杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法，以杨树内生真菌球毛壳为供试菌株，利用捷克八溶剂系统纸色谱方法对该内生菌的抗生物质进行理化性质初步分析;用高效液相色谱法检测分析该菌粗提液的活性成分及对杨树腐烂病菌的抑菌效果;对抗生物质液体培养的主要动力学指标进行分析。为杨树内生菌球毛壳抗生物质的使用提供了理论依据。
【专利说明】杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及球毛壳产生抗生物质检测领域，具体为一种杨树内生菌球毛壳抗生物质的检测方法。
【背景技术】
[0002]毛壳菌通常存在于土壤和有机肥中，是子囊菌中最大的属之一，它可以有效降解纤维素和有机物，并对土壤中的其他微生物产生拮抗作用，因此，毛壳菌成为植物病原菌的生物防治菌并被广泛应用。球毛壳菌(Chaetomium globosum)和螺卷毛壳菌(C.cochl1des)对多种植物病原菌有明显的抑制作用，作用机制主要表现为重寄生和产生
毛壳素(chaetomin )等抗生素。
【发明内容】
[0003]本发明针对以上不足之处，提供了一种杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法，检测结果准确，检测方法简单。
[0004]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法，A、鉴别:将杨树内生菌球毛壳的萃取浓缩液滴在纸层析板上，在捷克八溶剂系统中进行层析试验，测定得到萃取浓缩液活性斑点的Rf值，然后做出纸层析色谱图，所述捷克八溶剂系统(V /V)包括:a、水饱和的正丁醇；b、水饱和的正丁醇，内含2 %对甲苯磺酸；C、正丁醇:乙酸:水(2:1:1) ; e、水饱和的正丁醇，内含2%六氢吡啶；f、以正丁醇饱和的0.5 mol/L、pH 7磷酸缓冲液；g、正丁醇饱和的水，内含2%对甲苯磺酸；h、苯:甲醇(4:1)，本系统所用滤纸先用0.5 mol/L、pH 7磷酸缓冲液处理后晾干；8)甲醇:水(3:1)，水内含3% NaCl ；
B、检测:采用pH纸层析和高效液相色谱两种检测方法:
A、pH纸层析检测:取新华I号层析滤纸，将所述新华I号层析滤纸分别用pH2.2，3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的缓冲溶液处理干燥，将球毛壳抑菌活性物质点于距离滤纸底端0.3-1 cm处，点样量为3-8yL，在二氯甲烷和甲醇的展层溶剂中进行上行展层，展层距离为10-20cm，重复3次；室温展层结束后，取出滤纸条在无菌操作台上晾干，然后采用平板生物显影法测其抑菌活性物质的展层距离，根据抑菌圈的位置确定活性物质在不同溶剂中的展层距离，做出纸层析色谱图；
B、高效液相色谱检测将球毛壳抑菌物质用少量甲醇溶解，经微孔有机滤膜过滤后，用高效液相色谱仪Agilent 1200分析,高效液相色谱的条件为:色谱柱ZorbaxeclipseXDB-C18,150 mm X 4.6 mm，流动相为甲醇:水的体积比为65: 35，等度洗脱，流速0.5_2mL/min;进样量10-30 μ L;柱温为25 V ;紫外检测波长为254 nm。
[0005]优选的:采用pH纸层析和高效液相色谱两种检测方法:
A、pH纸层析检测:取新华I号层析滤纸，将所述新华I号层析滤纸分别用pH 2.2，
3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的缓冲溶液处理干燥，将球毛壳抑菌活性物质点于距离滤纸底端0.5cm处，点样量为5 μ L，在二氯甲烷和甲醇的展层溶剂中进行上行展层，展层距离为15 cm，重复3次；室温展层结束后，取出滤纸条在无菌操作台上晾干，然后采用平板生物显影法测其抑菌活性物质的展层距离，根据抑菌圈的位置确定活性物质在不同溶剂中的展层距离，做出纸层析色谱图；
B、高效液相色谱检测:将球毛壳抑菌物质用少量甲醇溶解，经微孔有机滤膜过滤后，用高效液相色谱仪Agilent 1200分析,高效液相色谱的条件为:色谱柱ZorbaxeclipseXDB-C18，150 mm X 4.6 mm，流动相为甲醇:水的体积比为65: 35，等度洗脱，流速I mL/min;进样量20 UL;柱温为25 V ;紫外检测波长为254 nm。
