专利名称：编码谷胱甘肽s-转移酶的脱氧核糖核酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新颖的脱氧核糖核酸(DNA)及其在载体，宿主生物体与植物的转化，并且产生对除草剂抗性提高的植物中的应用。
目前已经公开了植物的基因修饰，从而它们具有对具体的除草剂提高的抗性。这使得采用具有低选择性但在一些植物的作物中具有其它有益特性的除草剂是可能的，其中的植物在最初非转基因形式下将受到这些除草剂的损伤。因此，抗除草剂植物的提供提高了所能使用的除草剂的选择性，并且在许多情况下它也可能与相对低的除草剂的应用量有关，例如当达到特殊的杀伤限度时，是否对不想要的植物的控制仅仅发生在它们出现以后。因此，相当有必要生产出具有对其它除草剂的抗性提高的新颖的作物植物。
谷胱甘肽S-转移酶为多功能蛋白，该蛋白对细胞毒物质的解毒贡献非常之大。该酶催化被还原的谷胱甘肽与亲电子的疏水底物相结合，其中该底物来源可以是天然的或合成的。
在植物体中谷胱甘肽S-转移酶的生理学底物及其在植物代谢中的作用所知并不详细。但是，已经证实这些酶涉及解毒并且因此涉及许多重要除草剂的选择性的机理，其中的除草剂选自硫代氨基甲酸盐，乙酰氯苯胺与S-triacines的组中Mozer T.J.，Tiemeier D.C.，JaworskiE.G.，生物化学，221068-1072(1983)；Moore R.E.，DaviesM.S.，O’Connell K.M.，Harding E.I.，Wiegand R.C.，Tiemeier D.C.，Nucleic Acids Res.147227-7235(1983)；Grove G.，ZarlengoR.P.，Timmermann K.P.，Li N.，Tam M.F.，Tuc C.P.D.，Nucleic Acids Res.16425-438(1988)。
现已发现一种编码新的蛋白质谷胱甘肽S-转移酶III c(下文为“GST III c”)的新的脱氧核糖核酸，其具有列于SEQ ID NO2中的氨基酸序列(根据本发明的新的DNA下文称作“GST III c DNA”)。
进一步，已经发现与相应的“起始植物”相比，将新的GST III c DNA插入到其基因组中的植物对除草剂，其中优选杂芳氧基乙酰胺除草剂的抗性有所提高。
新的GST III c DNA是从Mutin变种的玉米(Zea mais)中分离出来的。该DNA以显示在SEQ ID NO2中的氨基酸序列编码蛋白GSTIII c。在植物细胞中，2分子的蛋白GST III c自发地形成二聚活性酶(下文称作“GST III c酶”)，该酶确保所使用的除草剂的解毒并且因此使得该植物对除草剂具有抗性。
根据本发明优选的GST III cDNA具有列于SEQ ID NO1中的序列。
根据本发明同样优选的是如包含在下文所描述的载体质粒pET3a-GST III c与pSS-GST III c上的GST III cDNA。
新的GST III c DNA可以呈单链的形式或是呈额外地含有一条互补于该特殊的单链的链的双链形式。
在本发明的一个优选的实施方案中，GST III c DNA具有一个在5’末端上游插入的、在植物中有效的启动子。在植物体中通常有效的启动子可以用于这一目的。可提到的一个实例为核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(rbsc)的小的亚单位的基因启动子(参见EMBO杂志，第五卷，第九期，2063-2071页(1986))。优选采用来自植物病毒的启动子，例如所提到的CaMV 35S RNA启动子。特别优选使用沿着5’-3’序列的CaMV 35S增强子与CaMV 35S启动子的已知的构建物(“CaMV35S双启动子”)。一个相对应的优选的GST III c DNA与CaMV双启动子的构建物存在于下文所解释的载体质粒pSS-GST III c上。但是，也有可能使用调节玉米，Mutin变种中GST III c DNA表达的天然启动子。
在5’-3’序列跟随GST III c DNA的3’终止序列的性质变化非常之大并且对本发明并非至关重要。优选采用植物3’-终止序列。也有可能采用例如从玉米，Mutin变种中衍生的GST III c基因的天然终止序列。
同样，本发明的一部分为具有显示在SEQ ID NO2中的氨基酸序列的新的蛋白GST III c及其同样的新的二聚物(GST III c酶)，该二聚物如上面已经提及的，它是在植物细胞内蛋白GST III c形成之后自发地从2分子的蛋白GST III c生成的。
根据本发明的DNA与根据本发明的蛋白质(其中以合适的二聚体的形式存在)在每种情况下也分别包括从这种DNA和这种蛋白质衍生的DNA序列与蛋白质序列。具有衍生的序列的DNA与蛋白质试图意味着这样的DNA与蛋白质，它们仍然分别具有GST III c DNA与蛋白GSTIII c(其中以合适的二聚体的形式存在，即GST III c酶)的本质特征，并且因此在本质上具有同样的效果，也即在植物中产生对根据本发明的除草剂达到足够程度的抗性。在如此衍生的序列中，单个的DNA，密码子和/或DNA部分序列或单个氨基酸或氨基酸的部分序列的缺失(就DNA而言，例如通过使用限制酶)和/或被具有在本质上效果相同的其它DNA，密码子与DNA的部分序列或氨基酸或氨基酸的部分序列所替代是有可能的。由于基因密码的简并或由GST III c DNA或蛋白GST IIIc或GST III c酶调控的结果，这些类型的修饰可能是存在的。根据本发明的DNA也可以含有促进其调控的DNA，密码子或DNA序列，例如所谓的接头或在调控之后从这样的接头中所保留的(例如用限制酶切割后)。
GST III c DNA与蛋白GST III c或GST III c酶可以是天然来源的或者部分地或完全地呈合成的形式。
本发明的一部分也为一种重组的原核生物或真核生物的DNA，其中该DNA含有新的GST III c DNA或一种从作为“外源”或“添加”DNA中衍生的DNA。可以提到的实例为病毒DNA，微生物DNA(特别是细菌DNA，诸如来自于大肠杆菌或根瘤农杆菌的DNA)与植物DNA。
根据本发明的GST III c DNA与由此衍生的DNA序列，以及重组的原核生物或真核生物的DNA与由此衍生的DNA序列可以作为“外源”或“添加”DNA包含在载体(特别是质粒，粘粒或噬菌体)，经转化或转基因微生物(优选诸如大肠杆菌或根瘤农杆菌等细菌)以及经转化或转基因的植物细胞与植物或其DNA中。这些载体，微生物，植物细胞和植物及其DNA成为本发明的一部分。与重组的原核生物与真核生物的DNA一样，通过本领域普通技术人员采用本发明所描述的知识，特别是SEQ ID NO1与SEQ ID NO2，通过通常已知和/或常规的步骤与方法可以得到它们。
可以作为特别优选所提到的载体为载体质粒pET3a-GST III c与pSS-GST III c。这两种载体都含有根据本发明显示在SEQ ID NO1中的GST III c DNA。
