组织，而两者各自的贡献可以通过比例关系计 算得到。
[0006] 综上所述，本发明应用自然富集的13c标记饲料饲喂动物时，通过对动物组织进 行标记，进而通过分析饲料样品、动物组织样品和不同消化道部位食糜样品中的 13c丰度 (13c: 12c)，对动物内源氮排泄量进行测定。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种反刍动物内源 氮排泄量的测定方法，方法易行，操作简单、准确并能测定动物消化道不同部位内源氮排泄 量。本方法采用了植物自然富集的 13c为稳定性同位素进行标记，测定成本低廉；同时是在 反刍动物正常生理状态下测定，测定结果准确。
[0008] 为了实现上述的目的，本发明通过以下述技术方案予以实现：
[0009] 以3头安装十二指肠近端和回肠末端瘘管的健康阉山羊为试验对象，饲喂由C3植 物（通过还原戊糖磷酸途径固定C0 2的植物，即C3植物）组成的饲料12周后，添加三氧化 二铬（Cr203)作为标记物，采集饲料样品、颈静脉血、十二指肠和回肠食糜样品以及粪样，测 定消化道不同部位内源氮排泄量。一种测定反刍动物消化道不同部位内源氮排泄量的方 法，其步骤如下：
[0010] A、选择C3植物饲料原料，根据试验山羊营养需要量配制饲料，试验山羊饲料参考 中华人民共和国农业行业标准-肉羊饲养标准配制，以1. 3倍维持需要量设计饲料配方，试 验山羊饲喂11 一 13周；山羊营养配制饲料组成如下：水稻秸杆45.0%、糙米33. 99%、豆柏 9. 02%、大豆油8. 76%、碳酸钙0. 08%、磷酸氢钙0. 65%、氯化钠0. 50%、预混料2. 0%，饲 料 13C 丰度（δ 13，％。）为-24. 78%〇。
[0011] Β、实现C3植物中自然富集的13C在试验山羊机体组织稳定标记，随后安装十二指 肠近段和回肠末端瘘管，确定试验山羊机体组织 13C稳定标记时间：分别在试验山羊饲喂0、 4、8、12、16周时通过颈静脉采血，分离血浆，利用同位素质谱仪分析血浆中13C丰度，并与 饲料中13C丰度进行比较，确定饲料中植物自然富集的13C在山羊机体组织内稳定标记的时 间；
[0012] C、安装试验山羊十二指肠近段和回肠末端瘘管：试验山羊饲喂12周后，分别在 十二指肠近段和回肠末端安装T型瘘管，并连续10天肌肉注射青霉素和链霉素进行护理， 确保试验山羊创口恢复良好，采食量恢复到术前水平；
[0013] D、在饲料中按3 - 5克/天添加 Cr203作为食糜标记物，连续饲喂5 - 10天；并在 第5-7天分别采集饲料、颈静脉血、十二指肠食糜、回肠食糜、粪样，测定饲料中干物质和氮 含量；
[0014] E、测定十二指肠食糜、回肠食糜和粪样中干物质、氮含量和铬浓度；分离饲料样中 游离氨基酸，并测定游离氨基酸中13c丰度；分离十二指肠食糜、回肠食糜和粪样中微生物， 进而将分离微生物后的食糜进一步分离游离氨基酸，并测定游离氨基酸中 13c丰度；样品 采集：在饲喂添加三氧化二铬饲料一周内的第5-7天，分别在不同时间点采集饲料、颈静脉 血、十二指肠食糜、回肠食糜和粪样；
[0015] F、样品处理：分别采集饲料、颈静脉血、十二指肠食糜、回肠食糜、粪样，测定饲料 中干物质和氮含量；测定十二指肠食糜、回肠食糜和粪样中干物质、氮和铬的含量；分离饲 料样中游离氨基酸，并测定游离氨基酸中 13c丰度；分离十二指肠食糜、回肠食糜和粪样中 微生物，进而将分离微生物后的食糜进一步分离游离氨基酸，并测定游离氨基酸中 13c丰 度；进而计算出山羊消化道不同部位内源氮排泄量。
[0016] 7、进而根据氮表观消化率和真消化率的计算公式的差异，推导出内源氮排泄量计 算公式，进而计算山羊消化道不同部位内源氮排泄量。计算山羊消化道不同部位内源氮排 泄量。消化道不同部位内源氮排泄量计算；
[0017] 所述的反刍动物是指进食经过一段时间以后将在胃中半消化的食物返回嘴里再 次咀嚼。反刍动物就是有反刍现象的动物，通常是一些食草动物，因为植物的纤维是比较难 消化的。反刍动物采食一般比较匆忙，特别是粗饲料，大部分未经充分咀嚼就吞咽进入瘤 胃，经过瘤胃浸泡和软化一段时间后，食物经逆呕重新回到口腔，经过再咀嚼，再次混入唾 液并再吞咽进入瘤胃的过程。
[0018] 反刍动物具体为山羊、绵羊、奶牛和肉牛。
[0019] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0020] A、本发明利用植物自然富集的稳定性同位素13C为标记物，与同位素标记外（内） 源氮法相比，无需在日粮中额外添加稳定性同位素或通过静脉灌注稳定性同位素，大大降 低测定成本。
[0021] B、本发明是在动物正常生理状态下测定内源氮排泄量，测定结果准确。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1 :
[0023] -种测定反刍动物消化道不同部位内源氮排泄量的方法，其步骤如下：
[0024] 1、选择C3植物饲料原料，根据试验山羊营养需要量配制饲料，试验山羊饲喂11 一 13周，配制试验山羊饲料：选择体重为15 ±1. 0kg健康湘东黑山羊为试验对象，试验山羊饲 料参考中华人民共和国农业行业标准-肉羊饲养标准（2004)配制，以1. 3倍维持需要量 设计饲料配方，满足100克日增重需要。选择C3植物来源原料，山羊营养配制饲料组成如 下：水稻結杆45. 0%、糖米33. 99%、?柏9. 02%、大?油8. 76%、碳酸妈0· 08%、憐酸氧?丐 0· 65%、氯化钠 0· 50%、预混料 2. 0%，饲料 13C 丰度（δ 13，％。）为-24. 78%〇。
[0025] 所述的预混料是添加剂预混合饲料的简称，它是将一种或多种微量组分（包括各 种微量矿物元素、各种维生素、合成氨基酸、某些药物等添加剂）与稀释剂或载体按要求配 t匕，均匀混合后制成的中间型配合饲料产品。预混料是全价配合饲料的一种重要组分，预混 料参考山羊营养需要量执行配制，组成如下：一水硫酸镁（MgS04 ·Η20) 243. 8克、七水硫酸亚