[0006]所述微孔有机滤膜孔径为0.22 μ m。
[0007]本发明的有益效果是:检测方法简单，检测结果准确，为以后杨树内生菌球毛壳抗生物质的应用提供了有利的理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1所示是杨树内生菌球毛壳抗生物质在捷克八溶剂系统下的纸层析色谱图；
图2所示是纸层析色谱图；
图3所示是高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0009]实施例1
一种杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法，(I)鉴别:将杨树内生菌球毛壳的萃取浓缩液滴在纸层析板上，在捷克八溶剂系统中进行层析试验，捷克八溶剂系统(V /V)包括:a、水饱和的正丁醇；b、水饱和的正丁醇，内含2 %对甲苯磺酸；C、正丁醇:乙酸:水(2:1:1); e、水饱和的正丁醇，内含2%六氢吡啶；f、以正丁醇饱和的0.5 mol/L、pH 7磷酸缓冲液；g、正丁醇饱和的水，内含2%对甲苯磺酸；h、苯:甲醇(4: 1)，本系统所用滤纸先用0.5 mol/L、pH 7磷酸缓冲液处理后晾干；8)甲醇:水(3: 1)，水内含3% NaCl ;测定得到萃取浓缩液活性斑点的Rf值，然后做出纸层析色谱图，如图1所示:活性物质在第1，2，3，4，7，8溶剂系统中的Rf值较大，说明球毛壳抗生物质是一种极性较弱的活性物质。在第5，6种溶剂系统中的Rf约为O。成为倒船帆形。参照经典的各类抗生素纸层析图谱，这个图谱特征与第5类(非水溶性I型抗生素)抗生素的纸层析色谱图特征相近，故把该抗生物质初步归为金色抗霉素类抗生素。
[0010](2)检测:A、pH纸层析检测:取新华I号层析滤纸，将所述新华I号层析滤纸分别用pH 2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0，10.0的缓冲溶液处理干燥，将球毛壳抑菌活性物质点于距离滤纸底端0.5cm处，点样量为5 μ L，在二氯甲烷和甲醇的展层溶剂中进行上行展层，展层距离为15 cm，重复3次；室温展层结束后，取出滤纸条在无菌操作台上晾干，然后采用平板生物显影法测其抑菌活性物质的展层距离，根据抑菌圈的位置确定活性物质在不同溶剂中的展层距离，做出纸层析色谱图如图2所示，球毛壳抗生物质的Rf值显示一定规律性的变化不论pH值有何变化，其Rf值始终变化不大，故与原点呈大致平行线，根据上述图形特征可把球毛壳抗生物质归为中性抗生素类。但相对来看，球毛壳抗生物质在pH 6.0时Rf最大,考虑pH对抗菌物质的影响,可选择pH 6.0作为萃取的最适pH。
[0011]B、高效液相色谱检测:将球毛壳抑菌物质用少量甲醇溶解，经孔径为0.22 μ m的微孔有机滤膜过滤后，用高效液相色谱仪Agilent 1200分析，高效液相色谱的条件为:色谱柱Zorbaxeclipse XDB-C18,150 mm X 4.6 mm，流动相为甲醇:水的体积比为65: 35，等度洗脱，流速I mL/min ;进样量20 yL;柱温为25 °C ;紫外检测波长为254 nm ;球毛壳抑菌物质粗提液的高效液相色谱分析结果如图3显示，分别在1.585，2.512，7.566，
11.600 min处出现4个显著的吸收峰。
[0012]实施例2
一种杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法，(I)鉴别:将杨树内生菌球毛壳的萃取浓缩液滴在纸层析板上，在捷克八溶剂系统中进行层析试验，捷克八溶剂系统(V /V)包括:a、水饱和的正丁醇；b、水饱和的正丁醇，内含2 %对甲苯磺酸；C、正丁醇:乙酸:水(2:1:1); e、水饱和的正丁醇，内含2%六氢吡啶；f、以正丁醇饱和的0.5 mol/L、pH 7磷酸缓冲液；g、正丁醇饱和的水，内含2%对甲苯磺酸；h、苯:甲醇(4: 1)，本系统所用滤纸先用0.5 mol/L、pH 7磷酸缓冲液处理后晾干；8)甲醇:水(3: 1)，水内含3% NaCl ;测定得到萃取浓缩液活性斑点的Rf值，然后做出纸层析色谱图，如图1所示:活性物质在第1，2，3，4，7，8溶剂系统中的Rf值较大，说明球毛壳抗生物质是一种极性较弱的活性物质。在第5，6种溶剂系统中的Rf约为O。成为倒船帆形。参照经典的各类抗生素纸层析图谱，这个图谱特征与第5类(非水溶性I型抗生素)抗生素的纸层析色谱图特征相近，故把该抗生物质初步归为金色抗霉素类抗生素。