质粒pET3a-GST III c在NdeI/BamHI片段上含有GST III c DNA。为了构建这一质粒，将显示在SEQ ID NO1中的GST III c DNA克隆(Studier F.W.，Moffatt B.A.，J.Mol.Biol. 189113-130；Studier F.W.，J.Mol.Biol.，21937-44(1991))到载体pET-3a的NdeI与BamHI的切割位点上(Novagen/Madison)。在
图1中描绘了这一质粒(5306bps)。箭头的方向表示启动子与基因，以及具有起始密码子ATG的GST III c DNA的方向。“Amp”代表α-氨基苄青霉素的抗性基因。
为了构建质粒pSS-GST III c，从载体pET3a-GST III c中纯化GSTIII c DNA作为XbaI/BamHI片段并且将之克隆到质粒Bluescript-SKII(XbaI/BamHI-线性化；Stratagene)中。随后从以这种方式衍生的质粒Bluescript SKII-GST III c中，通过SstI/SmaI限制性切割分离出GST III cDNA，并且将其连接至载体pRT101(SstI/SmaI-线性化；Topfer等人，1987)上。然后从以这种方式衍生的载体pRT101-GSTIII c中纯化GST III c DNA作为EcoRI/SmaI片段并且将之克隆到二元载体pSS(EcoRI/SmaI-线性化；Voβ等人，1994)。在结果衍生的载体pSS-GST III c中，编码GST III c DNA是在从CaMV中的一个经复制的35S RNA启动子的控制下进行的。质粒pSS-GST III c(10000pbs)如图2所描绘。
如果有需要的话，本领域的技术人员可以通过一般常规的步骤与方法从所说的质粒中分离出根据本发明的GST III c DNA。
根据本发明，可以称作特别优选的经转化或转基因的微生物为大肠杆菌菌株DS pET3a-GST III c与DS pSS-GST III c及其突变体。菌株DS pET3a-GST III c含有质粒pET3a-GST III c并且菌株DS pSS-GSTIII c含有质粒pSS-GST III c。根据本发明的突变体为仍然含有可以进行本发明的本质特征的那些微生物，也即特别仍然含有质粒pET3a-GST III c和/或pSS-GST III c或由此衍生的DNA序列。这些菌株可以通过一般常规的方法生长。同样，质粒pET3a-GST III c与pSS-GSTIII c能够通过一般常规的方法从这些微生物中分离出来。
遵照关于用于专利程序目的的微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约的条款，大肠杆菌菌株pET3a-GST III c保藏在Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德意志联邦民主共和国(保藏日1995年1月1 7日)。该菌株所给的保藏号为DSM 9677。
正如上面已经解释的，本发明也包括转基因植物与植物细胞(包括原生质体)以及来自于这些转基因植物中的植物体的一部分(诸如愈伤组织，叶，茎，花，花的一部分，根，块茎，种子及其它的繁殖材料)，这些植物在其基因组中包含GST III c DNA或由此衍生的DNA序列和/或根据本发明作为“外源”或“添加”DNA的重组的原核生物或真核生物的DNA。
根据本发明的转基因植物也包括根据本发明可以衍生的转基因植物的子代以及与其它的植物及其子代交配的产物，而只要这些转基因植物含有GST III c DNA或由此衍生的作为“外源”或“添加”DNA的DNA序列。
优选的转基因植物为那些在其基因组中含有如在SEQ ID NO1中显示的作为“外源”或“添加”DNA的GST III c DNA的植物。
特别优选的转基因植物为那些在其基因组中含有CaMV 35S双启动子和显示在SEQ ID NO1中作为“外源”或“添加”DNA的GSTIII cDNA的构建物的植物。
非常特别优选的转基因植物为那些在其基因组中含有在SEQ IDNO1中显示的GST III c DNA和/或CaMV 35S双启动子与显示在SEQ ID NO1中作为“外源”或“添加”DNA的GST III c DNA的构建物的植物。除了玉米变种Mutin以外，迄今尚未公开在其基因组中含有相对应于GST III c DNA的DNA的植物。
鉴于本发明，“外源”DNA试图意味着一种并非天然存在于具体的原核生物或真核生物(包括植物)的基因组中而是仅仅通过人类的干预(转化)在这一基因组中所插入的DNA。“添加”DNA为一种尽管已经存在于特殊的原核生物或真核生物的基因组中，但却通过人工干预(转化)在这一基因组中以添加量插入的DNA。“外源”或“添加”DNA可以有赖于需要以及特殊情况的性质插入一个或多个拷贝。
正如已经解释的，本发明的主要目的为生产出具有对除草剂，优选杂芳氧基乙酰胺除草剂的抗性提高的新的植物。
因此，根据本发明优选的新的转基因植物为与相应的非转基因植物相比，除了具有上述性质以外(“外源”或“添加”GST III c DNA的内含物)，还对除草剂，特别是对杂芳氧基乙酰胺除草剂的抗性提高的那些植物。因此，可以用除草剂处理这些转基因植物的作物，以便在不损伤作物植物的情况下控制不想要的植物。
对于农业与林业，对于观赏植物的培养，药用植物的培养以及植物繁殖而言，根据本发明的转基因植物细胞与植物对除草剂抗性的提高是重要的。
因此，本发明也涉及一种用于生产具有对除草剂抗性提高的转基因植物细胞(包括原生质体)与植物(包括植物的一部分以及种子)的方法，其特征在于(a)把GST III c DNA和/或根据本发明的含有编码蛋白GST IIIc的GST III c DNA的重组DNA的一个或多个拷贝插入到植物细胞(包括原生质体)中，并且在合适的时候，(b)从转化的植物细胞(包括原生质体)中再生出完整的转化植物，并且在合适的时候将其增殖，并且在合适的时候，(c)从以这种方式衍生的亲代或由此衍生的下一代的转基因植物中获得所需要的植物的部分(包括原生质体)。
方法步骤(a)，(b)与(c)能够以常规的方式通过已知的步骤与方法进行。
含有一倍或多倍的作为“外源”或“添加”DNA的GST III c DNA的转基因植物(包括原生质体)与植物(包括植物的一部分与种子)以及那些通过上面的方法可以衍生的转基因植物细胞与植物同样也形成本发明的一部分。
本发明的一部分也为(a)GST III c DNA和/或根据本发明的重组DNA和/或根据本发明的重组载体和/或根据本发明的转化微生物在转化植物细胞(包括原生质体)与植物(包括植物的一部分与种子)中的应用，(b)根据本发明的转基因植物细胞(包括原生质体)与植物(包括植物的一部分与种子)来生产繁殖材料并且生产出新的植物及其繁殖材料中的应用，(c)包含在质粒pET3a-GST III c中的cDNA或其部分的cDNA以及对应于显示在序列表SEQ ID NO1中的序列信息的DNA序列在确定植物体中以及(通常)转基因植物细胞(包括原生质体)与植物(包括植物的一部分与种子)的生产中编码GST III c蛋白或GST III c酶的DNA的应用，以及由pET3a-GST IIIc的GST III c DNA编码的蛋白质序列及显示在SEQ ID NO2中的蛋白质在分离和检测GST III c DNA(例如通过常规的抗体技术)中的应用。
