专利名称：球毛壳菌素a的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新用途，具体为球毛壳菌素A在玉米大斑病、葡萄白腐病和番茄根霉菌果腐病生物防治中的新用途。
背景技术：
植物内生菌能产生多种次生代谢产物，具有促进植物生长、提高宿主植物抗性等生理生态功能，内生菌普遍存在着抗菌活性，由于研究内生菌中抗菌活性物质具有十分重要的理论意义和应用前景，近年来这方面的进展十分迅速，尤其是从内生真菌中筛选到许多具有抗菌活性的化合物。毛壳菌属(Chaetomium)是一个大的真菌类群,主要腐生于植物残体、纸张、土壤、 动物粪便和富含纤维素的废旧物品，以产丰富的降解纤维素的酶和具有生理活性的次生代谢产物而著称，被认为具有潜在生物防治能力的类群，其生物防治机理主要包括产生抗真菌的抗生素、酶类或其他代谢产物，诱导植物产生抗病性及对植物病原真菌重寄生作用等。球毛壳菌素A不仅具有抗肿瘤活性，同时对腐霉菌、灰霉病菌、立枯丝核菌、镰刀菌等植物病原真菌具有优异、广谱的抑菌活性，所以球毛壳菌素A具备良好的发展为新型杀菌剂的开发前景。
发明内容
本发明的目的在于提供球毛壳菌素A的新用途，即在玉米大斑病、葡萄白腐病和番茄根霉菌果腐病生物防治中的新用途。本发明的银杏内生真菌菌株Chaetomium globosum发酵液提取物分离的球毛壳菌素A，其结构式为
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O银杏内生真菌菌株Chaetomium globosum发酵液提取物分离的球毛壳菌素A对玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、葡萄白腐病菌Coniothyrium diplodiella、匍枝根霉Rhizopus stolonifer 具有拮抗活性。银杏内生真菌菌株Chaetomium globosum发酵液提取物分离的球毛壳菌素A在玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病生物防治中的应用。
本发明采用的技术方案为球毛壳菌素A制备I)将球毛壳菌NO. 05接种于真菌液体培养基中发酵7-8天，过滤，发酵液经乙酸乙酯萃取浓缩，收集的菌丝体用甲醇提取，而后再经乙酸乙酯萃取浓缩，发酵液所得浓缩物和菌丝体所得浓缩物合并，即为粗提物；球毛壳菌NO. 05保藏在吉林大学植物科学学院有害生物综合防治实验室，保藏编号为N0. 05，保藏日期为2010年10月2日。2)发酵液乙酸乙酯提取浸膏通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、反相柱层析分离，提取其中的化学成分，常压柱层析采用湿法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂系统，反相柱层析采用加压装置，凝胶柱层析选用SePhadexLH-20，采用甲醇以及甲醇一二氯甲烷洗脱，多次柱层析最后得到化合物球毛壳菌素A。
本发明的有益效果在于银杏内生真菌菌株Chaetomium globosum发酵液提取物分离的球毛壳菌素A对玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、葡萄白腐病菌Coniothyriumdiplodiella、匍枝根霉Rhizopus stolonifer具有拮抗活性,可在玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病生物防治中应用，并用于微生物源农药的制备。
具体实施例方式硅胶柱制备发酵液乙酸乙酯提取浸膏5. 7g与柱层层析硅胶(100-200目)5. 7g通过干法拌样获得上柱样品，柱层层析硅胶(200-300目)100g，用二氯甲烷甲醇=100 0，二氯甲烷甲醇=50 1，二氯甲烷甲醇=30 1，二氯甲烷甲醇=20 1，二氯甲烷甲醇=10 I梯度洗脱，每份洗脱液为150ml，减压蒸馏浓缩，薄板检测，相似合并，得到A-F六个组分，其中C、D、E组分显示较强的抗菌活性，所以在活性追踪下进行连续两次凝胶SePhadexLH-20柱层析，洗脱剂分别为二氯甲烷甲醇=6 4和甲醇，得到活性组分CZ-1，继续硅胶柱层析，以环己烷丙酮=10 I洗脱得到活性组分CZ-1-C，然后继续用反相RP-C18柱层析纯化，以水-甲醇(30%、45%、50%、55% )洗脱得到纯化合物。经鉴定，该化合物为球毛壳菌素A。球毛壳菌素A的抗菌新活性测定准确称取球毛壳菌素A 500ug,并加入IOOul体积的DMS0，震荡充分溶解，最终配置成浓度为5mg/mL的母液；取上述母液2uL于无菌滤纸片上并吹干，在PDA平板中央接种直径为9cm的玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉菌块，距离菌块3cm处点接球毛壳菌NO. 05的发酵液滤纸片，设置将只有DMSO并吹干的滤纸片作为阴性对照，将滴加2uL 5mg/ml潮霉素B并吹干的滤纸片作为阳性对照，28°C恒温培养2-3d，观察有无抑菌带，并测定大小，抑菌带越大，表示抑菌效果越强。以下列公式计算抑制率抑制率(％ )=(对照组病原菌生长半径一处理组病原菌生长半径)/对照组病原菌生长半径XlOO%。测定结果表明球毛壳菌素A对玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌和匍枝根霉的抑制率分别为 71. 62%,72. 50%和 60. 13% 0球毛壳菌素A的生物防治新应用
将5mg/mL的球毛壳菌素A母液与玉米大斑病菌孢子混合,配成孢子悬浮液，使球毛壳菌素 A 的浓度分别稀释到 lug/ml、2ug/ml、5ug/ml、IOug/ml、20ug/ml、50ug/ml,将混合的孢子悬浮液喷在4-5叶期的离体玉米叶片上，将不含球毛壳菌素A的孢子悬浮液和只接种Tween-20水(0. 1% )的玉米72小时后观察玉米的发病情况。测定结果表明接种球毛壳菌素A为lug/ml、2ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml孢子混合悬浮液的玉米叶片病斑面积明显减少；接种球毛壳菌素A为50ug/ml孢子混合悬浮 液的玉米叶片几乎没有病斑。由此可见球毛壳菌素A对玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、葡萄白腐病菌Coniothyrium diplodiella、匍枝根霉Rhizopus stolonifer具有拮抗活性,可在玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病生物防治中应用，并用于微生物源农药的制备。
权利要求
1.一种银杏内生真菌菌株Chaetomium globosum发酵液提取物分离的球毛壳菌素A,其特征在于球毛壳菌素A的结构式为
2.按权利要求I所述的银杏内生真菌菌株Chaetomiumglobosum发酵液提取物分离的球毛壳菌素A,其特征在于对玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、葡萄白腐病菌Coniothyrium diplodiella、匍枝根霉 Rhizopus stolonifer 具有拮抗活性。
3.按权利要求I所述的银杏内生真菌菌株Chaetomiumglobosum发酵液提取物分离的球毛壳菌素A，其特征在于在玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病生物防治中的应用。
全文摘要
球毛壳菌素A的新用途具体涉及球毛壳菌素A在玉米大斑病、葡萄白腐病和番茄根霉菌果腐病生物防治中的新用途，本发明提供的银杏内生真菌菌株发酵液提取物分离的球毛壳菌素A对玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉具有拮抗活性，可在玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病生物防治中应用，并用于微生物源农药的制备。
文档编号A01N43/90GK102754652SQ20121018508
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月6日 优先权日2012年6月6日
发明者张桂珍, 张雅梅, 李想, 潘洪玉, 田野, 秦建春, 程鸿, 莫华文 申请人:吉林大学