[0013](2)检测:A、pH纸层析检测:取新华I号层析滤纸，将所述新华I号层析滤纸分别用pH 2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0，10.0的缓冲溶液处理干燥，将球毛壳抑菌活性物质点于距离滤纸底端0.3cm处，点样量为3 μ L，在二氯甲烷和甲醇的展层溶剂中进行上行展层，展层距离为150cm，重复3次；室温展层结束后，取出滤纸条在无菌操作台上晾干，然后采用平板生物显影法测其抑菌活性物质的展层距离，根据抑菌圈的位置确定活性物质在不同溶剂中的展层距离，做出纸层析色谱图如图2所示，球毛壳抗生物质的Rf值显示一定规律性的变化不论pH值有何变化，其Rf值始终变化不大，故与原点呈大致平行线，根据上述图形特征可把球毛壳抗生物质归为中性抗生素类。但相对来看，球毛壳抗生物质在pH 6.0时Rf最大,考虑pH对抗菌物质的影响,可选择pH 6.0作为萃取的最适pH。
[0014]B、高效液相色谱检测:将球毛壳抑菌物质用少量甲醇溶解，经孔径为0.22 μ m的微孔有机滤膜过滤后，用高效液相色谱仪Agilent 1200分析，高效液相色谱的条件为:色谱柱Zorbaxeclipse XDB-C18,150 mm X 4.6 mm，流动相为甲醇:水的体积比为65: 35，等度洗脱，流速0.5 mL/min ;进样量1yL;柱温为25 V ;紫外检测波长为254 nm ；球毛壳抑菌物质粗提液的高效液相色谱分析结果如图3显示，分别在1.585,2.512,7.566,11.600 min处出现4个显著的吸收峰。
[0015]实施例3
一种杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法，(I)鉴别:将杨树内生菌球毛壳的萃取浓缩液滴在纸层析板上，在捷克八溶剂系统中进行层析试验，捷克八溶剂系统(V /V)包括:a、水饱和的正丁醇；b、水饱和的正丁醇，内含2 %对甲苯磺酸；C、正丁醇:乙酸:水(2:1:1); e、水饱和的正丁醇，内含2%六氢吡啶；f、以正丁醇饱和的0.5 mol/L、pH 7磷酸缓冲液；g、正丁醇饱和的水，内含2%对甲苯磺酸；h、苯:甲醇(4: 1)，本系统所用滤纸先用0.5 mol/L、pH 7磷酸缓冲液处理后晾干；8)甲醇:水(3: 1)，水内含3% NaCl ;测定得到萃取浓缩液活性斑点的Rf值，然后做出纸层析色谱图，如图1所示:活性物质在第1，2，3，4，7，8溶剂系统中的Rf值较大，说明球毛壳抗生物质是一种极性较弱的活性物质。在第5，6种溶剂系统中的Rf约为O。成为倒船帆形。参照经典的各类抗生素纸层析图谱，这个图谱特征与第5类(非水溶性I型抗生素)抗生素的纸层析色谱图特征相近，故把该抗生物质初步归为金色抗霉素类抗生素。
[0016](2)检测:A、pH纸层析检测:取新华I号层析滤纸，将所述新华I号层析滤纸分别用pH 2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0，10.0的缓冲溶液处理干燥，将球毛壳抑菌活性物质点于距离滤纸底端Icm处，点样量为8 μ L，在二氯甲烷和甲醇的展层溶剂中进行上行展层，展层距离为20 cm，重复3次；室温展层结束后，取出滤纸条在无菌操作台上晾干，然后采用平板生物显影法测其抑菌活性物质的展层距离，根据抑菌圈的位置确定活性物质在不同溶剂中的展层距离，做出纸层析色谱图如图2所示，球毛壳抗生物质的Rf值显示一定规律性的变化不论pH值有何变化，其Rf值始终变化不大，故与原点呈大致平行线，根据上述图形特征可把球毛壳抗生物质归为中性抗生素类。但相对来看，球毛壳抗生物质在pH 6.0时Rf最大,考虑pH对抗菌物质的影响,可选择pH 6.0作为萃取的最适pH。