有许多不同的方法可用于将GST III c DNA作为“外源”或“添加”DNA插入到植物或植物细胞的基因物质中，其中该GST III c DNA适合于作为与CaMV 35S双启动子的构建物。通过一般常规已知的方法，本领域普通技术人员能够在每一种情况下毫不费力地制定出合适的方法进行该基因转化。
根瘤农杆菌的Ti质粒可以用作载体，该载体特别合适并且能够广泛用于转化“外源”或“添加”DNA至双子叶与单子叶植物的基因组中。编码蛋白GST III c的基因物质在合适的时候与调控DNA序列一起插入到合适的Ti质粒的T DNA中(例如Zambryski等人，1983)，并且通过感染植物，感染植物或植物组织的一部分(诸如，例如叶盘(leaf discs)，茎，下胚轴，子叶，分生组织及其由此衍生的组织，所衍生的组织诸如例如次级胚胎与愈伤组织)或通过采用根瘤农杆菌的原生质体的共培养物来转化该基因物质。
一种替代的方法为在聚阳离子或钙盐与聚乙二醇存在的条件下，将在植物原生质体中含有所需要的基因或所需要的DNA的纯化DNA进行温育(例如Hain等人，1985；Krens等人，1982；Paszkowski等人，1984)。
此外，DNA的摄入也可以得到电场(电穿孔法)的支持(例如Fromm等人，1986)。
DNA也可以由植物花粉，通过“轰击”花粉或具有携带DNA的物理加速粒子的植物的其它部分，按照已知的方式引入(参见EP-A 0270356) 。
按照已知的方式，在合适的营养培养基的协助下进行植物的再生(例如Nagy与Maliga1976)。
在根据本发明方法的一个优选的实施方案中，把来自于质粒pET3a-GST III c的GST III c DNA克隆到一个二元(binary)表达载体上(例如Voβ等人(1994))。然后，将嵌合基因的构建物转化到根瘤农杆菌中(Koncz与Schell，1986)。
采用另外一种方法，以常规的方式通过直接的基因转化将位于载体pSS-GST III c上的嵌合基因的构建物转化到植物的原生质体上(例如Hain等人，1985)。在这种情况下，该质粒可能呈环状的形式，但是优选其呈线性形式。
当采用这种具有报道基因的质粒时，随后检验卡那霉素-抗性原生质体对GST III c的表达。
通过已知的方法，例如通过叶盘转化(例如Horsch等人，1985)，通过再生植物的原生质体或细胞培养物与根瘤农杆菌的共培养(例如Marton等人1979，Hain等人1985)或通过直接的DNA转染生产转化(转基因)的植物或植物细胞。所衍生的转基因植物或者通过对报道基因表达的筛选，例如借助体外卡那霉素硫酸盐的磷酸化作用(Reiss等人，1984；Schreier等人，1985)，或者通过胭脂氨酸合酶的表达(Aerts等人的方法，1983)或通过Northern印迹分析法与Western印迹分析法的GST III c的表达进行检测。也可以使用特异的抗体以已知的方式通过Western印迹分析法在转基因植物中检测蛋白GST III c。
通过一般常规的方法使用适合于每种情况的营养培养基可以进行转化植物细胞的培养及其再生为完整的植株。
含有根据本发明的GST III c DNA并且形成本发明的一部分的转化植物细胞与转化植物，两者均显示出对除草剂，特别是对杂芳氧基除草剂抗性的提高非常之大。
鉴于本发明，术语“植物”表示完整的植株与植株的一部分，诸如叶，种子，块茎，插枝等等。“植物细胞”包括原生质体，细胞系，植物愈伤组织等等。“繁殖材料”表示用于繁殖该转化植物与植物细胞的植物与植物细胞，并且因此同样也成为本发明的一部分。
通过根据本发明的GST III c DNA的插入(转化)能够使得对除草剂抗性提高的植物实质上包括所有的植物。当然存在特殊的需要在下面的植物中产生这种抗性，诸如林业植物，例如云杉，冷杉，花旗松，松树，落叶松，山毛榉与橡树的作物植物，以及提供粮食和原材料的植物，例如谷物(特别是小麦，黑麦，大麦，燕麦，小米，水稻与玉米)，土豆，豆科(诸如荚科植物与特别地如苜蓿，大豆)，蔬菜(尤其是芸苔属植物与番茄)，水果(特别是苹果，梨，樱桃，葡萄，柑橘水果，菠萝与香蕉)，油棕榈，茶叶，可可与咖啡作物，烟草，剑麻与棉花，以及药用植物，诸如萝芙藤与毛地黄。可以特别优选所提到的那些为土豆，甜菜，甘蔗，诸如小麦，大麦与高粱的谷物，以及水稻。根据本发明的GST III c DNA优选作为“外源”DNA插入到这些植物的基因组中。
抵抗根据本发明产生的提高的除草剂抗性的除草剂优选属于杂芳氧基乙酰胺的类群。在这一方面，特别优选的是具有通式(I)的杂芳氧基乙酰胺Het-O-CH2-CO-NR1R2(I)其中Het代表一种可选择性地用优选的五元环取代的杂芳香基，该五元环中优选含有至少一个氮原子与一个硫原子或氧原子，可以提到的一个特别优选的基团为5-三氟甲基-1，3，4-噻二唑-2-基基团；R 代表选择性地取代的烷基或烷氧基(在每一种情况1下，优选以1-4个碳原子取代)；并且R 代表选择性地取代的芳香基(优选为苯基，而该基团2优选以卤素取代)目前已经公开了这种类型的除草剂(参见例如EP-A-18497及与之相对应的美国专利No.4645525，EP-A-94541及与之相对应的美国专利No.4585471，以及EP-A-348737及与之相对应的美国专利No.4968342)。在这些专利申请与专利中所提到的除草剂是在本发明中特别优选的。
根据本发明，对在EP-A-348737及与之相对应的美国专利No.4968342中所提到的，化学名称为(5-三氟甲基-1，3，4-噻二唑-2-基氧)乙酸N-异丙基-N-(4-氟苯基)酰胺(推荐的通用名thiafluamide)除草剂的抗性是非常特别优选的。这一抗性允许在作物中使用所说的除草剂，即使该作物呈无抗性的形式，且以一种不可接受的方式将受到该除草剂的损伤。
借助下面典型的实施方案将具体地解释本发明I.从玉米中分离GST III c DNA采用分子生物学已知的步骤和方法分离GST III c DNA，例如采用下面的手册中所描述的方法Maniatis T.，Fritsch E.F.，Sambrook J.分子克隆，一本实验室手册；Cold Spring Habor实验室，第二版，1989。
为了分离出GST III c DNA，首先从经黄化(etiolated)的玉米幼苗(Zea mais)，Mutin变种中纯化该蛋白质(1)，并且通过蛋白质序列分析法完全测定其氨基酸序列(2)。同样从玉米的幼苗中分离出mRNA(3)，并且通过逆转录酶将mRNA酶促转录为cDNA(4)。以这种方法衍生的cDNA在聚合酶链式反应中用作模板(Mullis K.B.，Falloona F.A.，(1987)Method Enzymol.155335-350)以分离GSTIII c DNA。
1. 从玉米，Mutin变种中分离GST III c蛋白质为了纯化GST III c蛋白质，将玉米幼苗破碎并与0.2M tris/HClpH7.8，1mM EDTA(2毫升/克鲜重)混合。离心该悬浮液，并通过具有30％和70％饱和度的硫酸铵分级沉淀得到上清液中的蛋白质部分。通过色谱在下面的柱中采用所指出的缓冲液的条件分离GST III c蛋白质A)Sephadex G-100(基于葡聚糖分离介质)，v＝500毫升(Pharmacia)缓冲液A50mM磷酸钾pH7.3B)DEAE-Sepharose(具有以共价键结合的二乙氨乙基基团的交联琼脂糖基质)，v＝50毫升(Pharmacia)缓冲液A10mM磷酸钾pH7.3缓冲液B1.0M磷酸钾pH7.3梯度0-100％B，500分钟C)谷胱甘肽-磺基溴代酞-琼脂糖，v＝20毫升(Sigma)缓冲液A50mM磷酸钾pH7.3缓冲液B50mM磷酸钾pH8.0，5mM谷胱甘肽D)单Q HR 5/5(基于具有带电的-CH2N(CH3)3+基团的交联琼脂糖的阴离子交换物质，粒子尺寸为10±5微米)，v＝1毫升(Pharmacia)缓冲液A20mM tris/HCl pH7.5缓冲液B20mM tris/HCl pH8.0，1.0M NaCl梯度0-25％B，20分钟2.GST III c蛋白质的蛋白质序列分析将从玉米(Mutin变种)中分离出的GST III c蛋白进行还原，羧甲基化且用0.2M碳酸氢铵透析(Glazer A.N.，Delange R.J.，SigmanD.S.，(1975)蛋白质的化学修饰，Elsevier生物医学出版社，阿姆斯特丹)。随后在23℃下，以蛋白质/蛋白酶的比例为1∶100的条件下用内切蛋白酶Asp-N(测序级别，Boehringer Mannheim)或胰蛋白酶(TPCK-处理的，Worthington)切割该蛋白质16小时。通过加入0.1％的三氟乙酸停止切割反应。通过离心除去不溶的肽，并且在下面的条件下通过反向HPLC彼此分离出可溶性的肽柱 Vydac C18(具有脂肪链(C18)的二氧化硅骨架分离凝胶)，0.46厘米×25厘米洗脱液0.1％三氟乙酸A洗脱液0.1％三氟乙酸，90％乙氰B梯度0-60％B， 40分钟流速0.25毫升/分钟使用实用生物系统470A与473A蛋白测序仪测定所分离的氨基酸序列。在SEQ ID NO2中描绘了GST III c蛋白的完整的蛋白质序列。
3. 从玉米(Mutin变种)中分离poly(A)+mRNAGST III c DNA，mRNA及与之相对应的cDNA含有能够从彼此衍生的核苷酸序列。为了分离GST III c DNA，首先从黄化的玉米幼苗中制备聚腺苷酸化的mRNA。按照生产者的方案(Dynal，奥斯陆/挪威；Jakobsen K.S.，Breivold E.，(1990)Nucleic Acids Res.183669)使用Dynabeads Oligo(dT)25进行分离。用于纯化poly(A)+RNA的方法是基于在位于mRNA的3’末端上的poly(A)+残基与oligo(dT)残基间的碱基对的结合，它们以共价键结合在磁性金属珠(Dynabeads)的表面上。每一毫克的Dynabeads使用0.2克的植物材料。可以把通过这种方法分离出的mRNA不进行进一步的纯化步骤而用于cDNA的酶促合成。
4. cDNA的酶促合成在cDNA第一链合成试剂盒的协助下制备cDNA(Pharmacia P-LBiochemicals Inc.)。该方法基于根据一个RNA模板合成DNA的病毒DNA聚合酶(逆转录)的酶活性(Maniatis T.，Fritsch E.F.，SambrookJ.，(1982)分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor实验室)。
按照生产者的说明，反应以下面的方式进行来自于玉米，Mutin变种的5μm的poly(A)+mRNA与1μm的0.5M dithioeritrit，1μm的d(T)16-18引物相混合11μm的反应混合物(总体反应的混合)包括鼠逆转录酶，135mM tris/HCl，pH8.3，204mM KCl，27mMMgCl2，0.24毫克/毫升BSA，5.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP。
在37℃下反应1小时后，通过加碱水解除去mRNA。沉淀所合成的cDNA并以之作为聚合酶链式反应的模板。
5. GST III c DNA的扩增，克隆与测序为了分离出GST III c DNA，首先用聚合酶链式反应扩增编码GSTIII c的核苷酸序列(Mullis K.B.，Faloona F.A.，(1987)MethodEnzymol.155335-350)。用于反应的模板为从玉米mRNA中制备的cDNA。为了特异地富集GST III c DNA，使用显示在SEQ ID NO3中的引物1(正向)以及显示在SEQ ID NO4中的引物2(逆向)。
制备含有下面组合物的反应混合物5μm的cDNA(200纳克/微升)1μm的50μM引物11μm的50μM引物24μl的250μM dATP，dCTP，dGTP，dTTP5μl的200mM tris/HCl，pH8.8，100mM KCl，60mM(NH4)2SO4，15mM MgCl2，1％Triton X-10034μlH2O在一个GeneAmp PCR系统9600热循环仪(Perkin Elmer)中进行聚合酶链式反应。加入1微升作为热稳定聚合酶的Pfu Dna聚合酶(Stratagene，2500U/毫升)。采用下面的温度与反应时间总共进行35个反应循环在94℃下45秒，在58℃下45秒，在72℃下45秒。通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的含有编码核苷酸序列的DNA片段，并且将其克隆到如已描述的载体pET 3a上。使用测序酶DNA测序试剂盒(美国Biochemical/Cleveland)测定GST III c DNA(SEQ ID NO1)的完整的DNA序列(Sanger F.，Coulson R.，(1975) J.Mol. Biol.94441-448)。
II.水稻的转化按照在下面的参考文献中所描述的方法可以转化水稻(Oryzasativa)Zhang H.M.，Yang H.，Rech E.L.，Golds T.J.，Davis A.S.，MulliganB.J.，(1988)通过电穿孔-介导的质粒摄入原生质体生产转基因水稻植株Plant Cell Rep.7379-384Zhang W.，Wu R.，(1988)从水稻的原生质体中有效地再生转基因植物以及在植物体中外源基因正确地调控表达Theor. Appl. Gen.76835-840Shimamoto K.，Terada R.，Izawa T.，Fujimoto H.，(1989)从转基因原生质体中再生的可育的转基因水稻植株天然338274-276Datta S.K.，Peterhans A.，Datta K.，Potrykus I.，(1990)从原生质体中再生的基因工程化的可育indica-水稻Biotechnol. 6736-740Hayashimoto A.，Li Z.，Murai N.，(1990)用于生产可育的转基因水稻植株的一个聚乙二醇介导的转化系统，Plant Physiol.93857-863使用Hayashimoto等人的方法(1990)可以将载体pSS-GST III c转化到水稻上，而不需修饰。