[0017]B、高效液相色谱检测:将球毛壳抑菌物质用少量甲醇溶解，经孔径为0.22 μ m的微孔有机滤膜过滤后，用高效液相色谱仪Agilent 1200分析，高效液相色谱的条件为:色谱柱Zorbaxeclipse XDB-C18,150 mm X 4.6 mm，流动相为甲醇:水的体积比为65: 35，等度洗脱，流速I mL/min ;进样量30 μ L;柱温为25 V ;紫外检测波长为254 nm ;球毛壳抑菌物质粗提液的高效液相色谱分析结果如图3显示，分别在1.585，2.512，7.566，
11.600 min处出现4个显著的吸收峰。
【权利要求】
1.一种杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法，其特征在于: 包含有如下步骤: A、鉴别:将杨树内生菌球毛壳的萃取浓缩液滴在纸层析板上，在捷克八溶剂系统中进行层析试验，测定得到萃取浓缩液活性斑点的Rf值，然后做出纸层析色谱图，所述捷克八溶剂系统(V /V)包括:a、水饱和的正丁醇；b、水饱和的正丁醇，内含2 %对甲苯磺酸；C、正丁醇:乙酸:水体积比为:2:1:1; e、水饱和的正丁醇，内含2%六氢吡啶；f、以正丁醇饱和的0.5 mol/L、pH7磷酸缓冲液；g、正丁醇饱和的水，内含2%对甲苯磺酸；h、苯:甲醇体积比为4:1，本系统所用滤纸先用0.5 mol/L、pH 7磷酸缓冲液处理后晾干；8)甲醇:水体积比为3: 1，水内含3% NaCl ； B、检测:采用pH纸层析和高效液相色谱两种检测方法: A、pH纸层析检测:取新华I号层析滤纸，将所述新华I号层析滤纸分别用pH2.2，3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的缓冲溶液处理干燥，将球毛壳抑菌活性物质点于距离滤纸底端0.3-1 cm处，点样量为3-8yL，在二氯甲烷和甲醇的展层溶剂中进行上行展层，展层距离为10-20cm，重复3次；室温展层结束后，取出滤纸条在无菌操作台上晾干，然后采用平板生物显影法测其抑菌活性物质的展层距离，根据抑菌圈的位置确定活性物质在不同溶剂中的展层距离，做出纸层析色谱图； B、高效液相色谱检测将球毛壳抑菌物质用少量甲醇溶解，经微孔有机滤膜过滤后，用高效液相色谱仪Agilent 1200分析,高效液相色谱的条件为:色谱柱ZorbaxeclipseXDB-C18,150 mm X 4.6 mm，流动相为甲醇:水的体积比为65: 35，等度洗脱，流速0.5_2mL/min;进样量10-30 μ L;柱温为25 V ;紫外检测波长为254 nm。
2.根据权利要求1所述的杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法，其特征在于:采用PH纸层析和高效液相色谱两种检测方法: A、pH纸层析检测:取新华I号层析滤纸，将所述新华I号层析滤纸分别用PH2.2，3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的缓冲溶液处理干燥，将球毛壳抑菌活性物质点于距离滤纸底端0.5cm处，点样量为5 μ L，在二氯甲烷和甲醇的展层溶剂中进行上行展层，展层距离为15 cm，重复3次；室温展层结束后，取出滤纸条在无菌操作台上晾干，然后采用平板生物显影法测其抑菌活性物质的展层距离，根据抑菌圈的位置确定活性物质在不同溶剂中的展层距离，做出纸层析色谱图； B、高效液相色谱检测将球毛壳抑菌物质用少量甲醇溶解，经微孔有机滤膜过滤后，用高效液相色谱仪Agilent 1200分析,高效液相色谱的条件为:色谱柱ZorbaxeclipseXDB-C18，150 mm X 4.6 mm，流动相为甲醇:水的体积比为65: 35，等度洗脱，流速I mL/min ;进样量20 UL;柱温为25 V ;紫外检测波长为254 nm。
3.根据权利要求1所述的杨树内生菌球毛壳抗生物质的鉴别与检测方法，其特征在于:所述微孔有机滤膜孔径为0.22 μ m。
【文档编号】G01N30/06GK104345109SQ201310324448
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】张厚东 申请人:张厚东