在Northern印迹实验中，使用卡那霉素-抗性转化体检验GST III的表达。通过特异的抗体检测GST III c蛋白的形成。通过检测除草剂(5-三氟甲基-1，3，4-噻二唑-2-基氧)乙酸N-异丙基-N-(4-氟苯基)酰胺，可能可以显示出从转化水稻植株的粗提取物中的蛋白质的酶的活性。
与未转化的对照物相比，转基因的水稻植株显示出对所说的除草剂的抗性。
III.烟草的转化a)烟草嫩枝的培养与烟草原生质体的分离在不含激素的LS培养基(Linsmaier与Skoog 1965)上以无菌嫩枝培养增殖烟草(Petit Havanna SR1)。将其嫩枝部分以6-8周的间隔转移到新鲜的LS培养基上。在24-26℃下，采用12小时光照(1000-3000lux)于生长室中保留其嫩枝培养物。为了分离叶子的原生质体，使用一个清洁的剃刀刀片将大约2克的叶子(大约3-5厘米长)切割成小片(0.5厘米×1厘米)。在室温下，于由K3培养基(Nagy与Maliga 1976)，0.4M蔗糖，pH5.6，2％纤维素R10(Serva)，0.5％Macerozym R10(Serva)所组成的20毫升酶溶液中温育该叶子材料14-16小时。然后通过0.30毫米与0.1毫米的喷射滤网(screen)过滤，从细胞残余物中分离出原生质体。在100×g下离心该滤液10分钟。在这一离心过程中进行完整的原生质体的浮选，它在酶溶液上边的条带中进行收集。通过玻璃毛细管吸走细胞残余物的小片与酶溶液。把经预纯化的原生质体与新鲜的K3培养基(以0.4M蔗糖作为渗透剂)混合成10毫升并且重复进行浮选。吸走该洗涤培养基并且将原生质体稀释为用于培养或随后以农杆菌感染(共培养)的1-2×105/毫升。在一个计数室内测定原生质体的浓度。
b)载体pSS-GST III c的构建及其转化到根瘤农杆菌中从载体pET3a-GST III c中切割出GST III c DNA与Shine-Delgarno序列作为XbaI/BamHI片段，将其纯化并且克隆到质粒Bluescript II Sk+/-(Stratagene，La Jolla，加利弗尼亚)中，下文称作pBS-SK II。使用XbaI与BamHI切割位点。随后通过Sst1与Sma1切割位点从载体pBS-SK II-GST III c中切割出GST III c DNA，将其分离并且结合在载体pRT101(Sst1/Sma1-线性化)上(Topfer R.，Matzeit V.，Gronenborn B.，Schell J.，Steinbiβ H.H.，(1987)Nucleic Acids Res.145890)。
然后从载体pRT101-GST III c中纯化出GST III c DNA作为EcoR1/Sma1片段并且将之克隆到表达载体pSS上(EcoR1/Sam1-线性化，(Voβ等人，Molec.Breeding 115-26(1995)))。
可能使用任何其它的具有合适切割位点的表达载体与穿梭载体来代替所说的载体，而本领域普通技术人员在上面陈述的基础上能够容易地作出合适的选择。结果，将含有GST III c DNA的穿梭载体pSS-GSTIII c转化到含有一个功能性vir区域的根瘤农杆菌中(Koncz与Schell1986，van Haute等人1983)。
c)通过与根瘤农杆菌的共培养转化正在再生的烟草原生质体下文采用通过轻微改进的Marton等人(1979)的方法。如所述，分离原生质体并且在K3培养基(0.4M蔗糖，0.1毫克/毫升NAA，0.2毫克细胞分裂素)中，26℃下以1-2×105/毫升的密度进行温育，在黑暗中温育2天，在弱光(500lux)下温育1至2天。
原生质体一开始发生分裂，就将含于基本A(Am)培养基中从b)中衍生的30微升农杆菌的悬浮液(密度大约为109农杆菌/毫升)加入到3毫升正在再生的原生质体中。在20℃下于黑暗中进行共培养3-4天。然后把烟草细胞装入12毫升离心试管中，用海水(600mOsm/千克)稀释到10毫升并且在60×g下将其制片10分钟。重复洗涤步骤1-2×多次以除去大多数的农杆菌。在含有1毫克/升NAA(萘基-1-乙酸)，0.2毫克/升细胞分裂素与500毫克/升头孢菌素抗生素cefotaxime的K3培养基(0.3m蔗糖)中以5×104/毫升的密度培养细胞悬浮物。每周用新鲜的K3培养基稀释细胞悬浮物，并且每周以0.05M的蔗糖(大约60mOsm/千克)连续地还原培养基的渗透值。在琼脂糖玻珠培养(Shillito等人1983)中共培养后的2-3周开始以卡那霉素进行筛选(100毫克/升卡那霉素硫酸盐(Sigma)，660毫克/克活性Km)。从筛选开始后的3-4周，可以从存留菌落的背景中分辨出卡那霉素-抗性菌落。
d)用DNA直接转化烟草原生质体硝酸钙/PEG转化将含于180微升K3培养基中的大约106的原生质体小心地与20微升含水的DNA溶液混合，该溶液在培养皿中含有20微克的质粒pSS-GST III c。质粒pSS-GST III c可以通过已知的方法从质粒pET3a-GSTIII c，pRT101，pBS-SK II与pSS中得到。随后小心地加入200微升的融合溶液(0.1M硝酸钙，0.45M甘露糖醇，25％聚乙二醇(PEG6000)，pH9)。15分钟后，加入5毫升的洗液(0.275M硝酸钙，pH6)，并且再过5分钟后将原生质体转移到一个离心试管中且在60×g下制片。在少量的K3培养基中吸取小片并且以如下部分的描述将其培养。另外，也可以如Hain等人(1985)所描述的转化原生质体。
e)用DNA温育的原生质体的培养以及卡那霉素-抗性愈伤组织的筛选把一种改性的玻珠类型培养技术(Shillito等人1983)用于下文所述的卡那霉素-抗性菌落的培养与筛选。用DNA处理原生质体1周后(参照d)，在5厘米培养皿中将3毫升的细胞悬浮物与3毫升的K3培养基混合(0.3M蔗糖+激素；1.2％(Seaplaque)LMT琼脂糖(低熔点琼脂糖，Marine Colloids))。为了这一目的，干法高压灭菌琼脂糖，并且在加入K3培养基后在微波炉中使之简单地沸腾。琼脂糖固化后，将含有用于进一步培养与筛选的被包埋的烟草微愈伤组织的琼脂糖圆片(玻珠)转移到10厘米的培养皿中，并且向每个培养皿中加入10毫升的K3培养基(0.3M蔗糖，1毫克/升NAA，0.2毫克/升细胞分裂素)与100毫克/升的卡那霉素硫酸盐(Sigma)。每周更换一次液体培养基。与此同时，逐步地还原培养基的渗透值。
每周通过0.05M的蔗糖(大约60mOsm)还原取代培养基(K3+Km)。
在DNA转化后，筛选具有卡那霉素-抗性的烟草菌落的线路图为0.4M 0.3M 0.25M 0.20M 0.15M 0.10M溶于液体培养基中的蔗糖A ESK123 456 DNA摄入后的周数(K3培养基1毫克/升NAA，0.2毫克/升细胞分裂素)A＝DNA摄入E＝在琼脂糖中包埋S＝以卡那霉素(100毫克/升卡那霉素硫酸盐)筛选K＝从背景中可以清晰地分辨出的卡那霉素-抗性菌落f)卡那霉素抗性植株的再生卡那霉素-抗性菌落的直径一达到大约0.5厘米，便将其中的一半菌落放置在再生培养基(LS培养基，2％蔗糖，0.5毫克/升苄基氨基嘌呤BAP)上并且于24℃下以12小时的光照(3000-5000lux)将其保留在生长室中。另一半则作为愈伤组织培养物在含有1毫克/升NAA，0.2毫克/升细胞分裂素，0.1毫克/升BAP与100毫克/升卡那霉素硫酸盐的LS培养基上进行增殖。当再生的嫩枝尺寸大约为1厘米时，将其剪下并且放置在不含生长调节剂的1/2 LS培养基(1％蔗糖，0.8％琼脂)中用于生根。在含有100毫克/升卡那霉素硫酸盐的1/2 MS培养基中使嫩枝生根并且随后把它转移至土壤中。
g)通过根瘤农杆菌转化叶盘为了转化叶盘(Horsch等人1985)，将从无菌的嫩枝培养物中衍生的大约2-3厘米长的叶子切割成直径为1厘米的圆片，并且用含于Am培养基(参见下文)中的合适的农杆菌的悬浮物(大约109/毫升)(参见c)温育大约5分钟。在大约24℃下，在不合激素的MS培养基(参见下文)上保留叶子被感染的片段3-4天。在这段时间内，农杆菌生长越过叶子的片段。随后在MS培养基(0.5毫克/毫升，0.1毫克/毫升)中洗涤叶子的片段并且把它放置在含有500微克/毫升cefotaxime与100微克/毫升卡那霉素硫酸盐的同样的培养基(0.8％琼脂)上。两周后，应当更换培养基。进而再过2-3周后，转化的卡那霉素-抗性嫩枝便可以看到了。
生物化学转化检测方法新霉素磷酸转移酶(NPT II)的酶分析正如Reiβ等人(1984)所述的以及Schreier等人(1985)所改进的，如下述通过卡那霉素的就地磷酸化来检测植物组织中NPT II的活性。于冰上，在添加有玻璃粉末的50微升抽提缓冲液(10％甘油，5％2-巯基乙醇，0.1％SDS，0.025％溴酚蓝，62.5mM tris pH6.8)中将50毫克的植物组织进行匀浆，并且于4℃下在一个Eppendorf离心机中离心10分钟。把50微升的上清液装填到一个未改性的聚丙烯酰胺凝胶(145×110×1.2毫米；分离胶10％丙烯酰胺，0.33％丙烯酰胺，0.375M tris pH8.8，堆积胶5％丙烯酰胺，0.165％双丙烯酰胺，0.125M tris pH6.8)中并且在4℃与60V下电泳过夜。溴酚蓝标记物一跑出凝胶，即用蒸馏水洗涤凝胶两次、洗10分钟，并且用反应缓冲液(67mM tris顺丁烯二酸，pH7.1，42mM氯化镁，400mM氯化铵)洗涤一次、洗30分钟。将凝胶放置在同样尺寸的玻璃板上并且以40毫升含于反应缓冲液中的1％的强度(strength)凝胶进行覆盖，其中的反应缓冲液含有底物卡那霉素硫酸盐(20微克/毫升)与20-200μCi的32PATP(Amersham)。在室温下温育该夹心凝胶30分钟，然后把一张P81磷酸纤维素纸(Whatman)放置在琼脂糖上。在其顶部堆积了四层3MM滤纸(Whatman)以及一些纸巾。在3-4小时后，停止就地磷酸化的放射性卡那霉素磷酸盐向P81纸的转移。在蛋白酶K与1％十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液中，于60℃下温育P81纸30分钟，然后于80℃下，在250毫升10mM磷酸缓冲液(pH7.5)中洗涤3-4次，干燥该纸且在-70℃下放射自显影(XAR5胶卷柯达)1-12小时。
除非另作声明以外，在上面的实施例中以及下文的那些实施例中所有的百分比的数据均为重量百分数。
通过Southern印迹分析法证实了在上面以及实施例中衍生的植物细胞以及植物中GST III c DNA的存在。通过Northern印迹分析法以及Western印迹，使用特异的抗体检测GST III c DNA的表达。
在植物与植物细胞的转化中使用的一些培养基如下所述Am培养基3.5克K2HPO41.5克KH2PO40.5克Na3柠檬酸盐0.1克MgSO4×7H2O1克 (NH4)2SO42克 葡萄糖ad11用于无菌烟草嫩枝培养的培养基MS盐的大量元素的1/2浓度MS盐的微量元素的1/2浓度Fe EDTA Murashige与skoog(MS)肌醇 100毫克/升蔗糖 10毫克/升琼脂 8毫克/升维生素 Ca泛酸 1毫克/升生物素10毫克/升烟酸 1毫克/升吡哆醇 1毫克/升硫胺素 1毫克/升在高压灭菌前pH7.5K3培养基用于培养烟草小Havana SR1，烟草Wisconsin 38与Nicotianaplumaginifolia原生质体(Nagy与Maliga，1976)大量元素 NH4NO3250毫克/升KNO32500毫克/升CaCl2·2H2O 900毫克/升MgSO4·7H2O 250毫克/升NaH2PO4·1H2O 150毫克/升(NH4)2SO4134毫克/升CaHPO4·1H2O 50毫克/升微量元素 H3BO33毫克/升MnSO4·1H2O 10毫克/升ZnSO4·4H2O2毫克/升KI0.75毫克/升Na2MoO4·2H2O 0.25毫克/升CuSO4·5H2O0.025毫克/升CoCl2·6H2O0.025毫克/升Fe EDTA Na2EDTA 37.2毫克/升FeSO4·7H2O 27.8毫克/升肌醇100毫克/升蔗糖 137克/升(＝0.4M)
木糖250毫克/升维生素烟酸1毫克/升吡哆醇1毫克/升硫胺素 10毫克/升激素 NAA 1.0毫克/升细胞分裂素 0.2毫克/升pH5.6将过滤器灭菌Linsmaier与Skoog培养基(Linsmaier与Skoog 1965)用于培养正在再生的原生质体并且用于烟草肿瘤与愈伤组织的组织培养。Linsmaier与Skoog(LS)培养基为采用了下述改进的Murashige与Skoog培养基(Murashige与Skoog，1962)-硫胺素以较高的浓度0.4毫克/升称重，代替0.1毫克/升；-缺乏甘氨酸，吡哆醇与烟酸。
大量元素NH4NO31650毫克/升KNO31900毫克/升CaCl2·2H2O 440毫克/升MgSO4·7H2O 370毫克/升KH2PO4170毫克/升微量元素H3BO36.2毫克/升MnSO4·1H2O 22.3毫克/升ZnSO4·4H2O 8.6毫克/升KI0.83毫克/升Na2MoO4·2H2O 0.25毫克/升CuSO4·5H2O0.025毫克/升CoCl2·6H2O0.025毫克/升Fe EDTA Na2EDTA 37.2毫克/升FeSO4·7H2O 27.8毫克/升肌醇 100毫克/升蔗糖 30克/升琼脂 8毫克/升维生素Thiamine 0.4毫克/升激素 NAA 1毫克/升细胞分裂素 0.2毫克/升pH5.7可以在植物与植物细胞的转化中引用下面的文献Fraley R.T.，Rogers S.G.，Horsch R.B.，Sanders P.R.，Flick J.S.，Adams S.P.，Bitther M.L.，Finker C.L.，Fry J.S.，Fallupi G.R.，GoldbergS.B.，Hoffmann N.L.，Woo S.C.(1983).细菌基因在植物细胞中的表达Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804803-4807.
Fromm M.E.，Taylor l.P.，Walbot V.(1986)通过电穿孔基因转化后玉米的稳定转化。天然319791-793Hain，R.，Stabel.P.，Czernilofsky，A.P.，Steinbi β，H.H.，Herrara-Estrella. L.，Schell，J.(1985)通过植物原生质体的一个可选择的嵌合基因的摄入，整合，表达以及基因传递Mol.Gen.Genet.199161-168Hernalsteens J.P.，Thia-Tong L.，Schell J.，Van Montagu M.(1984)从单子叶植物天门冬属officinalis中进行农杆菌转化的细胞的培养EMBO J.33039-3041Herrera-Estrella L.，De Block M.，Messens E.，Hernalsteens J.P.，van Montagu M.，Schell J.(1 983)EMBO J.，2987-995Horsch R.B.，Fry J.E.，Hoffmann N.L.，Eicholtz D.，Rogers S.G.，Fraley R.T.(1985)用于向植物体中转化基因的简单及通用的方法。科学2771229-1231
Krens F.H.，Molendijk L.，Wullems G.J.，Schilperoort R.A.(1982)用Ti-质粒DNA进行植物原生质体的体外转化。 天然29672-74Koncz C.，Schell J.(1986)TL-DNA基因5的启动子调控通过一种新型的农杆菌linary载体进行的嵌合基因的组织-特异性的表达Mol.Gen. Genet.(1986)204338-396Linsmaier D.M.，Skoog F.(1965)烟草组织培养的有机生长因子的需求Physiol.Plant 18100-127Marton L.，Wullems G.J.，Molendijk L.，Schilperoort P.R(1979)通过根瘤农杆菌从烟草中进行培养细胞的体外转化天然2771229-131Nagy J.I.，Maliga P.(1976)从烟草属sylvestris的叶肉原生质体中进行愈伤组织的诱导以及植物再生 Z.Pflanzenphysiol.78453-455Paszkowski J.，Schillito R.D.，Saul M，Mandak V.，Hohn T.，HohnB.，Potrykus I.(1984)向植物体中进行直接的基因转化EMBO J.32717-2722Shillito R.D.，Paszkowski J.Potrykus I.(1983)琼脂糖平板以及玻珠类型培养技术使得并且刺激在大量的植物物种中由原生质体-衍生的菌落的发育Pl. Cell.Rep. 2244-247 Van den Elzen P.J.M.，TownsendJ.，Lee K.Y.，Bedbrook J.R.
Van den Elzen P.J.M.，Townsend J.，Lee K.Y.，Bedbrook J.R.(1985)在植物细胞中作为一个可选择的标记物的嵌合抗性基因Plant Mol.Biol. 5299-302Velten J.，Velten L.，Hain R.，Schell J.，(1984)从根瘤农杆菌的Ti质粒中分离一个双植物启动子片段EMSO J.122723-2730
Van Haute E.，Joos H.，Maes M.，Warren G.，Van Montagu M.，Schell J.(1983)在pBR 322中的限制性片段克隆的基因间的转化与交换重组用于根瘤农杆菌Ti质粒的反向遗传学的新方法EMBO J.2411-418ZambryskiP.，Joos H.，Genetello C.，van Montagu M.，Schell J.(1983)用于向植物细胞中引入DNA且不改变其正常再生能力的Ti-质粒载体EMBO J.122143-2150Reiss，B.，Sprengel，Will H.，and Schaller H.(1984)一种用于在最初的细胞片段中定性与定量分析新霉素磷酸转移酶的新的灵敏的方法基因1081211-217Schreier P.H.，Seftor E.A.，Schell J.and Bohnert H.J.(1985)应用核-编码序列指导光照-调节的合成与外源蛋白质向植物的叶绿体的运输 EMBO J.125-32下述公开的专利申请可能被进一步的引用EP-A 116718EP-A-126546EP-A 159418EP-A-164597EP-A 120515EP-A-175966EP-A-120516WO84/02913EP-A-172112WO84/02919EP-A-140556WO84/02920EP-A-174166WO83/01176EP-A-122791根据本发明的转化植物抗性的提高可以通过下面的实施例进行说明
转基因植物提高的证实与对照植物相比，测定对根据本发明的转化植物的损伤以检验对具有除草剂活性的杂氧乙酰胺的抗性的提高。所使用的检验除草剂为化合物(5-三氟甲基-1，3，4-噻二唑-2-基氧)乙酸N-异丙基-N-(4-氟苯基)酰胺。
在温室中，将转化植物的F1代的种子播种在位于容器(d＝11厘米)中的含有3％腐殖土内含物的天然土壤中。在温度为23℃且相对湿度为70-80％下栽培该植物。在种子播撒后24小时，以相应于施加量为2000-4000活性化合物/ha的浓度，用上面提及的除草剂化合物，其表示为70WP(可润湿的粉末)进行处理。
在用除草剂处理20天后进行评估。与经过同样浓度的活性化合物处理的相应的对照植物比较，评价其对转基因植物总体损伤的百分数。
与未转化的相应的对照植物相比，经插入根据本发明的GST III cDNA的转化烟草植物显示出对除草剂的高的施加量(2000-4000克/ha)抗性的显著提高。序列一览表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名拜尔AG(B)街道拜尔沃克(C)城市勒沃库森(E)国家德国(F)邮政编码D-51368(G)电话0214/30 66400(H)传真0214/30 3482(I)电报85101-265通过d(ii)发明名称脱氧核苷酸及其用途(iii)序列数4(iv)计算机可读形式(A)存储媒体类型软磁盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件帕特汀瑞利斯#1.0，版本#1.30(EPA)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度666个碱基对(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓扑构建物线性(ii)分子类型cDNA(iii)假定无(iv)反义无(ix)特征(A)名称/要点CDS(B)位置1.663(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG GCG CCT CTG AAG CTG TAC GGG ATG CCG CTG TCC CCC AAC GTG GTG 48Met Ala Pro Leu Lys Leu Tyr Gly Met Pro Leu Ser Pro Asn Val Val1 5 10 15CGC GTG GCC ACC GTG CTC AAC GAG AAG GGC CTC GAC TTC GAG ATC GTC 96Arg Val Ala Thr Val Leu Asn Glu Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ile Val20 25 30CCC GTC GAC CTC ACC ACC GGC GCC CAC AAG CAG CCC GAC TTC CTC GCC 144Pro Val Asp Leu Thr Thr Gly Ala His Lys Gln Pro Asp Phe Leu Ala35 40 45CTC AAC CCT TTC GGC CAG ATC CCG GCT CTC GTC GAC GGA GAC GAA GTC 192Leu Asn Pro Phe Gly Gln Ile Pro Ala Leu Val Asp Gly Asp Glu Val50 55 60CTC TTC GAG TCC CGT GCG ATC AAC CGG TAC ATC GCC AGC AAG TAC GCG 240Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Asn Arg Tyr Ile Ala Ser Lys Tyr Ala65 70 75 80TCG GAG GGC ACG GAC CTG CTC CCC GCG ACG GCG TCG GCG GCG AAG CTG 285Ser Glu Gly Thr Asp Leu Leu Pro Ala Thr Ala Ser Ala Ala Lys Leu85 90 95GAG GTG TGG CTG GAG GTG GAG TCG CAC CAC TTC CAC CCG AAC GCG TCG 336Glu Val Trp Leu Glu Val Glu Ser His His Phe His Pro Asn Ala Ser100 105 110CCG CTG GTG TTC CAG CTG CTC GTG AGG CCG CTC CTG GGC GGC GCC CCC 384Pro Leu Val Phe Gln Leu Leu Val Arg Pro Leu Leu Gly Gly Ala Pro115 120 125GAC GCG GCG GTG GTG GAG AAG CAC GCG GAG CAG CTC GCC AAG GTG CTC 432Asp Ala Ala Val Val Glu Lys His Ala Glu Gln Leu Ala Lys Val Leu130 135 140GAC GTG TAC GAG GCG CAC CTG GCC CGC AAC AAG TAC CTC GCC GGG GAC 480Asp Val Tyr Glu Ala His Leu Ala Arg Asn Lys Tyr Leu Ala Gly Asp145 150 155 160GAG TTC ACG CTC GCC GAC GCC AAC CAC GCG TCC TAC CTG CTC TAC CTC 528Glu Phe Thr Leu Ala Asp Ala Asn His Ala Ser Tyr Leu Leu Tyr Leu165 170 175AGC AAG ACC CCC AAG GCC GGG CTC GTC GCC GCC CGC CCC CAC GTC AAG576Ser Lys Thr Pro Lys Ala Gly Leu Val Ala Ala Arg Pro His Val Lys180 185 190GCC TGG TGG GAG GCC ATC GCC GCC CGC CCC GCG TTC CAG AAG ACC GTC 624Ala Trp Trp Glu Ala Ile Ala Ala Arg Pro Ala Phe Gln Lys Thr Val195 200 205GCC GCC ATC CCC TTG CCC CCG CCG CCC TCC TCC TCG GCT TGA 666Ala Ala Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ala210 215220(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度221个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑构建物线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Pro Leu Lys Leu Tyr Gly Met Pro Leu Ser Pro Asn Val Val1 5 10 15Arg Val Ala Thr Val Leu Asn Glu Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ile Val20 25 30Pro Val Asp Leu Thr Thr Gly Ala His Lys Gln Pro Asp Phe Leu Ala35 40 45Leu Asn Pro Phe Gly Gln Ile Pro Ala Leu Val Asp Gly Asp Glu Val50 55 60Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Asn Arg Tyr Ile Ala Ser Lys Tyr Ala65 70 75 80Ser Glu Gly Thr Asp Leu Leu Pro Ala Thr Ala Ser Ala Ala Lys Leu85 90 95Glu Val Trp Leu Glu Val Glu Ser His His Phe His Pro Asn Ala Ser100 105 110Pro Leu Val Phe Gln Leu Leu Val Arg Pro Leu Leu Gly Gly Ala Pro115 120 125Asp Ala Ala Val Val Glu Lys His Ala Glu Gln Leu Ala Lys Val Leu130 135 140Asp Val Tyr Glu Ala His Leu Ala Arg Asn Lys Tyr Leu Ala Gly Asp145 150 155 160Glu Phe Thr Leu Ala Asp Ala Asn His Ala Ser Tyr Leu Leu Tyr Leu165 170 175Ser Lys Thr Pro Lys Ala Gly Leu Val Ala Ala Arg Pro His Val Lys180 185 190Ala Trp Trp Glu Ala Ile Ala Ala Arg Pro Ala Phe Gln Lys Thr Val195 200 205Ala Ala Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ala210 215 220(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓扑构建物线性(ii)分子类型cDNA(iii)假定无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO3AGCGCATATG GCGGCTCTGA AGCTGTACGG GAT(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓扑构建物线性(ii)分子类型cDNA(iii)假定无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO4GACGGATCCT CAAGCCGAGG AGGAGGGCGG
权利要求
1.编码SEQ ID NO2中显示的蛋白质谷胱甘肽S-转移酶III c(GST III c)或由此衍生的蛋白质序列的DNA(脱氧核糖核酸)(GSTIII c DNA)。
2.根据权利要求1的DNA，它具有显示在SEQ ID NO1中的序列或由此衍生的序列。
3.根据权利要求1的DNA，它具有存在于载体质粒pET3a-GSTIII c上的GST III c DNA的序列或由此衍生的序列。
4.根据权利要求1至3的DNA，它呈DNA双链的形式，该双链含有根据权利要求1至3的DNA以及与之互补的一个DNA链。
5.根据权利要求1至4的DNA，其中在其编码序列的5’末端的上游插入一个在植物体中有效的启动子。
6.根据权利要求5的DNA，其中将CaMV 35S启动子或由CaMV35S增强子与CaMV 35S启动子组成的CaMV 35S双启动子作为启动子。
7.根据权利要求5的DNA，它呈现为处于载体质粒pSS-GST III c上的GST III c DNA与CaMV 35S双启动子的构建物。
8.重组的原核生物或真核生物的DNA，它含有根据权利要求1至7的DNA。
9.重组DNA，它存在于植物或植物细胞中并且含有根据权利要求1至7的DNA。
10.载体，它含有根据权利要求1至7的DNA或根据权利要求8和9的重组DNA。
11.载体质粒pET3a-GST III c与pSS-GST III c。
12.转化的微生物，它含有根据权利要求1至7的DNA或根据权利要求8和9的重组DNA。
13.大肠杆菌菌株DS pET3a-GST III c(根据DSM 9677)及其突变体，它仍然具有完成本发明的本质特征。
14.转基因植物(包括这些植物的一部分及其繁殖材料，诸如原生质体，植物细胞，愈伤组织，种子，块茎或插枝等)，在其基因组中除了含有相对应的非转基因植物的DNA外，还含有根据权利要求1至7的DNA。
15.根据权利要求14的转基因植物，它在其基因组中含有根据权利要求6的DNA。
16.根据权利要求14的转基因植物，它在其基因组中含有根据权利要求7的DNA。
17.根据权利要求14至16的转基因植物，它具有谷胱甘肽S-转移酶III c(GST III c)的含量，必要时，呈二聚物的形式。
18.根据权利要求14至17的转基因植物，它与相对应的非转基因植物相比具有对除草剂，特别对杂氧乙酰胺除草剂的提高的抗性。
19.根据权利要求1至7的DNA和/或根据权利要求8和9的重组DNA和/或根据权利要求10和11的载体和/或根据权利要求12和13的转化微生物在生产转基因植物细胞(包括原生质体)和植物(包括植物的一部分和种子)中的应用。
20.生产根据权利要求14的转基因植物的方法，其特征在于(a)将根据权利要求1的DNA和/或根据权利要求8的重组DNA插入到植物细胞(包括原生质体)的基因组中并且，必要时，(b)从转基因植物细胞(包括原生质体)中再生出完整的转化植物并且必要时将其增殖，并且必要时，(c)从以这种方式衍生的亲代或由此衍生的下一代的转基因植物中得到所需要的植物的部分(包括繁殖材料)。
21.根据权利要求14的转基因植物的用途，该植物用于生产繁殖材料以及用于生产含有根据权利要求1的DNA或根据权利要求8的重组DNA的新的植物及其繁殖材料。
22.对应于完全或部分存在于质粒pET3a-GST III c上的GST III cDNA，或对应于完全或部分SEQ ID NO2的DNA的用作探针的用途，它用于检测GST III c DNA的含量或待研究其含量的DNA的组成。
23.编码如显示在SEQ ID NO2中的蛋白GST III c的DNA的用途，它用于生产转基因植物，该植物与相对应的非转基因植物相比具有对除草剂，特别是杂氧乙酰胺除草剂的提高的抗性。
24.具有显示在SEQ ID NO2中的氨基酸序列或由此衍生的序列的蛋白质。
25.根据权利要求24的蛋白质，它呈二聚物的形式。
全文摘要
本发明涉及一种新的脱氧核糖核酸及其在载体、缩体、生物体和植物转化及高除草剂抗性植物育种中的应用。
文档编号C12N15/09GK1169160SQ96191572
公开日1997年12月31日 申请日期1996年1月10日 优先权日1995年1月23日
发明者B·比谢勒, P·里兰默, R·海恩, K·曼, H·-J·里弗, J·E·托姆齐克 申请人:拜尔公司